Name: 诱导BALB/c小鼠药物诱导的自身免疫性肝炎研究其致病机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 了解利用BALB/c小鼠建立药物诱导自身免疫性肝炎模型的方法，探索性别差异在疾病发病机制中的作用。该技术可重复性强，适用于研究药物性肝损伤机制及开发诊断策略。

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Njoku 博士希望感谢 Noel R. Rose 博士（医学博士、哲学博士），感谢他提供的指导和富有见地的讨论，这些促成了本模型的建立。

所有实验程序均经动物护理与使用委员会批准。
1. 肝脏S-100胞质蛋白或CYP2E1表位的三氟乙酰化
注意：首先制备三氟乙酰化的 S100（TFA-S100）和三氟乙酰化的 CYP2E1 抗原表位（TFA-JHDN5）。由于免疫需要同系型 S100 蛋白，且必须使用 BALB/c 小鼠来制备免疫原，因此需采用该品系小鼠。此制备方法可获得大量免疫原，建议每年进行约四次。制备 TFA-JHDN5 时采用完全相同的方法。CYP2E1 抗原表位（JHDN5），序列为 GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL，可通过测序获得或直接购买。
<ol>
	<li>肝脏S100组分的分离
	<ol>
		<li>在使用40–60 mg/kg氯胺酮与4–6 mg/kg赛拉嗪混合物对5–10只BALB/c小鼠进行镇静后，通过观察肌肉张力降低以及对疼痛刺激（如足趾夹捏，即缩足反射）无反应，同时伴随翻正反射和眼睑反射消失，确认麻醉深度适当。</li>
		<li>使用显微外科剪，沿中线切口暴露腹腔内容物，并在下腔静脉上做一小切口以清除血液。</li>
		<li>将24号套管针插入门静脉，以每分钟10 mL的速度在37°C水浴中用40 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）灌注肝脏 4 °C. 取出合并的肝脏并称重，切成小块（10 – 15 mm）。  
		注意：通过腹腔注射额外的氯胺酮/赛拉嗪（80 mg/kg : 8 mg/kg）实施安乐死，随后进行颈椎脱位，并打开胸腔以使肺脏塌陷。该方法可使动物遭受的疼痛和不适最小化。此操作方法符合美国兽医协会动物安乐死专家组提出的建议。</li>
		<li>加入4倍重量的蔗糖，加入含有Complete蛋白酶抑制剂混合片（见 材料表按照制造商的说明进行操作。在15 mL聚丙烯管中，使用普通实验室组织匀浆器在冰上以中等速度匀浆，直至匀浆液均匀细腻。在冰上匀浆以防止组织在匀浆过程中温度升高。</li>
		<li>将肝匀浆在1500 x g下离心 g 10分钟，然后倒出上清液。将上清液在100,000 x g条件下离心1小时。迅速冷冻上清液并储存在-80℃80 °C上清液为胞质S-100。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S100 和 JHDN5 的三氟乙酰化 
	注意：将根据 Satoh 的方法对 S-100 蛋白中赖氨酸残基的 ε-氨基进行三氟乙酰化处理18本实验的所有步骤，除透析的后期几天外，均在通风橱内进行。
	<ol>
		<li>使用二辛可宁酸法（BCA法）测定胞质S-100的总蛋白浓度7. 将20 mg BALB/c小鼠S100或JHDN5用dH2O稀释至10 mL2在50 mL锥形瓶中，用1 N KOH将pH调至10。</li>
		<li>加入4.7 mmol的S-乙基三氟硫代乙酸酯（S-ETFA）至溶液中。通过逐滴加入1 N KOH，将反应液pH维持在9.9–10.0，持续约1小时。记录每次反应所消耗的KOH总体积。</li>
		<li>将溶液分别转移至不同的透析盒中（切勿过满）。用 4 L 去离子水对透析盒进行透析，持续 72 h2O，每天更换三次。透析后，记录TFA-S100或TFA-JHDN5的最终体积，分装至已标记的离心管中。速冻后于–80 °C.</li>
		<li>通过将S100或JHDN5的初始量（以mg计）除以透析后的最终体积（mL），计算出估计浓度。为确定天然蛋白质的修饰百分比19，若天然蛋白和TFA修饰蛋白的终浓度大于1.0 mg，则用dH₂O将每种蛋白稀释至1.0 mg，并定容至1.0 mL2O 分别加入离心管中，并使用 1.0 mL dH₂O 制备空白对照2O. 如果经TFA修饰的蛋白质浓度低于1.0 mg，则无需稀释
		<ol>
			<li>为分离96孔板中的各孔，加入 50 µL 空白、天然及修饰蛋白的 50 µL 4% NaHCO₃3 随后 50 µL 每孔加入0.1% 2,4,6-三硝基苯磺酸。</li>
