一种高通量志贺氏菌特异性杀菌试验
2019年2月27日
在这里, 我们提出了一个方案来测量血清中抗体的志贺酸酯活性。血清与细菌和外源补体混合, 孵育, 反应混合物被镀在琼脂板上。活细菌形成菌落, 这些菌落被计数, 使用自动菌落计数器, 并用于确定杀菌滴度。
Shigella研究领域目前缺乏明确的分析，以检查免疫或感染产生的抗体的功能作用。此检测代表了一种定义明确的方法来鉴定这些免疫反应并测量Shigella特异性抗体的杀菌活性。此测定的主要优点是，它允许对多个样本进行高吞吐量分析。
该协议中使用的技术大大减少了动手时间和整体检测时间，以测量抗体和血清样本的直接细菌杀戮。首先，在56摄氏度的温水浴中孵育样品30分钟，加热并激活测试样品。获取检测板和20微升检测缓冲液，将1至12行的甲型至G.将20微升的检测缓冲液插入每个检测样品的H.Load 30微升列中，并复制到检测板的H行。
要开始对测试样品进行三倍连续稀释，请使用多通道移液器从 3H 到 12H 的井中去除 10 微升。将样品转移到G行的相应孔中，上下移液器8至10次，将样品混合在一起。然后，从这些井中去除10微升。
转移到相应的井在行F和移液器上下8至10次混合。通过A排继续这种串行稀释过程，在A行中混合油井后，从井3A到12A中去除并丢弃10微升，使所有油井的最终体积为20微升。取回一小瓶冷冻目标细菌，并在室温下解冻。
然后，在20毫升的测定缓冲液中稀释细菌。根据预定的最佳稀释系数。使用多通道移液器，在检测板的每个井中加入10微升稀释细菌。
取回一瓶冷冻小兔赞美和一瓶冷冻热激活的BRC。使用冷水将小瓶解冻至室温。然后，将100微升热激活BRC与400微升检测缓冲液混合。
将 20% 热激活 BRC 溶液的 50 微升添加到第一列的所有孔中。将一毫升原生BRC与四毫升的测定缓冲液混合。在第二列至第十二列的所有井中加入50微升这种20%混合物。
将板摇床放在一个板摇床上 10 到 15 秒，轻轻混合检测板。在微生物培养箱中孵育检测板两小时。同时，从两个 LB Agar 板上取下盖子，将板面朝上放在生物安全柜中 40 至 60 分钟干燥。
孵育完成后，将检测板转移到湿冰中，孵育10至20分钟，以停止反应。使用十二通道移液器，将 H 排的孔和反应混合物的 10 微升孔混合到 LBA 板的底部。立即倾斜板，让斑点运行约1.5至2厘米。
对行 G、F 和 E 重复此过程，在上一行上方发现它们。在室温下孵育LBA板，直到溶液被吸收到LBA板中。然后，将盖子放在盘子上，倒置到微生物培养箱中孵化过夜。
第二天，在55摄氏度下加入25毫升覆盖阿加，每个毫升TTC含有100微克，每个LBA板含有0.1%的亚兹钠。在37摄氏度下孵育两小时，让幸存的细菌形成红色。然后，使用数码相机拍摄板。
将图像传输到计算机，并使用 NIST 的集成殖民地枚举软件分析文本协议中概述的图像。代表LBA板表明，颜色发展后，夜间孵化和叠加添加，所有幸存的菌落是可见的红色。细菌杀伤是清楚看到所有样品测试前三个稀释。
细菌杀戮的减少被视为样品被进一步稀释在板和血清浓度较低。然后使用 NIST 软件执行微殖民计数。然后计算每个样品每次稀释的平均 CFU 计数，以及 50% 的杀杀值。
然后，这 50% 的杀菌值应用于每个血清稀释的平均 CU，以确定计算 SBA KI 所需的值。该协议依赖于在LB电镀上进行一致和均匀的细菌电镀。良好的点电镀和倾斜技术将允许离散微克隆的生长和准确的菌落计数。此技术使用活的毒性石盖拉，需要适当的无菌技术和 PPE，以确保细菌按照 BSL 2 程序得到安全处理。
概述
本文介绍了一种测量血清中抗体的志贺菌杀灭活性的协议。该方法允许高通量分析，并在评估志贺菌特异性抗体的杀菌活性时减少动手时间。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 微生物学
- 血清学
背景
- 志贺菌研究领域缺乏用于检查抗体反应的定义测定。
- 该协议对免疫反应进行定性并测量杀菌活性。
- 它能够有效分析多个样本。
- 在BSL 2条件下使用活的致病志贺菌。
研究目的
- 建立一个可靠的测量志贺菌杀灭活性的测定方法。
- 便于评估免疫化或感染的免疫反应。
- 提供一种能够最大限度地减少动手时间并最大化通量的方法。
使用的方法
- 血清样本的热激活。
- 测试样品的三倍连续稀释。
- 将稀释的细菌和补体接种到测定板上。
- 孵化后使用自动化软件进行菌落计数。
主要结果
- 成功测量了不同稀释度下的细菌杀灭活性。
- 孵化后在红色中清晰可见存活的菌落。
- 定量计数CFU并确定50%杀菌值。
- 证明了测定方法的可靠性和效率。
结论
- 该协议提供了一种评估抗体功能的标准化方法。
- 它增强了对志贺菌免疫反应的理解。
- 未来应用可能包括疫苗有效性研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput Shigella-specific serum bactericidal assays (SBAs) address a critical gap in functional antibody evaluation for vaccine and immunotherapy development. By enabling robust, reproducible quantification of bactericidal activity, this assay supports predictive confidence in early discovery and translational research. Its standardized, scalable workflow enhances portfolio decision-making and risk-adjusted advancement for Shigella-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of functional antibody-mediated bacterial killing for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying immune effector function against Shigella.
- Facilitates comparative evaluation of candidate antigens or immunization strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, high-throughput platform for screening serum samples across multiple conditions.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for assay standardization and cross-lab comparison.
- Reduces manual labor and increases throughput using 96-well plates and automated colony counting.
Translational & Preclinical Research
- Enables assessment of functional antibody responses pre- and post-antigen exposure in preclinical models.
- Supports translational biomarker development by linking bactericidal titers to protective immunity.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation for vaccine candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This SBA protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical evaluation, providing a standardized readout for functional antibody activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-mediated bacterial clearance and immune mechanism elucidation.
- Screening: Offers reproducible, quantitative bactericidal titers for candidate and cohort comparison.
- Analytics: Utilizes automated colony enumeration and 50% killing index calculations for robust data outputs.
- Translational Research: Aligns functional antibody measurements with preclinical and clinical immune response endpoints.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, transferable assay platform for multi-site and multi-program deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and functional immune response assessment.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, reducing labor and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing standardized, quantitative functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vaccine and immunotherapy candidates based on functional antibody activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, microbiology, and aseptic technique for BSL-2 pathogens.
- Needs access to 96-well plate handling, automated colony counting software, and microbiological incubators.
- Demands cross-team standardization for assay setup, plating, and data analysis.
- Adaptable to various serum sources and Shigella strains with protocol optimization.
- Live virulent Shigella use necessitates strict biosafety and PPE compliance.
