Name: 巨噬细胞 ros 产生的流式细胞仪测量对 fcγr 交联的响应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 学习使用流式细胞术和荧光探针测量巨噬细胞在FcγR交联刺激下的活性氧产生。该方法可重复性高，适用于慢性肉芽肿病等免疫疾病的分子诊断研究。

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作者感谢Tigno-Aranjuez实验室其他成员，包括Madelyn H. Miller、Omar Cardona、Andjie Jeudy和Roopin Singh，在实验室日常维护和小鼠品系保育方面提供的帮助。本研究得到了R00 HL122365基金以及J.T.T-A.启动资金的支持。

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作者声明无利益冲突。

基于 DCFH2-DA 和 DHE 的活性氧（ROS）检测是一种广泛应用的技术14,15。这些 ROS 探针操作简便，且适用于动力学微孔板检测、荧光显微镜或流式细胞术分析，因而广受欢迎。然而，在我们对 FcγR 介导的巨噬细胞功能的研究中，尚未见针对 FcγR 交联细胞进行流式细胞术分析的标准化实验方案。鉴于所检测分析物具有较高的反应活性，我们发现实验时间的控制对于确保结果的可重复性至关重要。尽管我们也曾开展动力学微孔板检测，但不同实验间荧光强度存在较大变异，导致生物学重复样本难以合并进行统计学分析。使用流式细胞术检测这些探针可定量“ROS 阳性”细胞，从而在一定程度上解决上述问题，但仍存在一些挑战。当使用配备自动进样器的流式细胞仪时，这一问题尤为突出。在此情况下，分析大量样本将影响细胞暴露于各种刺激物的时间。为减轻此影响，我们已在实验方案中纳入样本分析之间的滞后时间，以确保所有待分析细胞接受刺激的时间基本一致。
流式细胞术检测活性氧（ROS）...

活性氧（ROS）是有氧呼吸过程中产生的活性分子或自由基副产物（综述见1）。其中包括超氧阴离子、过氧化物、过氧化氢、羟基自由基和羟基离子等。在正常的生理条件下，ROS主要由线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶产生，并被超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等多种酶和蛋白质迅速解毒。当ROS产生过多或清除能力缺陷时，可导致氧化应激，此时活性氧会促进蛋白质、脂质和DNA的损伤，进而引起细胞应激或死亡，并导致病理疾病状态。然而，目前人们认识到ROS也可作为信号分子发挥作用（即氧化还原信号），通过介导多种分子和信号通路中间体的修饰，影响细胞代谢、增殖、存活、炎症信号传导以及衰老过程2。在吞噬细胞中，ROS在所谓的“呼吸爆发”过程中发挥关键作用，介导抗菌活性1,3,4,5,6。当吞噬细胞受到外界刺激时，NADPH氧化酶复合物的组分（p40phox、p47phox、p67phox）会从胞质溶胶转位至含有gp91phox和p22phox亚基的吞噬体膜上，并在Rac1/2的作用下共同形成具有完整功能的NADPH氧化酶复合物。组装完成的NADPH氧化酶利用NADPH将氧气还原为超氧阴离子，该反应发生于吞噬体囊泡内。超氧阴离子可直接造成损伤，也可经歧化反应生成过氧化氢。超氧阴离子和过氧化氢均可与其他分子反应，生成高活性的羟基自由基。这些ROS可通过与蛋白质上的铁硫簇发生反应，或引起DNA碱基氧化，从而介导损伤，最终导致微生物代谢受限或死亡5。NADPH氧化酶复合物及其在呼吸爆发过程中产生的ROS的重要性，在慢性肉芽肿病（CGD）患者的临床表现中得以体现7,8,9,10。CGD患者存在gp91phox基因突变，导致无法产生ROS，因而易反复感染某些细菌和真菌，而这些病原体在免疫功能正常个体中通常不会引起严重问题。因此，无论研究氧化应激、氧化还原信号传导还是宿主防御机制，能够实时检测ROS的生成都是一项有价值的研究手段。
已有多种检测方法用于测量活性氧（ROS）的产生或氧化应激的结果11,12,13。其中应用最广泛的方法之一是使用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH2-DA）14。该分子无色且具有亲脂性。DCFH2-DA可扩散穿过细胞膜，进入细胞后被胞内酯酶水解，脱去乙酰基生成DCFH2，从而转变为不能透过细胞膜的化合物。多种类型的活性氧（如过氧化氢、过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮和过氧自由基）可将DCFH2氧化为具有荧光特性的DCF（激发/发射波长：485–500 nm/515–530 nm），后者可使用配备标准荧光素滤光片组（FL1通道）的流式细胞仪进行检测。超氧阴离子与DCFH2反应较弱，但可与另一种探针二氢乙啶（DHE）反应，生成荧光产物2-羟基乙啶（同时也产生其他不依赖于超氧阴离子的荧光氧化产物）15。DHE氧化产生的荧光产物可在激发波长518 nm、发射波长605 nm（FL2通道）下检测。尽管这些探针使用相对简便，但要获得有效的实验结果和结论，必须了解其局限性，并在具体实验中谨慎设计染色步骤和对照措施。以下实验方案展示了如何使用一种市售试剂盒，该试剂盒包含上述两种探针，专为通过流式细胞术检测ROS而设计。我们用这两种探针对经预处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞进行染色，并通过FcγR交联诱导ROS的产生。本文展示了采用该方案获得的代表性数据，并强调了成功开展实验所必须采取的适当预防措施。