			<li>在培养板中孵育 40 °C 孵育2小时后，加入 50 µL 向每个孔中加入 10 % SDS 溶液，随后 25 µL 1 N HCl</li>
			<li>在 334 nm 处读取 OD 值，然后记录每种化合物在 200–600 nm 范围内的吸光度，以确认在 334 nm 处吸光度的特征性下降。使用以下公式计算 TFA 对赖氨酸残基的修饰百分比： 
			<img alt="蛋白质修饰计算公式；修饰蛋白与天然蛋白的光密度比值" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫小鼠以诱导肝炎
注意：通过使用三氟乙酰氯（TFA）——一种模型药物代谢物——共价修饰的肝脏胞质蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，建立DIH模型，即TFA-S1006 或由三氟乙酰基（TFA）共价修饰的CYP2E1表位9，TFA-JHDN5可诱导肝炎、自身反应性T细胞及CYP2E1自身抗体。小鼠在初次免疫后2周出现脾脏活化期，3周时进入以粒细胞炎症为特征的肝脏期。在该模型中，雌性BALB/c小鼠比雄性更易感肝炎。
<ol>
	<li>第0天，在颈背部皮下接种6–8周龄的BALB/c小鼠 200 μg TFA-S100 的 100 µg 用等体积的完全弗氏佐剂（CFA）乳化的TFA-JHDN5。在第0天，通过后肢肌肉注射50 ng百日咳毒素对小鼠进行免疫。在第7天，于尾根部皮下注射对小鼠进行免疫，注射物为 200 μg TFA-S100 的 100 µg 将TFA-JHDN5与等体积的CFA乳化，以确保每只小鼠接受两次相同免疫原的注射。 
	注意：免疫后前6小时内应每小时监测小鼠一次，之后至少每天两次，持续一周。若小鼠出现疼痛或痛苦迹象（如弓背姿势或毛发竖立），应根据当地动物护理与使用委员会（ACUC）规定给予镇痛剂。若观察到明显疼痛或痛苦，应由兽医进行评估，以确定是否需要实施安乐死。</li>
	<li>利用流式细胞术检测CD4+ T细胞对完整自身蛋白、自身蛋白表位或TFA半抗原的免疫应答
	<ol>
		<li>在通过腹腔注射每公斤体重40-60 mg氯胺酮与每公斤体重4-6 mg赛拉嗪混合物对小鼠进行镇静后，按照步骤1.1.1所述确认麻醉深度，随后使用显微外科剪暴露腹腔并识别脾脏。在脾蒂处切断脾脏，并将其置于含有PBS/2%胎牛血清（FCS）的培养皿中。 
		注意：通过腹腔注射额外的氯胺酮/赛拉嗪（80 mg/kg : 8 mg/kg）对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位，并打开胸腔以使肺脏塌陷。该方法可使动物承受最少的疼痛与不适，符合美国兽医医学协会安乐死专家组提出的建议。</li>
		<li>使用磨砂玻璃片释放细胞，并转移至50 mL圆锥形聚丙烯管中。用PBS/2% FCS洗涤，加液体至50 mL，335 x g离心 g 使用台式冷冻离心机。弃去上清液，并重复此步骤。</li>
		<li>使用1 mL ACK裂解缓冲液裂解红细胞1分钟，然后用PBS/2% FCS定容至50 mL。335 × g离心 g 弃去上清液。</li>
		<li>计数细胞。按照制造商说明书，在冰上避光条件下用CFSE标记细胞30分钟。将单细胞悬液悬浮于6孔板中，每孔3x10⁶个细胞。6 每孔细胞数为 cells/mL，溶于 PBS/2% FCS 中。</li>
		<li>用 CYP2E1、JHDN5 或 TFA-OVA 刺激标记细胞（10 µg/mL72 小时 37 °C 在5% CO₂中2，95% 空气（加湿）。孵育后，将细胞在冰上用 CD4-APC（1:100）染色 30 分钟，并在 3 天内通过流式细胞术分析。</li>
		<li>采用以下设门策略鉴定 CD4+CFSE+ 细胞：从圈选的活细胞中鉴定 CD4+CFSE+ 细胞，并以增殖细胞的直方图形式展示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从免疫小鼠中分离浸润性免疫细胞 
	<ol>
		<li>在第14天或第21天分离肝脏中浸润的免疫细胞时，通过腹腔注射每公斤体重40–60 mg的氯胺酮与每公斤体重4–6 mg的赛拉嗪混合物麻醉小鼠，并按照步骤1.1.1所述确认麻醉深度。按照1.1.2所述，使用显微外科剪刀做正中切口进行剖腹手术后，用25号针头插入股静脉，然后在肾静脉下方剪断下腔静脉。</li>
		<li>在水浴中以 10 mL/min 的流速用 40 mL 磷酸盐缓冲液灌注每块肝脏 37 °C灌注后，使用显微外科剪刀在肝门处切断肝蒂，移除胆囊，然后在肝门处将肝脏剪下。</li>
