Name: 古树康 (GSK) 颗粒的制备,用于 Vivo 和体外实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 学习制备古树康颗粒工作溶液用于体内实验及含药血清用于体外实验的方法。本方案成本低、易于重复，适用于中药药理学研究，支持骨代谢相关实验。

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本研究由国家自然科学基金（81804116、81673991、81770107、81603643 和 81330085）、中国科学技术部创新团队项目（2015RA4002，WYJ）、&#160;中国教育部创新团队项目（IRT1270，WYJ）、上海市慢性病中医药防治中心（2017ZZ01010，WYJ）、中医药事业发展三年行动计划（ZY(2018-2020)-CCCX-3003，WYJ）以及国家重点研发计划项目（2018YFC1704302）资助。

所有实验操作均经上海中医药大学机构动物护理和使用委员会批准（SZY201604005）。
1. GSK 工作溶液的制备与给药
<ol>
	<li>计算小鼠GSK颗粒的等效剂量。
	<ol>
		<li>根据Meeh-Rubner公式15计算体表面积：体表面积 = K × (体重2/3)/1000，其中人的K值为10.6，小鼠为9.1。假设人体重为70 kg，则人体表面积（m2）= 10.6 × (702/3)/1000 = 1.8 m2。假设小鼠体重为20 g（0.02 kg；例如，1月龄雌性C57/BL6小鼠），则小鼠体表面积（m2）= 9.1 × (0.022/3)/1000 = 0.0067 m2。</li>
		<li>根据计算出的体表面积，计算人与小鼠之间的体表面积换算系数。人：70 kg / 1.8 m2 = 39。小鼠：0.02 kg / 0.0067 m2 = 3。GSK颗粒 = 20 g / 70 kg × 39 / 3 = 3.72 g/kg ≈ 4 g/kg。</li>
		<li>根据每只小鼠体重20 g，计算小鼠的等效剂量：4 g/kg × 0.02 kg = 0.08 g。</li>
		<li>根据每组20只小鼠、干预持续3个月（90天）的实验设计，计算三种等效剂量的GSK颗粒总量：（1）GSKL（OVX + 低剂量GSK颗粒[2 g/kg/天]）：0.04 g/小鼠/天 × 20只小鼠 × 90天 = 72 g。（2）GSKM（OVX + 中剂量GSK颗粒[4 g/kg/天]）：0.08 g/小鼠/天 × 20只小鼠 × 90天 = 144 g。（3）GSKH（OVX + 高剂量GSK颗粒[8 g/kg/天]）：0.12 g/小鼠/天 × 20只小鼠 × 90天 = 216 g。 
		注：实际操作中应额外准备20%的GSK颗粒以弥补损耗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据体重计算每只小鼠GSK颗粒的给药体积15：例如，体积（V）= 0.24 mL/小鼠/天。 
	注：小鼠灌胃给药的标准体积为0.12 mL/10 g体重。</li>
	<li>称取可供10天使用的三种剂量的GSK颗粒，分别称取8 g、16 g和24 g，作为GSKL、GSKM和GSKH。</li>
	<li>根据Meeh-Rubner公式15，参照步骤1.1.1和1.1.2的方法，计算碳酸钙与维生素D3（CAL）在小鼠中的等效剂量：CAL剂量 = 2片 / 70 kg × 39 / 3 = 0.372片/kg ≈ 0.4片/kg。</li>
	<li>根据每只小鼠体重20 g（例如，1月龄雌性C57/BL6小鼠），计算小鼠的CAL等效剂量：0.4片/kg × 0.02 kg = 0.008片。再根据每组20只小鼠、干预持续3个月（90天）的实验设计，计算所需CAL总量：0.008片 × 20 × 90 = 14.4片。称取可供10天使用的CAL量（1.6片）。</li>
	<li>溶解
	<ol>
		<li>将8 g GSK颗粒放入50 mL离心管中，加入48 mL生理盐水，振荡混匀至完全溶解。 
		注：完全溶解的标准是无沉淀残留。可通过灌胃针吸取工作液并顺利排出进一步确认是否完全溶解。</li>
		<li>分别用16 g和24 g GSK颗粒重复步骤1.5.1。</li>
		<li>将1.6片CAL（10天用量）放入50 mL离心管中，加入48 mL生理盐水，振荡混匀至完全溶解。 
		注：工作液可在-4 °C保存，每10天配制一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌胃给药
	<ol>
		<li>用手抓住小鼠背部（1月龄雌性C57/BL6小鼠），使小鼠朝前，并确保其保持稳定姿势。给药前让小鼠保持安静状态2–3分钟。 
		注：确保研究人员能清晰看到小鼠正面。建议佩戴手套以防被咬伤，尤其是新手研究人员。</li>
		<li>将灌胃针（规格：#12，40 mm）插入GSK颗粒工作液中，吸取0.24 mL工作液。</li>
		<li>将灌胃针从一侧口角插入小鼠口腔，直至进入胃部。 
		注：确认灌胃针已进入胃内的方法：（1）灌胃针遇到阻力感，同时小鼠在针通过食管生理狭窄处前出现吞咽动作。（2）注入约0.5 mL工作液后观察1分钟，若无液体从口鼻溢出，则表明灌胃针已进入胃内。</li>
		<li>将GSK颗粒工作液（0.24 mL/小鼠）注入胃内，然后拔出灌胃针，将小鼠放回笼中。</li>
		<li>使用CAL溶液重复步骤1.6.4，每只小鼠注射0.24 mL CAL溶液。 
		注：CAL溶液的给药体积按步骤1.2计算得出。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 微型计算机断层扫描
