远程实验室管理：呼吸道病毒诊断

近期寨卡病毒和埃博拉病毒等疫情的增加凸显了全球范围内需要更加协调和灵活的应对措施。为实现这一目标，我们设计了一种创新的、可扩展的、模块化实验室单元，可在全球资源有限地区发生疫情时使用。本文介绍了我们开发的模块化、可扩展、移动式集装箱实验室。

在接下来的论文中，我们介绍了用于呼吸道流感病毒诊断的BSL-2和BSL-3实验室方法。通过RT-PCR技术实现流感病毒的快速诊断。在准备进入已安装的实验室单元之前，请注意必须满足所有BSL-2级别的安全要求。

这包括穿戴适当的个人防护装备、洗手、戴手套，以及对计划使用的任何工作区域进行去污处理。注意，如果使用漂白剂对工作区和物品进行去污，则还必须使用70%乙醇清洁所有接触过漂白剂的区域，因为漂白剂可能与工作区内的其他化学物质混合产生有毒气体。所有含漂白剂的废弃物应丢弃至专门指定的废物容器中。

采集患者样本拭子后，需将其从现场或诊所运送至实验室，并通过传递窗交予实验室技术人员。该传递窗无法从两侧同时开启。在生物安全二级（BSL-2）级别的传递窗中，盛放样本的试管外表面必须用漂白剂彻底消毒，并静置两分钟。

打开传递窗，收集待登记的样本。擦拭样本表面残留的漂白剂，并用漂白剂擦拭传递窗内部，随后用70%乙醇溶液擦拭。为每个样本管以及指定用于分装的四个空管添加条形码。

将样品转移至通风橱。扫描每支试管上的条形码，并确保相应的样品识别信息显示在平板系统或笔记本电脑屏幕上。完成注册流程。

样品分装。试管标记完成后，使用经过认证且已去污染的II级生物安全柜对样品进行分装。分装时，务必为每个样品使用新的无菌或一次性移液器，并将其丢弃至生物危害废物容器中，以避免交叉污染。

确保每个试管都已紧密密封。每个样本使用一份等分试样进行立即提取。其余等分试样应储存于冷冻箱中以备后续使用。

在移至工作台之前，先用漂白剂清洁所有工作区域表面和设备，随后再用70%乙醇溶液擦拭。当您的条形码PCR样本完成分装后，将其转移至指定用于提取的工作台。为裂解步骤配制缓冲液AVL与载体RNA的混合液。

样品与裂解缓冲液的主混合液应置于室温保存。标记一个1.5毫升离心管。将移液器枪头设置为560微升。

使用干净的移液器吸头。向每根试管中加入裂解缓冲液。将吸头丢弃至废液容器中。

接下来，取你的PCR分装样品，将其加入指定用于第一份分装样品的预装裂解缓冲液管中，并对其他样品重复此操作。弃去已使用的移液枪头，换上新的洁净枪头。

使用干净的移液器吸头，向对照管中加入 140 微升缓冲液。将各管盖紧。

脉冲涡旋15秒。如有其他等分试样或样品，重复此步骤。每个样品微型离心5秒。

室温孵育10分钟。10分钟后，短暂离心各管，以去除每管管盖内侧的液滴。向样品一中加入560 µL乙醇。

更换移液器吸头。对任何剩余或额外的样本重复上述操作。确保每个样本管盖紧。

每个样品脉冲涡旋15秒。将样品以微量离心机离心5秒。取一支干净的2毫升收集管。

加入离心柱。标记离心柱以对应您的样品。将 630 微升样品转移至相应的离心柱中。

盖紧管盖，转移到离心机中，将样品均匀分布在离心机内。

在6000 ×g 下离心1分钟，以去除裂解缓冲液。返回工作台，更换收集管。

加入剩余的裂解缓冲液，并重复离心步骤。弃去原始的分装样品管，随后弃去流出液，并用缓冲液 AW1 洗涤离心柱。对每个样品或任何额外样品重复此操作。

盖紧每个样品的管盖，在6 ×g 条件下离心。再用第二种洗涤缓冲液AW2在20 ×g 条件下重复离心。最后，将柱子放入一支干净的1.5毫升离心管中。

打开层析柱，加入60 µL缓冲液AVE。室温孵育1分钟，然后以6 ×g离心1分钟。样品现可进行PCR分析。

在BSL-3条件下，实验方案将保持不变，但安全措施优先于一切。进入BSL-3实验室前，应通过透明窗口观察，确认手套箱单元内已建立负压。当墙上压力指示球可见时，表明负压已经建立。

