Name: 强化酵母单杂交筛网识别与人 dna 序列结合的转录因子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学习增强酵母单杂交筛选技术，用于高通量识别结合特定DNA序列的转录因子。该方法可同时筛选超过1000个转录因子，是功能基因组学研究基因调控的重要工具。

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本工作由美国国立卫生研究院资助 [R35-GM128625 致 J.I.F.B.]。&#160;

1. 准备工作
<ol>
	<li>Sc −U −H 平板（150 mm 培养皿）&#160; 
	注意：这些平板将用于培养 DNA-bait 酵母菌株。&#160;
	<ol>
		<li>将缺失营养成分混合物、酵母氮源基础（YNB）、半硫酸腺苷和硫酸铵溶解于 920 mL 水中，用 5 M NaOH 调节 pH 至 5.9（每升培养基约需 1 mL；培养基成分见表 2）。倒入 2 L 锥形瓶中，并加入搅拌子。</li>
		<li>在另一个 2 L 锥形瓶中，将琼脂加入 950 mL 水中（不要加入搅拌子，以免在高压灭菌时琼脂沸腾溢出）。&#160;</li>
		<li>在液体程序下，15 psi 条件下高压灭菌 40 分钟。&#160;</li>
		<li>立即将第一个锥形瓶中的内容物（包括搅拌子）倒入含琼脂的锥形瓶中。加入葡萄糖，在磁力搅拌器上充分混匀，然后在水浴中冷却至 55 °C。&#160;</li>
		<li>向培养基中加入亮氨酸和色氨酸。在磁力搅拌器上充分混匀后，倒入 150 mm 无菌培养皿中（每皿约 80 mL）。在室温下干燥 3–5 天，用塑料袋包裹，并在室温下保存最多 6 个月。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>YAPD 矩形平板 
	注意：这些平板将用于培养 DNA-bait 菌株的菌苔以及与转录因子（TF）阵列文库进行交配。
	<ol>
		<li>在 2 L 锥形瓶中，将除琼脂外的粉末（成分见表 3）溶解于 950 mL 水中，并加入搅拌子。</li>
		<li>在另一个 2 L 锥形瓶中，将琼脂加入 950 mL 水中（不要加入搅拌子，以免在高压灭菌时琼脂沸腾溢出）。</li>
		<li>在液体程序下，15 psi 条件下高压灭菌 40 分钟。</li>
		<li>立即将第一个锥形瓶中的内容物（包括搅拌子）倒入含琼脂的锥形瓶中。</li>
		<li>加入葡萄糖，在磁力搅拌器上充分混匀并冷却至 55 °C。使用蠕动泵（5 mL/sec）和 6 mm 硅胶管将培养基倒入矩形平板中（见材料表；每板约 70 mL）。在室温下干燥 1 天，用塑料袋包裹，并在冷藏室中保存最多 6 个月。&#160; 
		注意：尽管推荐的培养基体积为每板 70 mL，但也可使用 50–80 mL。倒板时需注意三个关键问题：1）确保平板水平，使琼脂培养基在整个平板中厚度一致（使用水平台面或表面倒板，且每次倒板不超过七层）；2）确保琼脂中无气泡（可用无菌针头刺破气泡）；3）仅干燥 1 天，并用塑料袋包裹平板，以避免酵母点种失败。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sc −Trp 和 Sc −U −Trp 矩形平板&#160; 
	注意：这些平板将用于培养转录因子（TF）阵列文库（Sc −Trp）以及交配后筛选二倍体酵母（Sc −U −Trp）。
	<ol>
		<li>将缺失营养成分混合物、YNB、半硫酸腺苷和硫酸铵溶解于 920 mL 水中，用 5 M NaOH 调节 pH 至 5.9（每升培养基约需 1 mL）（成分见表 4）。倒入 2 L 锥形瓶中，并加入搅拌子。&#160;</li>
		<li>在另一个 2 L 锥形瓶中，将琼脂加入 950 mL 水中（不要加入搅拌子，以免在高压灭菌时琼脂沸腾溢出）。&#160;</li>
		<li>在液体程序下，15 psi 条件下高压灭菌 40 分钟。&#160;</li>
		<li>立即将第一个锥形瓶中的内容物（包括搅拌子）倒入含琼脂的锥形瓶中。加入葡萄糖，在磁力搅拌器上充分混匀，并冷却至 55 °C。&#160;</li>
		<li>加入亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶（Sc −U −Trp 平板中省略尿嘧啶）。&#160;</li>