<ol>
	<li>胫骨取材与准备
	<ol>
		<li>在干预90天后的次日，对小鼠腹腔注射80 mg/kg的氯胺酮（剂量为300 mL/100 g）进行麻醉。用针轻夹脚趾以确认小鼠是否完全麻醉，无反应表明麻醉成功。随后通过颈椎脱臼法处死小鼠。</li>
		<li>用图钉将小鼠四肢固定于泡沫板上。</li>
		<li>使用剪刀（长度：8.5 cm）和镊子（长度：10 cm）从近端向远端剪除腿部皮肤，随后取出胫骨。</li>
		<li>立即将胫骨放入70%乙醇中，清洗3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用海绵泡沫包裹小鼠左侧胫骨，并将其放入样品管中（直径35 mm，长度140 mm）。 
	注意：标本的长轴应与样品管长轴一致，确保胫骨近端朝上。</li>
	<li>运行micro-CT 80扫描仪
	<ol>
		<li>在室温下启动micro-CT 80扫描仪。</li>
		<li>将样品管放入micro-CT 80中，并以以下参数开始横断面扫描：像素尺寸15.6 μm，管电压55 kV，管电流72 μA，积分时间200 ms，空间分辨率15.6 μm，像素分辨率15.6 μm，图像矩阵2048 × 2048。 
		注意：通过预扫描区分松质骨与皮质骨。胫骨的扫描区域定义为从胫骨平台下方5 mm至远端的松质骨区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨参数的定量分析
	<ol>
		<li>完成横断面扫描后，获取左侧胫骨的图像。</li>
		<li>设定密度阈值为245–1000。使用micro-CT评估软件V6.6测量以下骨参数：骨矿物密度（BMD）、骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）以及骨小梁分离度（Tb.Sp）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 体外实验用血清的制备
<ol>
	<li>计算
	<ol>
		<li>根据大鼠体重0.2 kg（1月龄，雌性，Sprague-Dawley），计算GSK颗粒的剂量：人日剂量 × 人体重 × K / 大鼠体重 = 20 g/70 kg/天 × 70 kg × K（K = 0.018）/ 0.2 kg = 2 g/kg/天。 
		注：K为人体与大鼠之间的药理学转换系数15（K = 0.018）。</li>
		<li>重复步骤3.1.1，计算以下剂量。
		<ol>
			<li>计算GSKL剂量：10 g/70 kg/天 × 70 kg × K / 0.2 kg = 1 g/kg/天。</li>
			<li>计算GSKM剂量：20 g/70 kg/天 × 70 kg × K / 0.2 kg = 2 g/kg/天。</li>
			<li>计算GSKH剂量：40 g/70 kg/天 × 70 kg × K / 0.2 kg = 4 g/kg/天。</li>
			<li>计算CAL剂量：2片/70 kg/天 × 70 kg × K / 0.2 kg = 0.2片/kg/天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计算GSK颗粒和CAL的总剂量。
		<ol>
			<li>计算GSKL的总剂量：1 g/kg/天 × 0.2 kg × 6只大鼠 × 3天 = 3.6 g。</li>
			<li>计算GSKM的总剂量：2 g/kg/天 × 0.2 kg × 6只大鼠 × 3天 = 7.2 g。</li>
			<li>计算GSKH的总剂量：4 g/kg/天 × 0.2 kg × 6只大鼠 × 3天 = 14.4 g。</li>
			<li>计算CAL的总剂量 = 0.2片/kg/天 × 0.2 kg × 6只大鼠 × 3天 = 0.72片。 
			注：需要总共10 mL含GSK颗粒的血清来制备100 mL培养基（含20% GSK颗粒血清）。每只大鼠（每组6只）离心后预计可提供1.5−2 mL含GSK颗粒的血清。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据体重15计算每只大鼠给予的GSK颗粒体积：例如，体积（V）= 2 mL/只/天。 
		注：大鼠灌胃给药的体积为0.1 mL/10 g。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称取3天用量的三种剂量GSK颗粒。分别称取3.6 g、7.2 g和14.4 g的GSK颗粒，作为GSKL、GSKM和GSKH。为CAL组称取0.72片。</li>
	<li>将7.2 g GSK颗粒放入50 mL离心管中，加入36 mL生理盐水，振荡使其完全溶解。对3.6 g和14.4 g的GSK颗粒重复此操作。</li>
	<li>按照1.6节方法，使用2 mL GSK工作液进行灌胃给药。 
	注：对空白对照组使用相同体积的生理盐水（每只大鼠2 mL）灌胃，用于制备血清，作为体外实验的空白对照。</li>
	<li>含GSK血清的制备
	<ol>
		<li>在最后一次给予GSK颗粒后1小时，以80 mg/kg的氯胺酮按300 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉大鼠。用针轻刺脚趾确认大鼠是否完全麻醉，无反应表示麻醉成功。</li>
		<li>切开皮肤和腹膜后，使用直手术剪暴露大鼠腹部至胸腔下缘。 
		注：手术器械在使用前必须经高温高压灭菌。采血过程中需用70%乙醇对术区进行消毒。</li>
		<li>用滤纸清除腹主动脉周围的结缔组织，充分暴露血管。</li>