		<li>使用20 mL无菌注射器冲头和冷PBS，通过不锈钢网筛破碎肝脏。将所得细胞悬液经300目筛网过滤至50 mL预灭菌离心管中。用冷PBS将每管悬液补至50 mL，随后在370 × g离心10分钟，洗涤细胞悬液。</li>
		<li>弃去上清液，然后按处理组将每个沉淀物收集到新的50 mL离心管中（建议每只小鼠使用一管；但如果合并样本，建议每管放入2–4个沉淀物）。将合并后的沉淀物重悬于45 mL 35% Percoll（溶于PBS中）并加入100 IU/mL肝素。</li>
		<li>500 × g 离心 10 分钟，温度设为 20 °C弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL PBS中，然后向每份沉淀中加入1 mL ACK裂解缓冲液，冰上孵育10分钟。</li>
		<li>用 PBS 将每管体积补至 50 mL，于 370 × g 离心 10 分钟进行洗涤。弃去上清液，再用 PBS/2% FCS 重悬细胞，于 370 × g 离心 10 分钟洗涤。计数细胞。</li>
		<li>使用流式细胞术分析细胞类型 
		注意：以下是检测诱导型 Foxp3+Treg 的一个示例方法。
		<ol>
			<li>孵育 1x106 使用FcR封闭试剂处理细胞，并在冰上用CD4-FITC、CD25-PE和CD45-PerCP（均按1:100稀释）染色30分钟。随后，对细胞进行FoxP3-APC胞内染色。</li>
			<li>用固定剂固定细胞 250 µL 固定缓冲液（参见 材料表），并于 4 °C 在3天内进行流式细胞术分析。</li>
			<li>建议采用以下设门策略，通过流式细胞术检测来自肝脏、脾脏或淋巴结的单细胞悬液中诱导产生的Foxp3+调节性T细胞：首先使用Live/Dead可固定Aqua死细胞染色试剂盒鉴定活细胞。接着，在CD45+（PerCP，克隆号RA3-6B2）肝细胞中设门，并从CD45+细胞门中圈选CD4+细胞（FITC，克隆号GK1.5）。然后从CD4+细胞中分析CD25+（PE，克隆号7D4）和Foxp3+（APC，克隆号3G3）细胞所占百分比。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝炎肝组织的组织学分析
	<ol>
		<li>第21天，固定肝组织切片（5 µm 在10%中性缓冲福尔马林中固定（厚度）并用苏木精染色 &amp;伊红</li>
		<li>首先在低倍镜（40X）下观察约2个视野进行组织学评分，并在64X下确认。组织切片评分标准如下：0级＝无炎症或坏死；1级＝轻度小叶炎症，无坏死；2级＝小叶炎症累及 &lt;50%的区域；3级=小叶炎症累及≥50%的区域；4级=伴有坏死的炎症。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脾脏和肝脏组织中细胞因子水平的测定 
	<ol>
		<li>在第14天或第21天，取每只小鼠的肝脏或脾脏组织样本（1 g），加入1 mL RPMI/2% FCS，使用普通实验室匀浆器在中等速度下匀质至均匀。样本需保持低温，置于冰上。</li>
		<li>将匀浆在 1455 × g 条件下离心 15 分钟 4 °C 使用冷藏台式离心机。将上清液迅速冷冻，并于 -80 °C 直至准备使用。根据试剂盒说明书，使用商用ELISA试剂盒检测细胞因子和趋化因子水平。通过将细胞因子水平（以mL或 µL) 每克组织皮克数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测血清中抗CYP2E1抗体、CYP2E1表位JHDN5及TFA药物代谢物的抗体。
	<ol>
		<li>在第14天或第21天，使用40–60 mg/kg的氯胺酮与4–6 mg/kg的赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。通过观察肌肉张力降低以及对疼痛刺激（如脚趾夹捏，即缩足反射）无反应，同时伴随翻正反射和眼睑反射消失，确认麻醉深度合适。使用连接结核菌素注射器的25 G针头，从肋骨下方、紧邻剑突外侧处缓慢刺入胸腔接近心脏，通过心脏穿刺采集血液。</li>
		<li>血液采集后，于室温静置使其凝固。将血液样本在295 x g 室温孵育20分钟。小心移除血清，将血清分装后于-80℃迅速冷冻20 °C.</li>
		<li>应用 100 µL CYP2E1、JHDN5 或 TFA-卵清蛋白（OVA）测试抗原（5 µg/mL 在 PBS 中孵育至 96 孔板，至少 18 小时 4 °C 过夜。次日用洗涤缓冲液（PBS/2%FCS）洗涤平板，共2个循环（每个循环洗涤4次）。</li>
