强化酵母单杂交筛网识别与人 dna 序列结合的转录因子

在这里, 我们提出了一个增强的酵母单杂交筛选方案, 以确定转录因子 (tf), 可以绑定到人类 dna 区域感兴趣。该方法采用高通量筛选管道, 可以在一次实验中询问 tf 和 gt;1,000 的结合。

增强酵母单杂交测定的目标是识别与感兴趣的DNA序列结合的转录因子集。该技术的优点是增强酵母单杂交测定可以在一次实验中评估1000多个转录因子。相反，染色质免疫沉淀一次只评估一个转录因子。

此方法是功能基因组学的关键工具，用于识别与基因启动剂和增强剂结合的转录因子的序列，并识别与非编码变异结合的改变转录因子。演示这个程序的将是刘兴博士，一个博士后从我的实验室。用冰上的 TF 猎物阵列解冻酵母甘油库存板。

使用 12 通道移液器重新发送酵母，并在 1 到 3 分钟内继续执行下一步。要发现酵母进入Sc减去色氨酸矩形板，使用高密度阵列机器人选择多井96板作为来源，96个阿加板作为目标，和96长针垫。针垫不能重复使用，应丢弃。

选择"现货多"程序，每 96 个井板制作两个副本。不要使用回收或重新循环选项，以避免冷冻库存的回污染。此外，选择在源中上下旋转以混合酵母的选项。

按照说明放置板的位置和时间，让机器人发现酵母到Sc减去色氨酸矩形板。袋斑点阵列，孵育它加糖侧在30摄氏度2至3天。要生成 384 个菌落阵列，在 Sc 减去色氨酸矩形板中，请选择 96 个阿加板作为源，选择 384 个加糖板作为目标，以及 96 个短销垫。

然后选择 1:4 数组单源程序。这样，四个96个殖民地板块将合并为一个384个殖民地板块。请勿使用回收或重新循环选项，以避免不同板之间的污染。

袋板和孵育斑点的384殖民地阵列加糖侧在30摄氏度2天。要在 Sc 减去色氨酸矩形板中生成 1536 个菌落阵列，请选择 384 个加糖板作为源，选择 1536 个加糖板作为目标，选择 384 个短销垫。然后选择1:4检测单源程序。

目标是将每个殖民地复制到四个殖民地，以获得四倍。使用回收和重新访问选项，因为这需要复制每个殖民地 4 次。按照机器人的指示，让机器人在袋装和孵育斑点的1536殖民地阵列加糖侧在30摄氏度3天之前，发现酵母进入板。

要放大 Sc 减去色氨酸矩形板中的 1536 菌落阵列，请选择 1536 个加糖板作为源，选择 1536 个加糖板作为目标，选择 1536 个短销垫。选择"复制多个"程序可复制 3 到 4 个副本。使用回收和重访选项，但在切换到阵列的不同板时扔掉垫，以避免交叉污染。

允许机器人放大 Sc 减去色氨酸矩形板中的 1536 殖民地阵列。最后，将盘子包起来，在30摄氏度的温度下孵育斑点的1536殖民地阵列，用于交配步骤3天。要准备DNA诱饵菌株草坪交配，发现DNA酵母诱饵菌株在Sc减去乌拉西和血素板，并在30摄氏度生长3天。

使用无菌牙签将酵母切成 15 厘米的 Sc 减 uracil 和组蛋白板，使每个板适合 12 到 16 种不同的菌株。在30摄氏度下孵育一天。第二天，使用无菌牙签将酵母条纹成15厘米的Sc减去uracil和组蛋白板，使每个盘子适合4种不同的菌株。

在30摄氏度下孵育一天。孵育后，用无菌牙签刮酵母，确保不刮任何阿加。将酵母加入1.5毫升管中，加入500微升无菌水。

现在添加 10 到 15 个无菌玻璃珠和酵母悬浮液到 YAPD 矩形板上。在四面八方彻底摇动一分钟，以确保酵母在盘子中传播。立即反转板，然后轻点使珠子进入盖子。

取出并回收珠子。袋板，并在30摄氏度下孵育其加糖侧1至2天。然后，继续执行交配步骤。

要配合酵母DNA诱饵和TF阵列菌株，请将TF阵列与机器人转移到雅普矩形板中。选择 1536 agar 板作为源和目标，以及 1536 短销垫。选择"复制多个"程序。

选择 4 个源板和回收和重新访问选项。每个 TF 阵列板可用于传输 3 到 4 个 YAPD 板。用于交配的 TF 阵列板必须具有 2 到 3 天的旧时间，但不应更多，因为交配可能效率低下。

要将 DNA 诱饵菌株的草坪转移到已经包含 TF 阵列的 YAPD 板，请选择 1536 agar 板作为源和目标以及 1536 短销垫。选择"复制多个"程序。在半径约为 0.6 毫米的源中使用随机偏移，以避免从同一位置服用酵母，并选择"目标混合"，以方便酵母菌株之间的接触。

使用含有DNA诱饵菌株的草坪作为来源，使用含有斑点TF阵列的亚普德板作为目标，然后袋装板，在30摄氏度的温度下将它们孵育一天。要选择二倍体酵母，选择1536糖板作为来源和目标，并选择1536短针垫。选择"复制"程序。

选择"在源上和目标上混合"。允许机器人将配合酵母从 YAPD 板转移到 Sc 减化板和色氨酸板，然后袋装板并在 30 摄氏度下将糖侧孵育 2 至 3 天。现在，选择 1536 阿加板作为源和目标以及 1536 短销垫。

选择"复制"程序。使用机器人将二倍体酵母从 Sc 减去 uracil 和色氨酸板转移到读出矩形 3-AT 和 X-gal 的板中。袋板和孵育他们加糖侧在30摄氏度长达7天。

对于具有高背景记者活动的DNA诱饵菌株，请于第2天、第3天和4天拍照。否则，在第 4 天和 7 天拍照。将 TF 阵列板保持室温，7 天后再次复制，进行新一轮筛查。

为了说明使用增强酵母单杂交测定可以获得的结果类型，对CCL15和IL17F基因的启动区域进行了1086个人类TF阵列的筛选。CCL15启动子是非自动DNA诱饵的一个例子，其中相互作用，即使是弱的，可以很容易地检测。IL17F 启动子是具有不均匀背景报告器活动的自动活性 DNA 诱饵的一个例子，其中可以检测到某些交互，而对于多个 TF，不确定报告器活动是否高于背景。

在进行增强酵母单杂交测定时，可能会出现几个问题。在这种情况下，殖民地太小，无法转移。通常，大约 95% 的 TF 猎物群显示正常生长。

在此示例中，板的一部分没有酵母生长。此问题通常与在交配步骤中失败有关，如果 1536 销垫未能与 DNA 诱饵应变草坪、TF 阵列或交配板中的酵母接触。在这两个示例中，未检测到任何交互。

此问题通常与记者基因（尤其是 LacZ）中意外的不激活突变有关，或者与掩盖相互作用的过高的自动性有关。在这种情况下，板呈现随机蓝点，这通常与细菌污染有关。最重要的事情要考虑的是适当的板准备。

确保添加所有组件，并且加糖高度是均匀的，因为所有后续步骤都依赖于此。虽然大多数试剂并不危险，但必须时刻戴上手套，以避免样品和板材受到污染。与任何DNA结合检测一样，使用分析器检测、转录因子敲除或敲除等功能检测来验证所识别的相互作用非常重要，其次是测量目标基因的表达。

这种方法允许识别用于调节特定生物过程中涉及的基因的转录因子，以及与非编码疾病相关变异交替结合的转录因子。