		<li>使用10 mL、22 G注射器从腹主动脉采血。然后取下针头，将血液转移至15 mL无菌离心管中。通常每只大鼠可采集6−8 mL血液。 
		注：采血时必须保持大鼠存活。一个指标是活体大鼠的腹主动脉会搏动。采血完成后大鼠死亡。</li>
		<li>将离心管直立于室温下静置30−60分钟，直至血液完全凝固。然后在500−600 × g 条件下离心20分钟。将一组（6只大鼠）的所有上清液（血清）转移至一个50 mL无菌离心管中，轻轻振荡混匀。</li>
		<li>将血清置于56 °C水浴中孵育30分钟以灭活补体。使用孔径0.22 μm的亲水性聚醚砜注射器滤器过滤血清。长期保存（不超过1年）时储存于-80 °C。 
		注：过滤后的血清可用于体外破骨细胞生成和成骨细胞生成实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>应用
	<ol>
		<li>体外破骨细胞生成
		<ol>
			<li>将三种剂量的含GSK血清（GSKL、GSKM、GSKH）按1:4比例用含L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷的最低必需培养基（α-MEM）稀释。 
			注：确保体外破骨细胞生成和成骨细胞生成实验中含GSK血清的终浓度为20%。</li>
			<li>将步骤3.6.1.1中稀释的含GSK血清（200 μL/孔）加入来自4−6周龄C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞（BMMs）中，用于破骨细胞生成，并按照先前描述的方法2，用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，10 ng/mL）和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL，100 ng/mL）刺激BMMs。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>体外成骨细胞生成
		<ol>
			<li>重复步骤3.6.1.1。</li>
			<li>将稀释后的含GSK血清（2 mL/孔）加入来自4−6周龄C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，以诱导成骨细胞分化，方法如前所述16。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Chinese+herbal+drug-containing+serum+for+activating+blood%2C+activating+blood+and+dispelling+toxin+on+TNF-alpha-induced+adherence+between+endothelial+cells+and+neutrophils+and+the+expression+of+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Zhongguo+Zhong+Xi+Yi+Jie+He+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway.</a> Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).</li>
<li>Li, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+issues+in+methology+of+Chinese+herbs+serum+pharmcology%5BTitle%5D)+AND+%22Zhong+Yao+Xin+Yao+Yu+Lin+Chuang+Yao+Li%22%5BJournal%5D)">Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology.</a> Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263(1999).</li>
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<li>Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%2C+cytokines%2C+and+pathogenesis+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal.+Bone+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis.</a> Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).</li>
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<li>Kimble, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+block+of+interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+is+required+to+completely+prevent+bone+loss+in+the+early+postovariectomy+period%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period.</a> Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