		<li>在磁力搅拌器上充分混匀后，使用蠕动泵（5 mL/sec）和 6 mm 硅胶管将培养基倒入矩形平板中（每板约 70 mL）。在室温下干燥 1 天，用塑料袋包裹，并在冷藏室中保存最多 3 个月。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sc −U −H −Trp + 3AT + X-gal 矩形平板 
	&#8203;注意：这些平板将用于 eY1H 实验的结果检测。
	<ol>
		<li>将缺失营养成分混合物、YNB、半硫酸腺苷和硫酸铵溶解于 850 mL 水中（成分见表 5）。无需调节 pH。倒入 2 L 锥形瓶中，并加入搅拌子。&#160;</li>
		<li>在另一个 2 L 锥形瓶中，将琼脂加入 850 mL 水中（不要加入搅拌子，以免在高压灭菌时琼脂沸腾溢出）。&#160;</li>
		<li>在液体程序下，15 psi 条件下高压灭菌 40 分钟。</li>
		<li>通过将 900 mL 水、70 g Na2HPO4∙7H2O 和 34.5 g NaH2PO4∙H2O 混合，配制 10x BU 盐溶液（1 L）。使用搅拌子搅拌溶解粉末，并用 5 M NaOH 调节 pH 至 7.0。加水定容至 1 L 后高压灭菌。</li>
		<li>通过将 3.5 g X-gal 粉末加入含有 42.5 mL 二甲基甲酰胺的 50 mL 塑料管中，配制 X-gal 溶液。将 X-gal 粉末加入二甲基甲酰胺中可更易溶解（约需 30 分钟）。将储备液避光保存（使用不透明 50 mL 管或用铝箔包裹）。储存于 -20 °C。</li>
		<li>立即将第一个锥形瓶中的内容物（包括搅拌子）倒入含琼脂的锥形瓶中。加入葡萄糖和 10x BU 盐（成分见表 5），在磁力搅拌器上充分混匀，并冷却至 55 °C。&#160;</li>
		<li>加入亮氨酸、3AT 和 X-gal（成分见表 5）。&#160;</li>
		<li>在磁力搅拌器上充分混匀后，使用蠕动泵（5 mL/sec）和 6 mm 硅胶管将培养基倒入矩形平板中（每板约 70 mL）。在室温下干燥 1 天，用塑料袋包裹，并用铝箔包裹后在冷藏室中保存最多 1 个月（3AT 和 X-gal 对光敏感）。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 点样转录因子阵列
<ol>
	<li>解冻TF-猎物阵列
	<ol>
		<li>将含有TF-猎物阵列的酵母甘油保存管在冰上解冻。&#160; 
		&#8203;注意：TF-猎物阵列可按照先前发表的方法制备10,12,13,18。</li>
		<li>使用12通道移液器在1–3分钟内重悬酵母，随后立即进行下一步操作。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将酵母点样至Sc −Trp矩形平板
	<ol>
		<li>在HDA机器人中（参见材料表），选择96孔深孔板作为源板，96孔琼脂平板作为目标板，并使用96孔长针垫。&#160; 
		&#8203;注意：针垫不可重复使用，使用后应丢弃。</li>
		<li>选择复制多个程序，为每块96孔板生成两个副本。请勿使用回收或重复访问选项，以避免冷冻菌种之间的交叉污染。&#160;</li>
		<li>选择在源板中上下涡旋混合的选项，以充分混匀酵母。</li>
		<li>将点样后的阵列用袋密封，并在30 °C下倒置（琼脂面朝上）培养2–3天。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在Sc −Trp矩形平板上生成384菌落阵列
	<ol>
		<li>在机器人中，选择96孔琼脂平板作为源板，384孔琼脂平板作为目标板，并使用96孔短针垫。&#160;</li>
		<li>选择1:4阵列程序。通过此程序，可将四块96菌落平板（每块含有不同的转录因子）整合为一块384菌落平板。请勿使用回收或重复访问选项，以避免不同平板间的污染。</li>
		<li>将平板装袋，并在30 °C下倒置（琼脂面朝上）培养2天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在Sc −Trp矩形平板上生成1,536菌落阵列 
	注意：该步骤将生成每个TF-猎物对应四个菌落的阵列。
	<ol>
		<li>在机器人中，选择384孔琼脂平板作为源板，1,536孔琼脂平板作为目标板，并使用384孔短针垫。&#160;</li>
		<li>选择1:4检测单源程序。目的是将每个菌落复制为四个菌落，以获得四重复。由于每个菌落需复制四次，因此可使用回收和重复访问选项。&#160;</li>
