利用离体叶片实验简化马铃薯在咀嚼式昆虫烟草天蛾（Manduca sexta）侵染期间的基因表达研究

本方案采用简化的流程来检测植物基因在昆虫取食胁迫下的表达变化。通过在培养皿中使用离体叶片，可在相对较短的侵染期内更方便地施加和监测昆虫，从而获得可重复的基因表达数据。该方案可适用于多种植物与昆虫相互作用的研究。

如果考虑来自全植株系统的基线观察结果，昆虫取食行为的不可预测性可能带来挑战。因此，稳定供应发育阶段合适的幼虫和健康的植株是实验成功的关键。

了解健康植物和昆虫应有的外观与行为对于获得最佳实验结果至关重要，特别是对于刚进入该研究领域的研究人员而言。与我一同演示该实验流程的是Frances Perez，她是果蔬遗传改良实验室的一名分子生物学家。为准备节段繁殖的组织培养马铃薯植株，首先需获取由外植体材料培育而成的Kennebec小苗，其应至少具有三到四个节段。

使用无菌刀片去除叶片，将枝条从靠近主茎处切下，每片叶保留约两毫米的枝条组织。在每个节的上下方约两毫米处进行切割，以从茎上取下节段，并将节段插入选有节段转移培养基的无菌组织培养容器中，枝条朝上放置。随后将节段转移到植物组织培养室中，在24°C、16小时光照和8小时黑暗的光周期条件下培养两到三周。

为准备昆虫取食，获取所需龄期的烟草天蛾（M. sexta）幼虫，并根据幼虫大小将每条幼虫转移至适当 containment vessel 的各个孔中。为每个收获时间点制作放置模板，使用五个坚固的托盘，每个托盘可容纳一组六个大小合适的培养皿，培养皿内衬白色纸张。用相应尺寸的培养皿在每个托盘的纸张上描出六组圆形，并将其中一组标记为对照 A、B 和 C，另一组标记为虫害 A、B 和 C。然后在每个放置模板上标注相应的收获时间。

接下来，根据放置模板中的每个圆圈，为每个1.7毫升微量离心管贴上标签，以准确标识扰动处理、植物重复字母及采收时间点。所有离心管标记完成后，每个模板对应的培养皿中放入一张无菌滤纸片，并用无菌水润湿滤纸片，注意避免液体在培养皿中积聚。然后将每个培养皿放入放置模板的相应圆圈内，并在每个放置模板旁放置三株相同年龄和相对大小的马铃薯植株。

为启动虫害处理，使用无菌剪刀从每株植物上取下顶部两片大小相近的叶片，并尽快将其中一片放入对照组培养皿中，另一片放入虫害处理组培养皿中。所有叶片放置完毕后，尽快使用软头镊子将至少一条幼虫转移至每个虫害处理组培养皿中，并设置所需虫害处理时间的计时器。观察幼虫取食情况，确保所有幼虫均在进食，必要时更换未进食的幼虫。

在侵染时间结束时，将所有叶片上的幼虫全部移除，并开始计时以进行采样。在每个采样时间点结束时，将每片叶片转移至对应的离心管中，并立即将离心管放入液氮中，使叶片样品迅速冷冻，随后于-80°C保存，直至进行RNA提取。健康且发育阶段准确的幼虫在放置于叶片表面后应立即开始取食，且在整个侵染期间应保持相对稳定的取食行为。

这片叶子底部的幼虫未摄取任何植物组织，属于侵染失败的实例。这些叶片取自两周大的节段繁殖组织培养植株，不同龄期幼虫对其取食速率和取食方式存在差异。根据这些结果，选择四龄幼虫进一步评估其对更为成熟的土培马铃薯植株叶片造成的损害，此类植株更接近田间生长的马铃薯植株。

在这些基因表达研究中，鉴定出两种新的C2H2锌指转录因子，它们对烟草天蛾（M. sexta）取食具有强烈响应，该结果支持使用离体叶片进行虫害侵染实验。请注意使用年龄和大小相匹配的叶片，并为每次实验正确选择幼虫的发育阶段，因为一致性可带来更可重复的实验数据。叶片组织可用于检测胁迫诱导的活性氧和茉莉酸激素衍生物。

也可以对叶片组织进行全转录组、蛋白质组或微生物组研究。