中药颗粒已成为制剂或处方的常见选择之一。GSK颗粒根据临床经验或中医理论由多种草药组成，具有疗效更好、副作用更少的特点4。与水煎剂相比，颗粒剂具有以下优势：口感好、便于携带、可长期储存、制备工艺标准化、疗效稳定，且生产效率更高。目前，颗粒剂是中药中最常用的剂型之一。然而，其药理作用的潜在机制仍鲜有研究。因此，有必要明确颗粒制备过程中的关键步骤，以深入探究其潜在的药理机制。
在过去几十年中，由于中药有效成分结构明确，通常采用一种或多种代表性有效成分进行分子检测和药理学研究。已有大量研究致力于通过中药有效成分来理解其治疗作用5,6,7。然而，由于体内环境复杂，多种有效成分协同作用，仅用单一成分难以模拟患者体内的实际反应。为解决这一问题，采用中药颗粒进行研究可探索药理过程，相较于使用有效成分的研究，是一种可行的分子研究方法选择。
<p class=...

中药（Traditional Chinese Medicine, TCM）是治疗骨质疏松症的重要补充和替代疗法之一1,2。水煎剂是中药方剂最基本且最常用的剂型3。然而，其存在诸多缺点：口感差、携带不便、保质期短以及制备工艺不统一，这些因素限制了其应用及疗效发挥。为克服上述弊端并追求更佳疗效，中药颗粒剂应运而生，并已得到广泛应用4。尽管已有大量研究探讨了颗粒剂中一种或多种有效成分的药理机制5,6,7，但其确切的作用机制及潜在的药理过程仍难以明确。其原因在于，单一种颗粒剂中含有过多的有效成分，可能同时产生相似或相互拮抗的作用4。因此，在将颗粒剂给予机体之前建立统一的标准制备方案，不仅对治疗效果具有重要影响，也是开展体内和体外实验所必需的前提条件。
此外，颗粒剂在临床中的治疗效果难以通过体外或离体研究进行确切验证和精确识别，这带来了挑战，因为其药理机制过于复杂。为解决这一问题，Tashino 于20世纪80年代首次提出了含药血清的制备方法8。自此以后，众多研究人员将含药血清应用于包括颗粒剂在内的中药研究9,10,11。目前，在体外研究中选用含药血清被认为是一种能够较好模拟生理条件的策略。
根据中医理论指导下的临床实践，开发了骨疏康（GSK）颗粒用于治疗绝经后骨质疏松症（POP）。GSK颗粒在体内可防止卵巢切除术（OVX）小鼠的骨量丢失，抑制破骨细胞介导的骨吸收，并促进成骨细胞的骨形成4。因此，Li 等人12发现，GSK颗粒可通过增强钙敏感受体活性以促进骨形成，从而在OVX小鼠中发挥骨保护作用。为验证GSK颗粒的骨保护作用及其药理效应，本文作者提供了一套制备工作溶液及含药血清（GSK颗粒）的详细操作流程。此外，本文还描述了GSK颗粒在OVX诱导的骨质疏松小鼠模型中的应用，以及含GSK颗粒血清在体外破骨细胞/成骨细胞分化实验中的使用方法。
GSK颗粒由多种草药组成13,14，可轻易完全溶解于生理盐水中，因此以生理盐水作为溶剂。假手术小鼠（Sham）和卵巢切除小鼠（OVX）给予与颗粒给药组小鼠相同体积的生理盐水。小鼠GSK颗粒的等效剂量根据Meeh-Rubner方程15计算得出。该方程不仅有助于获得安全的剂量，还能确保药理效应15。GSK颗粒设置三个剂量组，具体如下：（1）GSKL：OVX + 低剂量GSK颗粒，2 g/kg/天；（2）GSKM：OVX + 中剂量GSK颗粒，4 g/kg/天；（3）GSKH：OVX + 高剂量GSK颗粒，8 g/kg/天。GSKL、GSKM和GSKH组小鼠通过灌胃给予GSK颗粒。以碳酸钙（600 mg/片）联合维生素D3（125 国际单位/片）作为阳性对照，例如一种已成熟上市的产品（如Caltrate [CAL]），用于骨质疏松症的治疗和预防。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;- MEM</td><td>Hyclone&lt;br/&gt; 实验室</td><td>SH30265.018</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>G5422</td><td>成骨分化</td></tr><tr><td>Caltrate（CAL）</td><td>Wyeth</td><td>L96625</td><td>动物干预</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>SLAC 实验室&lt;br/&gt; Animal Co. Ltd.</td><td>随机</td><td>动物准备</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td>细胞冻存</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sangon Biotech</td><td>60-00-4</td><td>样品处理</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>FL-24562</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>骨疏康颗粒</td><td>中国康成公司</td><td>Z20003255</td><td>中药处方</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus BX50</td><td>Olympus BX50</td><td>破骨细胞生成图像</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸酯硒酸氢盐水合物</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>成骨细胞生成</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI300B</td><td>破骨细胞与成骨细胞成像</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-25-10</td><td>破骨细胞生成</td></tr><tr><td>&amp;Mu;微计算机断层扫描</td><td>Scanco&lt;br/&gt; Medical AG</td><td>&amp;mu;CT80 射线显微断层扫描仪</td><td>骨结构分析</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Peprotech</td><td>11682-HNCHF</td><td>破骨细胞生成</td></tr><tr><td>Sprague Dawley</td><td>SLAC 实验室&lt;br/&gt; Animal Co. Ltd.</td><td>随机</td><td>血清采集</td></tr><tr><td>抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td>TRAP 染色</td></tr></tbody></table>