		<li>应用 100 µL 在平板中加入小鼠血清（1:100稀释于PBS/2% FCS中），每孔三复孔，室温孵育2小时。2小时后，按照步骤2.6.2所述用洗涤缓冲液洗涤平板。</li>
		<li>添加 100 µL 碱性磷酸酶（AKP）标记的羊抗小鼠IgG、AKP标记的大鼠抗小鼠IgG1或AKP标记的大鼠抗小鼠IgG2a二抗（1:1000）孵育2小时，随后用洗涤缓冲液洗涤1个循环，再用PBS洗涤1个循环。使用AKP底物试剂盒检测抗体信号，每隔15分钟在分光光度计上测定405 nm处的吸光度。TFA通常在15分钟内完全显色，而CYP2E1及CYP2E1表位的显色时间则为30至60分钟。7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>JHDN5 IgG诱导的氧化应激体外发育研究
	<ol>
		<li>使用12孔板，孵育106 每孔纤维连接蛋白包被的盖玻片上终末分化的肝细胞 1000 µL Williams E 培养基，添加谷氨酰胺和通用补充剂（参见 材料表在 37 °C，5% CO₂2，95% 湿度条件下培养 7 天，以最大程度提高 CYP2E1 活性。</li>
		<li>分别向不同孔中加入 JHDN5 IgG (1:40) 或小鼠 IgG (1:1000)，于室温孵育 2 h 37 °C，5% CO₂2，95% 湿度。杂交瘤血清非常稀释。加入深红色荧光抗体检测剂（参见 材料表向所有孔中额外加入）30 分钟。</li>
		<li>在避光条件下，用 1 mL PBS 洗涤孔板 3 次。用 3.7% 甲醛固定细胞 10 分钟。在 24 小时内使用共聚焦显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外JHDN5 IgG与线粒体等细胞器的共定位研究. 
	<ol>
		<li>为了证明JHDN5 IgG与线粒体的共定位，将终末分化的肝细胞以较低密度接种于纤连蛋白包被的盖玻片上，在不含染料的Williams’s E培养基中培养7天，培养基按步骤2.7所述条件进行补充。</li>
		<li>在确定正确的吸收波长后，加入绿色荧光、488 nm 标记的小鼠 IgG 或 JHDN-5（1:100）以及红色荧光、594 标记的 Mito-tracker Red（1:100），孵育 2 小时37 °C)，5% CO₂2，95% 湿度。</li>
		<li>将标记的纤维连接蛋白包被的盖玻片用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，通过共聚焦显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通用实验方案说明
<ol>
	<li>当化合物无临床使用剂型时，可使用非药品级试剂。然而，本方法中所述的各类试剂均需从可靠的商业供应商处获取。所用化学品应符合美国化学会分析试剂委员会规定的标准，至少达到试剂级纯度；在本实验方法中，应尽可能使用分析纯级别的试剂。</li>
	<li>在制备三氟乙酸（TFA）修饰蛋白时，须严格遵循无菌操作技术，以防止污染，避免对动物福利或实验数据的解读造成不利影响。</li>
	<li>非药品级试剂的储存和使用时间应根据现有技术资料确定，确保其在有效期内保持活性。完全弗氏佐剂（CFA）于室温保存；CYP2E1 及其表位肽保存于 -20 或 -80 °C；TFA 修饰蛋白保存于 -80 °C，并在与 CFA 乳化前置于 4 °C 解冻；为避免反复冻融，TFA 修饰蛋白应分装保存于 -80 °C。</li>
</ol>

<ol><li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune+liver+disease%3A+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本方案的优势在于其可重复性，因此严格遵循建议的步骤至关重要。免疫原的制备对某些研究者而言可能构成障碍，但我们已使用本文所述表位成功复制了我们的模型，从而无需分离肝脏中的S100组分。很可能其他表位或蛋白质经修饰后亦可在免疫后诱导肝炎；然而，本文仅描述我们已验证并获得可靠结果的蛋白质。已有研究表明，多种蛋白质在接触卤代麻醉药后可发生三氟乙酰化。最可能由于表位扩散现象，其中一些蛋白质在其天然、未三氟乙酰化的状态下也成为自身抗体的靶标。例如，丙酮酸脱氢酶复合体的E2亚单位（PDH-E2）携带的表位（硫辛酸辅基）在结构上与TFA-加合物中的TFA基团具有相似性。研究已证实，氟烷性肝炎患者体内产生的抗体可与TFA-蛋白质和PDH-E2发生交叉反应20,21。