		<li>将平板装袋，并在30 °C下倒置（琼脂面朝上）培养3天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在Sc −Trp矩形平板上扩增1,536菌落阵列
	<ol>
		<li>在机器人中，选择1,536孔琼脂平板作为源板，1,536孔琼脂平板作为目标板，并使用1,536孔短针垫。&#160;</li>
		<li>选择复制多个程序，生成3–4个副本。可使用回收和重复访问选项，但在切换至阵列中不同平板时必须更换针垫，以避免交叉污染。&#160;</li>
		<li>将平板装袋，并在30 °C下倒置（琼脂面朝上）培养3天，用于后续的交配步骤（见下文）。之后将平板保存于室温，并在7天后再次复制，用于下一轮筛选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. eY1H 筛选
<ol>
	<li>准备DNA诱饵菌株草坪用于接合
	<ol>
		<li>将酵母DNA诱饵菌株点样到Sc −U −H平板上，在30 °C下培养3天。&#160;</li>
		<li>使用无菌牙签将酵母划线接种至一个15 cm的Sc −U −H平板上，使每个平板可容纳12–16种不同菌株。在30 °C下孵育一天。</li>
		<li>使用无菌牙签将酵母划线接种至一个15 cm的Sc −U −H平板上，使每个平板可容纳4种不同菌株。在30 °C下孵育一天。</li>
		<li>使用无菌牙签刮取酵母，注意不要刮取任何琼脂，将其加入含有500 µL无菌水的1.5 mL离心管中。&#160;</li>
		<li>将10–15颗无菌玻璃珠加入YAPD矩形平板中。将酵母悬液加入平板，充分地向各个方向振荡1分钟，以确保酵母均匀分布至整个平板。</li>
		<li>立即倒置平板并轻敲，使玻璃珠落入盖子中。取出并回收玻璃珠。&#160;</li>
		<li>将平板装入袋中，并将琼脂面朝下在30 °C下孵育1–2天。随后进行接合步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母DNA诱饵菌株与转录因子阵列菌株的接合
	<ol>
		<li>使用机器人将转录因子（TF）阵列转移至YAPD矩形平板上。选择1,536孔琼脂平板作为源和目标，并使用1,536短针垫。选择Replicate Many程序。每块TF阵列平板可用于转移至3–4块YAPD平板（取决于阵列中的平板数量）。用于接合的TF阵列平板应为培养2–3天的菌株，不宜更久，否则接合效率可能降低。</li>
		<li>使用机器人将DNA诱饵菌株的草坪转移至已含有TF阵列的YAPD平板上。选择1,536孔琼脂平板作为源和目标，并使用1,536短针垫。选择Replicate Many程序。在源位置使用约0.6 mm半径的随机偏移，以避免从同一位置取菌，并在目标位置进行混合，以促进酵母菌株之间的接触。使用含有DNA诱饵菌株的草坪（第3.1节）作为源，使用在步骤3.2.1中已点样TF阵列的YAPD平板作为目标。</li>
		<li>将平板装入袋中，并将琼脂面朝上在30 °C下孵育1天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二倍体酵母的筛选
	<ol>
		<li>使用机器人将接合后的酵母从YAPD平板转移至Sc −U −Trp平板上。选择1,536孔琼脂平板作为源和目标，并使用1,536短针垫。选择Replicate程序。在源和目标位置均进行混合。</li>
		<li>将平板装入袋中，并将琼脂面朝上在30 °C下孵育2–3天（延长孵育时间会导致报告基因背景活性升高）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转移至检测平板
	<ol>
		<li>使用机器人将二倍体酵母从Sc −U −Trp平板转移至检测用矩形平板Sc −U −H −Trp + 5 mM 3AT + 0.4 mM X-gal上。选择1,536孔琼脂平板作为源和目标，并使用1,536短针垫。选择Replicate程序。</li>
		<li>将平板装入袋中，并将琼脂面朝上在30 °C下孵育最多7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测平板的成像
	<ol>
		<li>对于报告基因背景活性较高的DNA诱饵菌株，应在第2、3、4天拍照；其他情况下，在第4天和第7天拍照。阳性相互作用通过酵母菌落的生长和蓝色显色来识别，可手动判断，也可使用图像分析软件进行判断。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。&#160;