建立负压后，打开门进入舱室。立即洗手，然后进行个人防护装备（PPE）检查。按以下顺序穿戴个人防护装备：内层手套、防护服、鞋套、口罩、面罩、外层手套。

打开设备，使手套箱内的压力稳定。使用含氯漂白剂喷雾溶液对计划在手套箱内外使用的区域和物品进行去污处理。所有含氯漂白剂废弃物应弃置于专用的含氯漂白剂废液容器中。

使用70%乙醇溶液清洁所有使用过漂白剂的区域。通过传递窗转移样本。在BSL-3实验室内部接收样本前，样本应在传递窗内喷洒漂白剂溶液，并静置至少一分钟。

接下来，在BSL-3实验室单元内接收样本，并在进入登记和标记步骤前彻底清洁样本。样本登记完毕且试管标记完成后，通过气闸托盘将样本放入手套箱中。切勿同时打开两扇门。

出于安全考虑，应分两个步骤打开和关闭每扇门。将样品安全转移至手套箱内部后，按照此前所述的相同步骤在手套箱内制备样品分装。样品分装完成后，将样品转移至密闭容器中。

在手套箱内喷洒漂白剂溶液，以对离心管及所有其他表面进行去污染。静置五分钟，然后使用70%乙醇溶液清洗漂白剂残留。彻底去污染后，仅将PCR分析所需的样品移回手套箱内进行裂解步骤。

在手套箱内仅进行提取流程的裂解步骤。细胞裂解完成后，将每个样品的盖子拧紧，并放入加压气闸通道中。再次使用漂白剂和70%乙醇溶液对手套箱进行去污处理。

将样品移出手套箱，并转移至工作台以进行提取步骤的后续操作。提取完成后，将样品转移至传递窗，用于PCR分析。在取出并转移样品后，对手套箱外部的实验室工作区域进行去污染处理。

在脱卸个人防护装备（PPE）之前，请等待生物安全柜内的空气循环完成足够次数的过滤，确保环境安全后再开始脱卸PPE。脱卸并丢弃所有PPE至PPE废弃物容器后，应立即在实验室洗手池用肥皂和水洗手，然后方可离开操作区域。PCR扩增与检测。

从传递窗中取出提取的RNA样本。在1.5毫升离心管中为每种靶向检测配制反应主混合液，组分如下：水、引物和探针、扩增反应液以及2倍浓度缓冲液。将主混合液涡旋混匀并离心，随后将主混合液分装至各排管中。

配制完主混合液后，将PCR试剂盒放回推荐温度条件下储存。使用不同的吸头分别向各排管中加入样品。将样品以1,500 rpm离心1分钟，随后样品即可用于上机进行实时PCR扩增。

样本上机至PCR仪后，完成一次运行大约需要90分钟。实时PCR检测是一种用于可靠、灵敏地检测病毒的敏感方法。这一点可在标注为“PCR分析结果”的表格中看出。

在收集实验结果并离开实验室之前，应脱去个人防护装备（PPE），并对每个工作台进行充分的去污染处理，为下一次诊断测试做好准备。代表性结果。实验室工作流程在图中展示，重点强调了个人防护。

流感的快速诊断通过RT-PCR分析完成。该流程包括四个主要步骤，每个步骤均分配有独立的工作区域。本项目的目标是验证一种新型模块化、可快速部署的实验室设施，我们已成功实现了这一目标，同时还为在资源有限环境中疫情暴发期间工作的实验室人员开发了培训项目。