<table><tbody><tr><td>抗BSA IgG1</td><td>Innovative Research</td><td>IBSA9E2C2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 大鼠IgG2b，&amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BioLegend</td><td>400626</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>与Alexa Fluor 647偶联的抗小鼠F4/80抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>565853</td><td></td></tr><tr><td>与FITC偶联的抗小鼠F4/80抗体</td><td>BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>与Alexa Fluor 647偶联的抗小鼠/人CD11b抗体&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>101218</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇（BME）</td><td>Sigma</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）第五组分</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J&amp;nbsp;</td><td>Jackson labs</td><td>Stock No.000664</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA</td><td>Molecular Probes</td><td>C6827</td><td>可作为Enzo试剂盒中氧化应激检测试剂的替代品</td></tr><tr><td>二氢乙啶（DHE）</td><td>Molecular Probes</td><td>D11347</td><td>可作为Enzo试剂盒中超氧阴离子检测试剂的替代品</td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>无酚红DMEM</td><td>Gibco</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>无水DMF&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>61094-1000</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的大鼠IgG2a，&amp;kappa; 同型对照抗体</td><td>BioLegend</td><td>400506</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1M）</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LADMAC细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IFN-γ</td><td>GoldBio</td><td>1360-06-100</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>EMD Milipore</td><td>106425</td><td>可作为Enzo试剂盒中活性氧抑制剂/清除剂的替代品</td></tr><tr><td>配备自动进样器的Novocyte流式细胞仪</td><td>Acea</td><td>2060R</td><td></td></tr><tr><td>绿脓菌素（ROS诱导剂）</td><td>Cayman chemical</td><td>10009594</td><td>可作为Enzo试剂盒中诱导剂的替代品</td></tr><tr><td>ROS-ID总ROS/超氧阴离子检测试剂盒</td><td>ENZO</td><td>ENZ-51010</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

流式细胞术检测fcγr交联诱导的巨噬细胞ros产生

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

氧化爆发或呼吸爆发用于描述吞噬细胞在多种免疫刺激下快速消耗氧气并产生活性氧物质（ROS）的现象。免疫活化过程中产生的活性氧物质主要通过损伤DNA和蛋白质的能力发挥强大的抗菌作用，从而导致微生物死亡。为了评估不同信号通路和分子在宿主防御机制中的贡献，必须能够可重复且简便地测量活性氧物质的生成。本文中，我们展示了利用荧光探针和流式细胞术检测活性氧物质产生的方法。尽管荧光检测法被广泛使用，但其在活性氧物质测量方面存在显著问题，尤其是在检测由特异性刺激（而非有丝分裂原性刺激）诱导的活性氧物质时。我们提供了一套详细的方法，用于检测由特异性Fcγ受体刺激所引发的活性氧物质生成，内容涵盖巨噬细胞的制备、预处理、染色、Fcγ受体交联，直至流式细胞术分析的完整流程。

根据所述实验方案，我们展示了通过流式细胞术检测野生型C57BL/6J小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）经FcγR刺激后活性氧（ROS）产生的代表性数据。如预期所示，未刺激细胞中FL1和FL2荧光信号相对于本底水平无明显变化（图3A，比较“染色、未刺激”与“未染色、未刺激”的散点图）。当细胞经FcγR交联剂刺激后，FL1和FL2荧光信号显著增强（图3A，比较“经Fc交联刺激并染色”样本与“染色、未刺激”散点图）。最后，若在FcγR交联刺激前用ROS抑制剂处理细胞，则荧光增强效应恢复至基础水平（图3A，比较“经ROS抑制剂处理并经Fc交联刺激”与“经Fc交联刺激并染色”的散点图）。该趋势在以各通道直方图形式展示数据时同样明显（图3B），或在以绿色或橙色ROS探针阳性细胞百分比形式展示时亦可清晰观察到（图3C）。当数据以平均荧光强度（MFI）表示时...