与基于转化的传统文库筛选或阵列筛选方法相比，本文所述的机器人化eY1H交配筛选方法显著提高了识别结合特定DNA区域的转录因子（TF）集合的通量。此外，eY1H检测到的转录因子-DNA相互作用具有高度可重复性：90%的相互作用在每个转录因子测试的四个菌落中均为阳性，且90%的相互作用在相同酵母DNA诱饵菌株的独立筛选中可被重复验证10,12,19。更重要的是，eY1H检测到的转录因子-DNA相互作用在人类报告基因检测12,20、原代人类细胞（未发表结果）以及C. elegans基因敲除动物11中验证的成功率为40%–70%。该验证率与ChIP-seq数据的验证率相似21。
<p class="jove_content"...

生物医学领域的一个核心问题是确定调控每个人类基因的机制。转录是控制基因表达水平的第一步，由每种基因特异的一组转录因子（TFs）进行调控。鉴于人类基因组编码了&#62;1,500 种转录因子1,2，要鉴定出调控每个基因表达的完整转录因子集合，仍然是一个尚未解决的挑战。&#160;
研究转录因子与DNA相互作用的方法可分为两类：以转录因子为中心的方法和以DNA为中心的方法3（图1A）。在以转录因子为中心的方法中，针对特定的转录因子检测其与基因组DNA区域的结合能力，或确定其DNA结合特异性。这类方法包括染色质免疫沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）、蛋白质结合微阵列以及SELEX技术4,5,6。在以DNA为中心的方法中，通过检测特定DNA序列来确定能够与其结合的一组转录因子。其中应用最广泛的是酵母单杂交（Y1H）实验，该方法利用报告基因在酵母细胞核环境中检测转录因子与DNA区域之间的相互作用7,8,9。&#160;
Y1H 实验包含两个组分：一种“DNA 钓饵”（例如启动子、增强子、沉默子等）和一种“转录因子（TF）猎物”，可用于筛选报告基因的激活情况9,10（图 1B）。DNA 钓饵被克隆至两个报告基因（LacZ 和 HIS3）的上游，且两种 DNA 钓饵::报告基因构建体均整合到酵母基因组中，以生成染色质化的“DNA 钓饵菌株”。编码 TF 猎物的序列位于一个质粒上，该质粒表达一个与酵母 Gal4 转录因子的激活结构域（AD）融合的 TF，将其转入 DNA 钓饵菌株中，以捕获 TF-DNA 相互作用。如果 TF 猎物结合到 DNA 钓饵序列上，则 TF 猎物中存在的 AD 将导致两个报告基因的激活。因此，具有阳性相互作用的细胞可在缺乏组氨酸的培养基上生长，并能耐受竞争性抑制剂 3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT），同时在 X-gal 存在下呈现蓝色菌落。由于使用了强效的酵母 Gal4 AD，Y1H 实验能够检测涉及转录激活因子和转录抑制因子的相互作用。此外，由于 TF 猎物由强酵母启动子（ADH1）驱动表达，即使对于内源表达水平较低、通过 ChIP 难以检测的 TF，其相互作用仍可被检测到11,12。
大多数已发表的Y1H实验方案均基于将转录因子（TF）猎物通过转化混合的TF猎物文库引入酵母DNA诱饵菌株，随后进行筛选、菌落挑选和测序以鉴定相互作用的TF，或者通过分别转化单个克隆8,9。这些方法耗时较长，限制了每位研究人员可检测的DNA序列数量。一种近期改进的Y1H实验方法，称为增强型Y1H（eY1H），通过使用高密度阵列（HDA）机器人平台，将酵母DNA诱饵菌株与一系列各自表达不同TF猎物的酵母菌株进行交配，显著提高了筛选通量10,13（图1C）。该筛选采用1,536菌落格式，仅需三块平板即可对大多数人类转录因子进行四次重复检测。此外，由于TF-DNA相互作用以成对方式检测，该方法可实现不同DNA诱饵（例如两个非编码区单核苷酸变异）之间以及不同转录因子或转录因子变体之间的相互作用比较11,12,14。
利用eY1H实验，我们迄今已描绘出最大规模的人类和Caenorhabditis elegans以DNA为中心的转录因子- DNA相互作用网络。具体而言，我们鉴定了246个人类发育增强子与283个转录因子之间的2,230个相互作用12。此外，我们应用eY1H实验揭示了转录因子对109个与遗传疾病（如发育畸形、癌症和神经系统疾病）相关的单核苷酸非编码变异的结合改变。最近，我们利用eY1H描绘了一个包含2,576个C. elegans基因启动子与366个转录因子之间21,714个相互作用的网络11。该网络对于揭示数十个C. elegans转录因子的功能作用至关重要。
