直接注射慢病毒载体突出大鼠脊髓中的多种运动途径

病毒载体可以将遗传物质引入细胞，以补偿有缺陷的基因，提高重要的生长蛋白，或制造可以追踪神经回路的标记物。由于与生俱来的生物学障碍，将病毒载体引入神经系统是具有挑战性的。直接注射到脊髓组织中绕过这些屏障，允许进入细胞体或突触。

正确定位 L1 到 L4 脊髓水平可能很困难。使用地标来验证目标并记住这些段线到 T11 到 T13 椎骨非常重要。在手术当天，将喷油器插入微泵，然后将微泵放入具有更薄度的微操纵器中。

使用带柔性针头的注射器小心地将彩色染料装入其中一个玻璃针中，并将玻璃针插入喷油器中。然后确认针头已正确播种到垫圈中，喷油器盖拧紧，并且钢喷油器针头的延伸距离约为玻璃针长度的四分之三。在开始手术之前，解冻至少一微升，加上从冷冻室注射少量额外病毒，并确认麻醉大鼠的针头趾缺乏反应。

沿着后侧中线从臀部剃到动物肩骨的劣质角度，拉紧皮肤，进行更轻松、更精确的剃须，并连续用 5% 碘和 70% 乙醇磨砂对裸露的皮肤进行消毒。将眼科软膏涂抹在两只眼睛上。然后将动物放在无菌布上，将纱布放在膀胱下方以收集尿液。

要识别皮肤切口的部位，请轻轻按压最后一根肋骨的手指以定位 L1 椎骨。使用这个椎骨作为一个里程碑，并举行皮肤紧绷的轻轻蔓延，同时用手术刀用力按，使用数字10手术刀片，使三到四厘米的皮肤切口结束只是低于L1暴露肌肉。使用钳子和剪刀来感受旋转过程。

做小的滚切，让空间牢牢地抓住与大鼠牙钳的上部过程。并尽可能接近流程，进行两次长而深的切割。固定横向肌肉到位后，清除周围的肌肉，以确定其头部的形状。

然后可视化旋转过程头部的形状，以识别拉明切除术位点。T11 和连接 T12 和 T13 过程将是拉明切除术的站点。一旦目标区域被正确识别，轻轻展开椎骨以露出椎间韧带，并使用旋颈小咬椎的旋转过程和椎背的侧部。

清除中线外骨骼，以便观察中线血管，留下一个窗口，清楚地显示脊髓组织，并且没有碎屑。然后将稳定钳紧到旋转过程，将胸腺和胸膜固定到拉明切除术窗口，将动物固定在脊柱架中。提高动物的腹部，以抵消呼吸运动的影响。

要将病毒加载到喷油器中，将解冻库存的大约五微升移液器插入一块 Parafilm 上，并放置玻璃针，使尖端位于液滴内。使用微泵以 20 到 100 纳米升/秒的速度提取多达 4 微升的病毒，并设置控制器注射，然后从针尖释放少量病毒，以确保病毒不会被阻塞。用实验室擦拭清除任何多余的病毒，并放置微操纵器，使可见比额。

将针头放在脊髓的中线，并使用微操纵器上的测光量表横向引导针头 0.8 毫米。然后将针头降到脊柱和弦，直到它缩进，但不是穿刺，杜拉，并使用快速扭曲运动刺穿杜拉与针，直到针尖已下降到1.5毫米的深度。一旦针头就位，编程喷油器以每分钟400纳米光的速度传递病毒，并通过观察染料前部的进度来确认病毒正在进入脊髓和弦。

注射完成后，让针头在脊髓中休息两到五分钟，以方便病毒的传播，然后慢慢提取针头，以便定位到下一个注射部位。最后一次注射后，将动物从脊柱架上取出，以便取出用于传播横向肌肉的任何装置。然后用 4 . 0 缝合线关闭肌肉，用 9 毫米伤口夹固定皮肤。

成功注射四周后，在侧胸脊髓的灰质内的神经元中观察到显著的GP表达，对注射进行刺激。在白质中，在轴线中的轴子中观察到GSP表达，特别是在自体轴体的典型区域。灰质神经元的放大率越高，就会发现神经元体和树突中典型信号表达的例子。

神经元中的GP表达也可以在脑干核中观察到，例如在浮核内柱形成。成功脊髓注射程序的关键因素是正确的椎骨靶向，并确保病毒进入组织如果在手术前进行肩骨脊髓损伤，直接注射可用于追踪在损伤周围重新建立连接的神经元。