本研究展示了如何使用流式细胞术检测由 FcγR 激活引发的活性氧（ROS）产生。该方法可用于评估吞噬细胞在免疫复合物、调理微生物或直接 FcγR 交联刺激下，其抗菌功能和氧化还原信号传导功能的变化。

流式细胞术检测FcγR交联诱导的巨噬细胞ROS产生

氧化爆发或呼吸爆发用于描述吞噬细胞在...过程中快速消耗氧气并产生活性氧（ROS）的现象。

活性氧（ROS）的检测一直存在诸多难题。在本视频中，我们将演示利用荧光探针和流式细胞术，针对Fc-γ受体交联所引发的活性氧进行可重复检测的方法。该技术的主要优势在于实验结果具有良好的可重复性，并且该方法可用于特异性抗原刺激，而不仅限于有丝分裂原或已知的活性氧诱导剂。活性氧（ROS）生成失调是多种疾病发生发展的核心因素，例如慢性肉芽肿病（CGD）。准确测量活性氧水平可作为CGD分子诊断的一部分。研究Fc介导的活性氧生成不仅对免疫缺陷病（如CGD）的研究具有重要意义，也对自身免疫性疾病和神经退行性疾病的探究至关重要，因为在这些疾病中，过量的活性氧会导致氧化应激和炎症反应。该实验的时间控制至关重要。建议首次尝试本方案的研究人员充分准备，并在可能的情况下进行一次模拟实验。通过直观演示该方法，可以重点强调实验中需要特别注意的步骤，例如实验的时间控制。首先，按照随附的文字实验方案，使用条件培养基制备骨髓来源的巨噬细胞。将巨噬细胞孵育过夜进行预处理后，吸除上清液，并用 PBS 洗涤细胞一次。通过更换为等体积的低血清 DMEM 培养基，对细胞进行血清饥饿处理。每只小鼠的一个培养板用抗BSA IgG1处理并同时进行血清饥饿，另一个培养板则不做处理。在未处理的培养板中仅加入低血清DMEM，而在处理的培养板中加入含有2.5 微克/毫升小鼠抗BSA IgG1的低血清DMEM。每次实验务必额外设置一个未处理的培养板，作为流式细胞术补偿对照。将培养板在37摄氏度、5% CO2条件下孵育4小时。在4小时孵育期间，配制活性氧探针的2倍浓度溶液。每需要10毫升低血清DMEM，加入4微升氧化应激检测试剂和4微升超氧阴离子检测试剂。然后，配制仅含氧化应激检测试剂或仅含超氧阴离子检测试剂的2倍浓度探针溶液。孵育四小时后，轻轻刮取培养板中的细胞，并收集至已标记的5毫升圆底试管中。以750 × g离心5分钟。务必记录好哪些细胞已用小鼠抗BSA IgG1处理。接着，用两毫升PBS洗涤细胞沉淀，以去除处理过的细胞中残留的抗BSA。将离心管在750 ×g下离心五分钟。然后，吸除 PBS，并将细胞沉淀重悬于 600 微升低血清 DMEM 培养基中。从该 600 微升细胞悬液中，取 200 微升分装至预先标记的 5 毫升圆底试管中。从未处理的细胞中，取 200 微升加入标记为“未刺激”的试管，200 微升加入标记为“阳性诱导剂”的试管，以及 200 微升加入标记为“阳性诱导剂加抑制剂”的试管。然后，从经抗-BSA IgG1处理的细胞中，取200微升加入标记为“Fc-γ受体交联”的管中，另取200微升加入标记为“Fc-γ受体交联加抑制剂”的管中。从用于补偿对照的未处理细胞中，取200微升加入标记为“未染色未刺激”的管中，200微升加入标记为“绿色荧光加诱导剂对照”的管中，以及200微升加入标记为“橙色荧光加诱导剂对照”的管中。通过将绿脓菌素按1:100稀释至各2X探针溶液中，配制浓度为500微摩尔的2X阳性诱导剂溶液。然后，通过将BSA储备液用2X探针溶液稀释，配制2X BSA溶液，使其终浓度为每毫升2微克。在开始特异性刺激（如Fc-γ受体交联）之前，确保所有试剂和细胞均已准备就绪，并将试管按刺激顺序放置于冰上。对于配备自动进样器的流式细胞仪，需记录细胞仪分析一个样本并进入下一个样本所需的时间。务必包含所有混合和探针清洗步骤。该检测实验的时间控制非常关键。为了确保每个条件得到良好控制，每种条件的刺激必须精确进行30分钟。按顺序刺激细胞，并根据流式细胞仪采集样本之间的时间间隔纳入滞后时间。如果此时进行手动补偿，则通过向标记为绿色加诱导剂的管中加入200微升含有氧化应激检测试剂和诱导剂的2X探针溶液，来刺激用于补偿的对照管。然后，向标记为橙色加诱导剂的管中加入200微升含有超氧阴离子检测试剂和诱导剂的2X探针溶液。