生成DNA诱饵菌株并评估背景报告基因活性水平的实验方案已在其他文献中报道15,16,17。本文中，我们描述了一种eY1H流程，可用于将任意人类基因组DNA区域与包含1,086种人类转录因子（TF）的阵列进行筛选。一旦构建出酵母DNA诱饵菌株并将转录因子-猎物阵列点样至相应平板后，整个实验可在两周内完成（表1）。更重要的是，该流程可实现并行操作，单个研究人员可同时筛选多达60个DNA诱饵序列。为演示该实验流程，我们对两种细胞因子基因CCL15和IL17F的启动子区域进行了筛选。此外，我们还展示了若干失败实验的结果，以说明在进行eY1H检测时可能出现的问题类型及其相应的解决方法。

<table><tbody><tr><td>3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）~95% TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td><td>HIS3基因产物的竞争性抑制剂</td></tr><tr><td>硫酸腺嘌呤（半硫酸盐），二水合物</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>酵母正常生长所必需</td></tr><tr><td>高凝胶强度琼脂 - 细菌级</td><td>American International Chemical</td><td>AGHGUP</td><td>酵母生长的营养培养基</td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>合成酵母培养基中的氮源</td></tr><tr><td>D+葡萄糖无水物</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>酵母生长所必需</td></tr><tr><td>缺组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的酵母氮源缺陷型培养基混合物，富含腺嘌呤，不含酵母氮源基础成分</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>酵母生长所需的合成完全培养基</td></tr><tr><td>edge 多参数pH计</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>用于测定选择性培养基的pH值</td></tr><tr><td>平头牙签，750支装</td><td>Diamond</td><td></td><td>用于在培养皿上划线接种酵母</td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>Walter Stern</td><td>100C</td><td>制作酵母菌苔时用于分散酵母</td></tr><tr><td>甘油 &amp;ge;99%</td><td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>制备冷冻酵母保存菌种所需</td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>用于选择性培养基中酵母生长的筛选</td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>用于选择性培养基中酵母生长的筛选</td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma</td><td>T-0254</td><td>用于选择性培养基中酵母生长的筛选</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>用于配制X-gal溶液</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>用于向Singer平板中精确分配培养基体积</td></tr><tr><td>蛋白胨，细菌级</td><td>American International Chemical</td><td>PEBAUP</td><td>酵母生长所需的蛋白质来源</td></tr><tr><td>培养皿，150 mm × 15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>用于培养用于筛选的酵母诱饵</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td><td>用于制作矩形琼脂平板，配合Singer机器人使用</td></tr><tr><td>精密低温BOD冷藏培养箱</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>用于在恒定温度下培养酵母平板</td></tr><tr><td>RePads 