我们的DIH模型需要在小鼠背部进行两次用完全弗氏佐剂（CFA）乳化的免疫接种。已知使用CFA进行足垫注射与小鼠的疼痛和痛苦相关。因此，实验性DIH模型的建立包含了多次实验尝试。当我们评估仅使用一次CFA免疫、第二次免疫使...

本方法旨在描述一种药物诱导的自身免疫性肝炎的小鼠模型，该模型可在体内形成，并展示如何利用该模型研究该疾病的分子、免疫学和遗传学基础。我们研究的长期目标是通过研究易感患者中的药物诱导性肝炎（DIH），揭示导致慢性肝炎症和肝损伤的机制。肝病和肝硬化是25至64岁成年人死亡的第六大常见原因。特发性药物性肝损伤（DILI），有时称为药物诱导性自身免疫性肝炎（DIH），是美国急性肝衰竭的第三大常见原因。DIH是最常见的肝脏药物诱导性高敏反应，在约9%至12%的自身免疫性肝炎患者中被观察到1。绝大多数DIH患者为女性2,3,4。在易感个体中，使用卤化挥发性麻醉剂（如异氟烷、七氟烷、地氟烷或氟烷）后可引发一种类型的DIH。这些麻醉剂通过其代谢产物的活性物质共价结合于肝脏蛋白，从而形成新的自身抗原，能够诱发过敏或自身免疫反应5。
由于缺乏能够密切模拟人类疾病诱导过程的动物模型，此前对麻醉药及相关形式的药物性肝损伤（DIH）发病机制的研究一直受到阻碍。我们已建立一种实验性小鼠DIH模型，其特征与患者中免疫介导的药物性肝损伤（DILI）相似。通过使用经三氟乙酰氯（TFA）代谢物共价修饰的两种自身抗原之一进行免疫，可诱导肝炎。该TFA代谢物是在麻醉药经细胞色素P450 2E1（CYP2E1）酶氧化代谢后形成的5。其中一种自身抗原是肝细胞质S100肝组分，其为多种蛋白质的混合物6；另一种自身抗原是CYP2E1的一个表位，可被患有麻醉药免疫介导型DILI患者的血清所识别7。我们采用相对抵抗实验性自身免疫性肝炎的BALB/c小鼠，从而使本模型区别于在C57Bl/6J小鼠中建立的S100诱导的自身免疫性肝炎免疫模型8。
由于药物性肝损伤（DIH）具有多样的临床表现，因此在患者中研究该疾病十分困难。转化性实验模型能够实现在体内和体外评估疾病的发病机制。目前尚无其他替代方法可在不使用动物的情况下，全面研究体内或体外的适应性或固有免疫应答来诱导DIH。此外，由于S-100或CYP2E1表位的三氟乙酰化似乎不会产生刺激性免疫原，我们通过使用TFA修饰的蛋白质进行免疫来诱导DIH，因此这些动物在免疫或其他操作之前不会接受乙醚、任何卤化麻醉剂、巴比妥类药物或酒精，因为这些试剂可能改变我们正在研究的参数。尽管如此，我们已通过利用计算机模拟确认所发现的CYP2E1表位的结合偏好，从而减少了小鼠的使用量9，并通过证明雌性BALB/c小鼠比雄性更易发展为更严重的DIH，模拟了人类DIH中女性更易受累的特征10。
尽管药物性肝损伤（DIH）在患者中的临床表现多样，且临床疾病研究存在诸多挑战，但活性药物代谢物对天然蛋白质的翻译后修饰仍是公认的导致卤化麻醉药引发DIH的关键致病机制11。研究者也普遍认为，CYP2E1是该过程中主要的自身抗原12,13。白细胞介素（IL）-4上调的CD4+T细胞可识别翻译后修饰的CYP2E1及其他肝脏蛋白，进而募集中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞进入肝脏，这一机制已被广泛接受为麻醉药诱导DIH的启动因素14，并在多种类型的DIH中得到证实15,16。诱导型表达FoxP3的CD4+CD25+T细胞（Tregs）可减轻DIH的严重程度，而脾脏中此类细胞的相对缺乏则会加重DIH 10,7。因此，目前对DIH机制的大多数研究进展均依赖于利用体内小鼠模型，在体内外系统评估其遗传、代谢及免疫学机制。
由于我们及其他研究者在使用不同小鼠模型研究药物性肝损伤（DIH）的启动机制时，发现了IL-4、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的作用，因此我们认为该观察结果支持我们的观点：无论采用何种DIH模型，肝炎和肝损伤均由IL-4诱导。本方案的优势在于采用了体内实验方法，同时使用雄性和雌性小鼠，并重复进行组织学检查、CD4+ T细胞增殖实验及细胞因子检测。体外研究的优势在于可在减少实验动物使用数量的同时，提供用于分离驱动DIH的细胞间相互作用的方法学手段。我们建议同时使用雄性和雌性小鼠，因为这有助于降低结果解读中无意识偏倚的可能性，并增强研究结果的转化潜力，因为DIH在女性中的发病率、患病率和严重程度均更高17。建议从小鼠供应商处统一获取实验动物；若无法实现，则应从同一供应商处获取同窝对照小鼠或野生型小鼠，与基因修饰小鼠配套使用。

