高压冷冻、微波辅助对比度增强及最小树脂包埋的生物样本制备用于体积成像

该样品制备技术旨在将超微结构保存的最佳质量与聚焦离子束扫描电子显微镜成像模式所需的最适对比度相结合。本方案特别适用于需要通过高压冷冻实现可靠超微结构保存，但在冷冻置换过程中进行三维成像时对比度不足的样品。对于最小树脂包埋而言，至关重要的是尽可能去除树脂，以便后续在聚焦离子束扫描电子显微镜中实现准确定位。

首先，使用移液器在切割垫上滴加一滴20% PVP PBS溶液。将解剖出的胫神经浸入液滴中。用手术刀切割出两毫米长度的样本。

使用精细镊子将样品放入深度为 0.2 毫米的 A 型金属样品载片中。将载片转移至样品盒的中板。将涂有十六烷的 B 型载片置于顶部作为盖片。

通过降低卡匣的上半部分来关闭组件。在高压冷冻仪的装样站中闭合三件式卡匣。按下运行按钮，并根据制造商的操作说明进行操作。

将样品载片放入含有两毫升冷冻的0.1%单宁酸丙酮溶液的冷冻小瓶中，置于液氮浴中，然后盖上瓶盖。将冷冻小瓶放入设定为负90摄氏度的冷冻置换仪中。启动程序，使样品在此条件下保持100小时。

在冷冻置换仪中，用2毫升丙酮对样品进行三次洗涤，每次30分钟。将含0.1%醋酸铀酰的2%四氧化锇加入冷冻置换仪中预冷，并加入样品中，在零下90摄氏度条件下持续染色7小时。当冷冻置换仪的程序温度升至零下20摄氏度时，将样品在此温度下继续保持16小时。

当温度升至 4 摄氏度时，弃去管中的液体并加入纯丙酮。从冷冻置换仪中取出冷冻管。在冷冻前和渗透处理后的样品操作至关重要，因为样品可能会受到严重损伤。

在通风橱中，使用精细镊子将金属载具从冻存管中取出，并将载具上的样品转移至盛有丙酮的150毫米深的表面皿中浸没。用精细镊子将样品转移至装有丙酮的2毫升反应管中。将微波炉设置为250瓦，持续40秒，启动微波炉对样品进行清洗，并重复此步骤四次。

用移液器将1毫升1%硫代碳酰肼溶液加入反应管中，并放入微波炉。开启真空功能，运行2分钟，关闭2分钟，重复进行，总时长为14分钟，功率设为150瓦。启动微波炉。

按照前述方法用丙酮洗涤样品四次。用移液器将一毫升2%四氧化锇溶液加入反应管中。将样品放入微波炉中，并采用与硫代碳酰肼处理相同的微波设置。

按照前述方法用丙酮洗涤样品四次。用移液器将1毫升25%树脂丙酮溶液加入反应管中，并放入微波炉。开启真空功能3分钟，并将功率设为250瓦。

启动微波炉。使用牙签将坐骨神经从反应管中取出，并将其放置在一片塑料膜上。将卤素灯靠近样品，以加热树脂。

用牙签在塑料膜上轻轻推动样品，直至检测不到残留的树脂为止。将带有样品的塑料膜放入烘箱中，设置温度为60摄氏度，使样品聚合至少48小时。使用剃刀片将聚合后的样品连同塑料膜一起切割成适合扫描电镜样品台的大小。

使用牙签将导电银胶涂抹在扫描电镜样品台（SEM stubs）上，并将切割好的样品粘附于其上。然后在样品周围添加树脂。将扫描电镜样品台放入烘箱中，在60°C下聚合至少4小时或过夜。

聚合完成后，将SEM载物台放入溅射镀膜仪中。将溅射电流设置为35毫安，施加10纳米厚的金涂层，或镀膜1分钟。镀膜后，将SEM载物台放入聚焦离子束扫描电子显微镜中。

本研究采用了一种改进的方案，对小鼠坐骨神经及秀丽隐杆线虫（C.elegans）进行处理，以展示如何实现最佳的结构保存和对比度，从而利用聚焦离子束扫描电子显微镜进行三维体成像。标准方案常存在膜结构对比度不足的问题，而改进方案则可提供显著增强的膜对比度。采用改进方案与标准方案处理的秀丽隐杆线虫横截面图像显示出明显差异。

除了胫神经的横截面图像外，与标准方案相比，优化后的方案有助于显示更强的膜对比度。经过后期处理后，使用图像处理和建模软件 IMOD 对电子显微镜数据进行可视化。蓝色高亮区域显示的是已分割的轴突。

红色高亮区域显示的是雷马克束。黄色和橙色高亮区域显示的是髓鞘。而青绿色高亮区域显示的是线粒体。

虚拟切片和三维模型可展示精细的组织结构，有助于理解其功能。其他体积扫描电镜技术也可采用，例如连续块面扫描电镜和阵列断层成像。本方案也可用于透射电镜及其他样本类型，如中枢神经系统样本。

四氧化锇、硫代碳酰肼和醋酸铀酰均为有毒化学品，应谨慎使用。树脂也有害，需小心操作。整个实验流程中应穿戴手套和实验服等个人防护装备。