体内与体外实验用骨疏康颗粒（gsk）的制备

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

传统中药作为治疗多种疾病的替代方法，具有重要作用，例如用于治疗绝经后骨质疏松症（POP）。骨疏康（GSK）颗粒是中国已上市的处方药，具有防治POP的护骨作用。在给药前，通常需要进行标准制备处理，以促进药材中活性成分的释放，并增强其药理作用和治疗效果。本研究提出了一套详细的实验方案，用于在体外和体内实验中使用GSK颗粒。作者首先提供了适用于动物实验的颗粒剂剂量计算及配制方法，包括称量、溶解、储存和给药等步骤。其次，本文描述了微计算机断层扫描（micro-CT）及骨参数测量的实验流程，评估了样本制备、micro-CT仪器操作以及骨参数定量分析的具体方法。第三，制备含GSK颗粒的血清，并提取含药血清用于体外破骨细胞和成骨细胞分化实验。GSK颗粒以每日两次的频率经口灌胃给予大鼠，连续给药三天。随后采集血液，经离心、灭活和过滤处理。最后将血清稀释，用于破骨细胞生成和成骨细胞生成实验。本文所述方案可为中药复方制剂（如颗粒剂）的药理学研究提供参考依据。

Micro-CT 扫描结果表明，与生理盐水对照组小鼠相比，OVX 小鼠表现出显著的骨量丢失（图 1A）。GSK 颗粒干预治疗 90 天后，显著提高了骨密度（BMD），尤其是 GSKM 组（图 1B）。对骨结构参数（如 BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th）进行了定量分析。GSK 颗粒治疗可提高 BMD、BV/TV、Tb.N 和 Tb.Th，同时降低 Tb.Sp（图 1C）。
抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示，与对照组小鼠相比，OVX 小鼠的破骨细胞数量增加（图 2A）。GSK 颗粒处理组相较于 OVX 组，TRAP 阳性破骨细胞数量减少。通过计算 TRAP 阳性区域与骨小梁表面的比值（OCs/BS%）以及破...

本文提供了一种用于动物实验的骨疏康颗粒工作溶液以及用于体外实验的含骨疏康颗粒血清的详细制备方案。该方案可应用于中药及其复方在体内和体外药理研究中的相关实验。

体内与体外实验用骨疏康颗粒（GSK）的制备

传统中草药作为治疗多种疾病的替代方法发挥着作用，例如绝经后骨质疏松症（POP）。Gushukang ...