<table><tbody><tr><td>0.1% 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP底物试剂盒</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 小鼠</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&amp;trade; CFSE 细胞增殖检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>贝克顿·迪金森（Difco Bacto）</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>FcR封闭试剂</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>通用补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&amp;trade; 细胞冻存</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>活/死可固定Aqua死细胞染色试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>默克生命科学</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>List Biologicals</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH 7.4</td><td>各种</td><td></td><td></td></tr><tr><td>皮尔斯&amp;trade; 蛋白酶抑制剂小片剂，无EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-乙基三氟硫代乙酸酯（S-ETFA）</td><td>默克生命科学</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer透析盒（10 K，12 ml）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&amp;trade; 10% SDS 溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams E 培养基，不含酚红</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

在balb/c小鼠中诱导药物诱导型自身免疫性肝炎以研究其致病机制

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

药物诱导的自身免疫性肝炎（DIH）是自身免疫性肝炎患者中约9%至12%所观察到的最常见的肝脏药物诱导性超敏反应过程。DIH患者中绝大多数为女性。由于缺乏模拟人类疾病的动物模型，这种患病率性别差异的潜在机制尚不明确。尽管如此，人们普遍认为这些机制与人类白细胞抗原单倍型及性激素有关。相比之下，利用DIH小鼠模型，我们发现IL-4启动的&#160;CD4+ T细胞针对细胞色素P450 2E1（CYP2E1）的一个表位，可诱导中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞浸润到雌性BALB/c小鼠的肝脏中。利用该模型，我们还发现IL-33诱导的FoxP3+调节性T细胞可在雌性和雄性小鼠中提供对DIH的保护作用。该DIH模型通过使用与DIH相关的药物代谢物共价修饰的CYP2E1表位免疫小鼠而建立。该表位可被DIH患者所识别。我们的方法可诱导出强烈且可重复的肝炎及自身抗体，可用于研究DIH的发病机制。尽管体内研究若操作不当可能给小鼠带来不必要的疼痛和痛苦，但其优势在于能够在大量小鼠中评估疾病的发生机制。此外，可通过侵入性操作研究被修饰肝脏蛋白的生物学效应。在实验设计中加入体外研究，可实现快速重复和细胞水平的机制分析。因此，我们将展示本研究的模型方案及其在研究DIH体内和体外机制中的应用。

用于诱导药物性免疫性肝炎（DIH）的免疫程序如图1所示，包括在颈部基部（第0天）和尾部基部（第7天）进行的两次免疫。 图2展示了在第14天使用CFSE检测对CYP2E1、JHDN5、CYP2E1表位以及麻醉药的三氟乙酰（TFA）代谢产物所产生的代表性增殖数据。 图3展示了第14天诱导产生的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞（Tregs）的设门策略及代表性流式细胞术分析结果。 图4展示了第21天苏木精-伊红染色的代表性切片，显示肝炎的进展情况6。 图5展示了第21天雌性与雄性BALB/c小鼠肝脏组织的苏木精-伊红染色代表性切片，显示雌性小鼠肝炎更为严重，并展示了这些肝脏组织中细胞成分的比较10。 图6...