将细胞在避光条件下孵育30分钟。使用流式细胞仪软件，为对照组（未染色、未处理）、绿色荧光加诱导剂组以及橙色荧光加诱导剂组生成并标记三个样本文件，确保标明待分析的通道和参数。同时，输入所需的停止条件。设置好对照样本后，为实验样本生成并标记一组类似的文件。接下来，运行未染色、未处理的样本。打开一个点图，以X轴为前向散射光，Y轴为侧向散射光，并在目标细胞周围绘制门控，排除死细胞和碎片。接下来，使用该细胞的门控设置，打开另一个点图，以X轴显示第一个荧光标记FL1，Y轴显示第二个荧光标记FL2。绘制初步的象限门，然后调整象限门，使事件出现在FL1与FL2点图的左下象限。完成后，运行绿色荧光诱导样本。调节电压，使事件出现在FL1与FL2图的左下和右下象限。然后，将此补偿矩阵应用于所有三个样本文件。现在，运行橙色荧光加诱导剂样本。调节电压，使事件出现在FL1与FL2散点图的左上和左下象限，然后将此补偿矩阵应用于所有三个样本文件。检查每个补偿文件，确保未染色、未处理的事件位于FL1与FL2散点图的左下象限，绿色荧光加诱导剂的事件位于左下和右下象限，橙色荧光加诱导剂的事件位于左上和左下象限。随后，将该补偿矩阵应用于所有实验样本文件。在完成手动补偿并获得实验模板后，开始处理实验样本。在使用阳性诱导剂处理细胞或进行Fc-γ受体细胞刺激之前，标记哪些试管将加入活性氧（ROS）抑制剂。在加入阳性诱导剂或进行Fc-γ受体刺激前至少30分钟，向200微升重悬细胞中加入1微升抑制剂（终浓度为5毫摩尔），以对这些细胞进行ROS抑制剂处理。对于未刺激的细胞，将200微升不含任何刺激物的2X探针溶液加入标记为“染色、未刺激”的200微升细胞悬液中处理细胞。对于阳性对照，将200微升2X阳性诱导剂溶液加入标记为“阳性诱导剂”或“阳性诱导剂加抑制剂”的200微升细胞悬液中进行处理。最后，对于通过Fc-γ受体交联刺激的细胞，将200微升2X BSA溶液加入标记为“Fc-γ受体交联”或“Fc-γ受体交联加抑制剂”的200微升细胞悬液中进行处理。将细胞在避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，按照刺激的顺序使用流式细胞仪及初始补偿步骤中生成的分析模板对样品进行分析。此处展示的数据表明，通过FC-γ受体刺激巨噬细胞可导致活性氧物种的产生，该过程可通过流式细胞术检测。当细胞经Fc-γ受体交联剂刺激后，FL1和FL2荧光显著增强。若在Fc-γ受体交联前使用活性氧物种抑制剂处理细胞，则荧光增强恢复至基础水平。相比之下，这些散点图显示的是一个不成功的实验，其中观察到Fc-γ受体刺激导致活性氧物种产生不足。为了突出预期百分比或MFI增幅之间的显著差异，本数据展示了FL1和FL2荧光信号仅有轻微增加的样本表现。当前方案采用24小时的预刺激步骤。在比较24小时与48小时预刺激时间时，绿色氧化应激试剂阳性的细胞百分比未见明显差异。然而，将引物孵育时间延长至48小时确实提高了呈橙色荧光阳性的细胞比例。进行此实验时最重要的两点是提前规划，并在每次实验中保持检测时间的一致性，以获得可重复的结果。

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从适合RNA分析和巨噬细胞表型鉴定的人类内脏脂肪组织中分离活的脂肪细胞和基质血管组分

本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。...

使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种

本研究描述了一种标准化的 体外...

大鼠巨噬细胞体外吞噬同种异体与异种红细胞的定量评估 In Vitro

学习使用流式细胞术和荧光探针测量巨噬细胞在FcγR交联刺激下的活性氧产生。该方法可重复性高，适用于慢性肉芽肿病等免疫疾病的分子诊断研究。

流式细胞术检测FcγR交联诱导的巨噬细胞ROS产生

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