本方案有助于制备用于体内研究的颗粒工作溶液，以及用于体外实验的含颗粒血清。该技术的一个优点是，由于实验所用材料和动物成本较低，该方法可轻松重复。首先，将八克、十六克和二十四克的骨疏康（Gushukang，简称GSK）颗粒分别加入单独的50毫升离心管中。向每支试管中加入 48 毫升水，并振荡试管以彻底溶解颗粒。然后，将 1.6 片添加了维生素 D3 的碳酸钙片剂放入另一支 50 毫升试管中，加入 48 毫升生理盐水并振荡使其溶解。进行溶液灌胃给药时，首先用手轻轻但牢固地固定一只一个月大、雌性的 C57 Black 6 小鼠，持续 2 至 3 分钟。当小鼠安静后，用0.24毫升GSK颗粒的一种工作溶液润洗一支40毫米长、12号的灌胃针，将灌胃针从其口腔一侧插入小鼠体内，直至感到阻力，表明灌胃针已到达胃部。将全部工作溶液注入动物体内。然后撤出灌胃针，将小鼠放回笼中，同时对其他小鼠给予GSK处理，之后以同样方式向每只小鼠注入0.24毫升碳酸钙和维生素D3溶液。对于含GSK的血清采集，在通过灌胃向大鼠给予适当浓度的GSK后，于末次给予GSK颗粒1小时后确认其对脚趾夹捏无反应。切开腹部皮肤及腹膜，暴露腹腔至胸腔下缘。用纸巾清除腹主动脉周围的结缔组织，充分暴露血管，使用配备22号针头的10毫升注射器从主动脉抽取血液。将血液转移至无菌的15毫升离心管中，将管子直立放置于室温下30至60分钟。待血液凝固后，离心管子以分离血清，并将最多六只大鼠的全部血清转移至一个新的50毫升离心管中。在56°C水浴中灭活血清成分前，振荡管子以混匀血清。然后，使用孔径为0.22微米的亲水性聚醚砜注射器滤器过滤血清，并于-80摄氏度保存，可保存长达一年。进行体外破骨细胞生成实验时，将含GSK的血清按三种剂量分别用最低必需培养基（含L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷）以1:4的比例稀释。将每种稀释液各200微升加入96孔板中骨髓巨噬细胞培养物的每个孔中。随后，通过向每孔加入巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体，启动破骨细胞的生成。对于体外成骨分化，将两毫升含GSK的稀释血清加入24孔板中骨髓间充质干细胞培养物的每孔中。显微计算机断层扫描结果显示，与生理盐水对照组小鼠相比，卵巢切除小鼠表现出显著的骨量丢失。使用GSK颗粒干预治疗90天显著增加了骨髓密度，尤其是在中剂量GSK治疗的动物中。GSK颗粒治疗还可增加骨小梁数量、骨体积占总体积比以及骨小梁厚度，但减少了骨小梁之间的间距。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示，与对照组动物相比，卵巢切除小鼠的破骨细胞数量增加，而与卵巢切除组动物相比，GSK颗粒治疗可减少TRAP阳性破骨细胞的分化。含有GSK颗粒的血清与对照组动物采集的血清相比，也能减少TRAP阳性破骨细胞的数量。成功将针头插入腹主动脉对于确保从每只大鼠采集到足够体积的血液至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