我们描述了一种在BALB/c小鼠中建立的体内免疫、可转化的肝炎模型，可用于研究药物诱导的自身免疫性肝炎的发病机制，包括该疾病中观察到的性别差异。我们将阐述如何利用该模型通过体内和体外实验技术实现可重复的分析。

在BALB/c小鼠中诱导药物诱导型自身免疫性肝炎以研究其致病机制

药物诱导的自身免疫性肝炎（DIH）是药物诱导的肝内超敏反应中最常见的过程，在约9%至12%的患者中可观察到……

肝病和肝硬化是25至64岁成年人死亡的第六大常见原因。特发性药物性肝损伤（DILI），有时也称为药物诱导性、自身免疫性或免疫介导性肝炎，是美国急性肝衰竭的第三大常见原因，也是最常见的药物诱导性肝脏低敏反应过程。该过程发生在约9%至12%的自身免疫性肝炎患者中，而这种类型的肝炎也是导致药物撤出商业市场的最常见原因。绝大多数药物性肝炎患者为女性。本方案描述了患者中常见的关键特征，如肝炎、自身抗体以及性别差异。该技术的主要优势在于其在活体小鼠模型中的可重复性，使科研人员能够观察疾病的发生及其后续发展。通过该方案，我们发现麻醉药和病毒性肝炎中存在一个共同的表位，该表位在麻醉药性肝炎患者中占主导地位，并且与病毒性肝炎患者的肝纤维化显著相关。我们认为，这些信息可用于开发针对药物性或病毒性肝炎及其相关纤维化的特异性诊断检测方法，有望预测易患此类疾病或其后遗症的个体。书面描述的技术细节可能令人感到繁复，因为我们始终采用多种核查与平衡措施，以确保实验结果的可重复性。首次进行该实验时，请预留充足的时间。完成第一次操作后，后续实验进程会明显加快。在对 BALB/c 小鼠实施安乐死后，使用显微外科剪刀沿中线切口暴露腹腔内脏器，并在下腔静脉处做一小切口以清除血液。然后将24号套管针插入门静脉。将磷酸盐缓冲液（PBS）置于4摄氏度水浴中，并使用蠕动泵以每分钟10毫升的速度灌注40毫升PBS冲洗肝脏。用显微剪刀小心地将肝脏从腹腔中分离，并将肝脏置于已去皮重的称量舟中称重。将肝脏切成10至15毫米的小块。将肝组织样本和匀浆缓冲液（缓冲液体积为小鼠肝脏重量的4倍）加入15毫升聚丙烯管中，并根据文章要求加入完全蛋白酶抑制剂混合片剂。使用普通实验室组织匀浆器，在冰上以中等速度匀浆，直至样品均匀细腻。将肝脏匀浆在1,500 × g条件下离心10分钟，倾出上清液胞质组分S100。再次在100,000 × g条件下离心后，用干冰迅速冷冻上清液胞质组分S100，并将试管置于-80摄氏度冰箱中冷冻保存。开始三氟乙酰化前，在室温下解冻S100。然后，在锥形瓶中，将20毫克小鼠S100用去离子水稀释至10毫升。使用pH计，用1 N氢氧化钾将pH值调节至10。在通风橱中，向溶液中加入4.7毫摩尔的S-ETFA。通过逐滴加入1 N氢氧化钾，将pH值维持在9.9至10.0之间，持续约一小时。记录每次反应中氢氧化钾的总体积。将溶液分别转移至透析盒中。将透析盒置于4升去离子水中透析72小时，每天换水三次。透析后，记录三氟乙酰化 S100 的最终体积，然后分装至带标签的离心管中。将离心管在干冰中速冻，并于负80摄氏度保存。根据文稿确定蛋白质浓度，若浓度大于1毫克/毫升，则在各自的PCR管中，向1毫升去离子水中分别加入1毫克的天然蛋白和TFA修饰蛋白。使用1毫升去离子水在子弹管中制备空白样。在96孔板中，每孔分别加入50微升空白样、天然蛋白和变性蛋白，每个样本设两个复孔。然后，每孔依次加入50微升4%碳酸氢钠溶液和50微升0.1% 2,4,6-三硝基苯磺酸溶液。