转基因玉米中黄曲霉生长和黄曲霉毒素的产生表达表达.

在这里，我们提出一个简单的内核筛选分析，以分析在玉米核表达抗真菌蛋白的阿斯佩吉卢斯飞松生长和黄曲霉素生产。使用表达阿斯佩吉卢斯黄花菌株的绿色荧光蛋白，我们实时监测成熟内核中真菌的感染和传播。这种简单的测定为评估玉米仁抵抗阿斯佩吉卢斯黄曲霉菌感染和黄曲霉素生产的能力提供了可靠的方法。

在成熟内核的受控条件下进行的实验室检测结果与现场条件下的感染结果相关。演示该程序将是来自我们实验室的博士后拉杰蒂拉克·马朱姆达尔博士，以及来自我们实验室的生物科学技术人员克里斯汀·西克勒和大卫·安布罗西奥。首先，在培养皿中粘合 20 个两毫米的扣帽，以创建 KSA 盖。

在使用瓶盖之前，让胶水干燥 48 小时。在生物安全柜中喷洒一个方形生物测定托盘，水中有70%乙醇。让托盘空气干燥。

将无菌色谱纸添加到干纸盒中。用 70% 乙醇喷洒 9 个 KSA 瓶盖，让它们风干。然后把帽子放在生物测定托盘上。

对于正在测试的每个转基因玉米生产线，选择20个未损坏的玉米仁，并把它们放入50ml离心管中。使用台式立体显微镜仅选择未损坏的内核进行检测。受损的内核更容易受到阿斯佩吉卢斯攻击，并产生更多的黄曲霉毒素，从而扭曲结果，不代表品种的真正抗真菌或抗菌特性。

在每个管中加入70%乙醇。让内核消毒四分钟，偶尔轻轻摇动它们。在此轻轻倒出乙醇后，轻轻冲洗的内核在无菌去ion化水三次。

获得为期六天的阿斯佩吉卢斯火焰染色70表达GGFP生长在V8介质上的六天文化。在去化水中加入20毫升无菌0.02%Triton X-100。并使用无菌循环刮掉孢子。

从幼崽上移出，将其转移到300毫升无菌烧杯中。用 0.02% Triton X-100 准备五倍稀释，并使用血细胞计执行孢子计数。如有必要，再次稀释，以获得100毫升，浓度为每毫升400万孢子。

将烧瓶倒入空烧杯中。将内核放入无菌的 300 ml 烧杯中，搅拌杆，搅拌三分钟。使用钳子将内核转移到生物测定盘中，确保每个盖中只放置一个内核。

在每个生物测定托盘的底部加入30毫升的去维化水。并在31摄氏度下孵育7天。使用 A.flavus 接种七天后，拍摄四个内核的照片，这些内核被指定为显微分析和摄影。

然后使用软组织和去化水来清洁内核的外部。执行内核的纵向部分，并立即在荧光显微镜下拍照。要准备内核进行分析，请用软组织和去维水清洁剩余的内核外部。

将四个内核（组成一个代表）放入包含两个不锈钢球的 15 ml 螺帽聚碳酸酯小瓶中。立即将小瓶冷冻在液氮中，并储存在80摄氏度，直到准备好进行进一步处理和分析。准备就绪后，从冰柜中取出内核，并使用均质器以 1500 rpm 转速研磨三分钟。

使用相同的地面材料进行GP分析、黄曲霉毒素测定和分子分析，使所有值都代表样品。虽然建议至少进行三次复制，但更多复制总是更好的，具体取决于高质量内核的可用性。在这项研究中，利用含有最终植物目标载体的农业细菌纪元EHA101菌株转化了玉米HI-II线的未成熟胚胎，该菌株在花椰菜马赛克病毒的35S促进剂的控制之下表达Lablab purpureus AILP基因。

目标AILP基因的PCR扩增显示，仅在转基因玉米线中观察到548bp安培。AILP基因在转基因线中表现出表达，而在对照植物中未观察到AILP表达。早期发芽孢子暴露在来自年轻转基因玉米植物的粗叶提取物中20小时。

与负对比相比，暴露于转基因叶提取物的孢子的全长比负控制减少了58%至80%。使用的 A.flavus 菌株包含一个 GFP 报告器，能够实时监测和定量真菌生长。与等源负对比，转基因AILP内核中GGFP荧光显著减少。

AILP线4和5、69%和72%的真菌生长显著下降。与控制内核相比，其他行显示减少了 35 到 60%。与控件相比，在 AILP 内核中观察到 Aflatoxin 含量减少了 62% 到 88%。

第四行的Aflatoxin含量最低，为每克486纳克，其次是内核中每克640至1498纳克的其他行。按照此过程，可以执行其他方法，例如使用荧光计来量化 GFP 及其真菌生长。免疫性商用试剂盒或 HPLC 或 EPLC 可用于执行黄曲霉毒素定量。

KSA 的可用性提供了一种快速而简单的方法，用于确定对黄曲霉毒素污染的耐药性。使用这种技术可以快速评估不同玉米育种线。虽然内核筛选检测不危险，但操作者应保护自己免受接触 Aspergillus 飞毛孢菌，使用适当的防护设备。