古树康 (GSK) 颗粒的制备,用于 Vivo 和体外实验

恶性胶质瘤是一类具有显著临床和分子特征的高度侵袭性胶质肿瘤，其构成具有异质性。在临床前动物模型中，原位移植的原代异种移植瘤能够重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。...

原位胶质瘤原代异种移植模型重现浸润性生长及异柠檬酸脱氢酶I突变

本实验方案的目的是将干细胞归巢因子 SDF-1α 负载至硫酸葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒中。对所得颗粒的粒径、Zeta 电位，以及其中 SDF-1α 的含量、活性和 体外...

SDF-1α-壳聚糖-硫酸葡聚糖纳米颗粒的制备与表征

本文介绍了一种使用HEK293T细胞的低成本颗粒酶表达系统，该系统可产生高产量、高纯度、完全糖基化且具有酶活性的蛋白酶。...

一种高效且低成本的人类颗粒酶在哺乳动物细胞中的表达系统

在此，我们介绍二仙汤（EXD）的制备方法，包括四个步骤——浸泡、煎煮、过滤和浓缩，并演示将含有制备好的EXD的血清给予大鼠的操作。这些方法适用于 体内 和 体外...

中药制备：二仙汤及含二仙汤血清的制备 在体 内 和 体外 实验

本文介绍了一种将初始CD4+ T细胞分化为小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子产生型辅助性T（THGM）细胞的实验方案，包括初始CD4+...

体外诱导小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）产生型辅助性T细胞（THGM）的分化

我们此前曾使用金纳米颗粒-多肽杂合物通过静脉递送一种合成多肽——蛋白激酶C-δ抑制剂，该方法减轻了缺血-再灌注所致的急性肺损伤。本文展示了该药物制剂的详细方案。其他细胞内多肽也可采用类似方法进行制剂开发。...

使用金纳米颗粒配制蛋白激酶C-delta抑制肽

我们开发并描述了一种基于湿法纺丝概念的实验方案，用于构建以明胶为基础的生物材料，以应用于组织工程领域。...

基于湿法纺丝的明胶组织再生成型工艺

本方案描述了一种基于壳聚糖-京尼平的非乳液法微凝胶制备方法。这些微凝胶的尺寸可精确调控，并具有pH依赖性溶胀特性以及可降解性...

用于组织工程的尺寸可控且无乳液的壳聚糖-京尼平微凝胶的制备

本文描述了利用微流控装置进行高通量明胶甲基丙烯酰基微凝胶制备的实验方案，将微凝胶转化为可再悬浮粉末（微气凝胶），通过化学组装微凝胶形成颗粒状水凝胶支架，以及开发具有保留微孔结构的颗粒状水凝胶生物墨水用于3D生物打印。...

明胶甲基丙烯酰基颗粒水凝胶支架：高通量微凝胶制备、冻干、化学组装与三维生物打印

在此，我们介绍一种基因治疗策略，通过骨内注射将ABE包被的壳聚糖直接递送至骨髓。...

使用壳聚糖纳米颗粒包裹的腺嘌呤碱基编辑器质粒进行骨内注射以增强基因递送与表达

本文介绍了一种在相分离的巨大囊泡内简单的一锅法重建细胞骨架网络的方法。该方法具有普适性，可推广应用于多种生物大分子的包封或限域。...

体外在相分离的巨大单层囊泡（GUVs）内重建细胞骨架网络

学习制备古树康颗粒工作溶液用于体内实验及含药血清用于体外实验的方法。本方案成本低、易于重复，适用于中药药理学研究，支持骨代谢相关实验。

体内与体外实验用骨疏康颗粒（GSK）的制备

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