将培养板在 40 摄氏度下孵育两小时。孵育结束后，向每孔中加入 50 微升 10% SDS，随后加入 25 微升 1-当量盐酸。在对小鼠进行免疫和麻醉后，使用显微外科剪刀暴露腹腔。识别脾脏。在脾蒂处切断脾脏，并将其置于含有2%胎牛血清的PBS的培养皿中。为释放细胞，将脾脏夹在两片磨砂玻璃片之间并相互摩擦。使用电子移液器将细胞转移至一个50毫升的圆锥形聚丙烯管中。洗涤时，向管中加入含有2% FCS的PBS，使总体积达到50毫升，然后使用台式冷藏离心机在335 × g条件下离心。倾去上清液，并重复洗涤步骤一次。加入1毫升ACK裂解缓冲液至试管中，洗涤1分钟以去除红细胞。然后重复使用含FCS的PBS洗涤步骤。用CFSE标记细胞30分钟后，向标记细胞中加入10微克/毫升的细胞色素P450 2E1、JHDN5或三氟乙酰化卵清蛋白，在37摄氏度培养箱中刺激72小时。孵育后，在冰上用别藻蓝蛋白标记的CD4以1:100的比例染色细胞30分钟。按照文中的描述对免疫小鼠进行剖腹手术后，用25号针头插入股静脉，然后在肾静脉下方剪断下腔静脉。在37°C水浴中，以每分钟10毫升的流速，用40毫升PBS灌注每份肝脏。灌流后，使用显微外科剪刀在肝门处切断肝脏，去除胆囊，然后在肝门部再次切割肝脏。将肝脏置于300目不锈钢筛网上，用20毫升无菌注射器活塞和冷PBS研磨破碎肝脏组织。通过筛网将所得的细胞悬液过滤至50毫升预灭菌离心管中。用预冷的PBS将每种悬液补至50毫升，然后在370 × g条件下离心10分钟进行洗涤。弃去上清液，将沉淀合并至新的50毫升离心管中。用含35% Percoll、PBS及100国际单位/毫升肝素的溶液45毫升重悬合并后的沉淀。随后，在20°C条件下，以500 × g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 5 毫升 PBS 中，然后向每份沉淀中加入 1 毫升 ACK 裂解缓冲液，冰上孵育 10 分钟。再次通过 370 × g 离心用 PBS 洗涤后，弃去上清液，再用含 FCS 的 PBS 通过离心（370 × g，10 分钟）洗涤细胞。使用电子血细胞计数仪对细胞进行计数。本实验中，CD4+T 细胞免疫应答通过流式细胞术进行检测。第14天使用CFSE检测到针对三氟乙酰化代谢物、细胞色素P450 2E1以及细胞色素P450 2E1表位JHDN5的代表性增殖数据。未加抗原的孔作为对照。与对照组相比，BALB/c小鼠对三氟乙酰化卵清蛋白和细胞色素P450 2E1产生增殖反应，但对JHDN5无增殖反应。在用完全弗氏佐剂乳化的TFA免疫后三周，与雄性BALB/c小鼠相比，雌性BALB/c小鼠更易发生药物诱导的自身免疫性肝炎。肝脏组织的组织学分析也显示，雌性小鼠的肝炎炎症程度比雄性小鼠更为严重。雌性小鼠肝脏中CD4+CD8+NK+和NKT+细胞的数量显著高于雄性小鼠。尽管这些小鼠之间的B细胞未见差异，但请记住，尽管操作耗时较长，该配方可长期保存。此步骤也可用于对表位进行三氟乙酰化。该方法使研究人员能够解析肝脏疾病发展的时程，并提高了发现新蛋白质和信号通路的潜力。S-乙基三氟硫代乙酸酯有毒，应在通风橱中操作。此外，强烈建议遵循良好的实验室规范和操作技术。

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