1,536短型</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>用于转移转录因子-猎物阵列、酵母杂交，以及将酵母转移到二倍体筛选和检测平板</td></tr><tr><td>RePads 384短型</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>用于将转录因子-猎物阵列从384菌落格式转移至1,536菌落格式</td></tr><tr><td>RePads 96长型</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-001</td><td>用于将转录因子-猎物阵列从甘油保存菌种转移至琼脂平板</td></tr><tr><td>RePads 96短型</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>用于将转录因子-猎物阵列从96菌落格式转移至384菌落格式</td></tr><tr><td>Singer HDA RoToR机器人</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>用于高通量转移酵母</td></tr><tr><td>氢氧化钠（颗粒，ACS认证）</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>用于调节选择性培养基的pH值</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203402C</td><td>X-gal检测中β-半乳糖苷酶报告基因活性所必需&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>X-gal检测中β-半乳糖苷酶报告基因活性所必需&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>用于选择性培养基中酵母生长的筛选</td></tr><tr><td>X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&amp;beta;-半乳糖苷酶将无色X-gal转化为蓝色，以检测蛋白质-DNA相互作用</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>酵母生长与扩增的营养培养基</td></tr><tr><td>酵母氮源基础（粉末），不含氨基酸、碳水化合物和硫酸铵&amp;nbsp;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>酵母旺盛生长所必需</td></tr></tbody></table>

增强型酵母单杂交筛选技术用于鉴定结合人类dna序列的转录因子

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

确定调控每个人类基因的转录因子（TFs）组合是一项艰巨的任务，需要整合多种实验和计算方法。其中一种方法是酵母单杂交（Y1H）检测，该方法利用报告基因在酵母细胞核环境中检测转录因子与DNA区域之间的相互作用。Y1H检测包含两个组分：一种“DNA诱饵”（例如.，启动子、增强子、沉默子等）和一种“转录因子猎物”（TF-prey），可用于筛选报告基因的激活。目前大多数已发表的Y1H筛选实验方案均基于将转录因子猎物文库或阵列转化至DNA诱饵酵母菌株中。本文描述了一种称为增强型Y1H（eY1H）检测的流程，该方法通过使用高密度阵列（HDA）机器人平台，将DNA诱饵菌株与阵列化的转录因子猎物菌株进行交配，从而检测转录因子与DNA之间的相互作用，实现1,536菌落格式的高通量筛选。该方法显著提高了通量（可同时检测60个DNA诱饵序列与 &#62;每位研究人员筛选1,000个转录因子需耗时两周）以及可重复性。我们通过将人类启动子序列与包含1,086个人类转录因子的阵列进行测试，展示预期结果的不同类型，同时列举筛选过程中可能出现的问题及相应的解决方案。

分析 eY1H 实验结果时应考虑三个主要因素：DNA 钓饵菌株的报告基因本底活性、对应转录因子- DNA 相互作用的报告基因活性强度，以及阳性克隆的数量。DNA 钓饵菌株的报告基因本底活性（即自激活活性）是指读出平板中酵母菌落的整体生长情况和颜色，即使在不存在转录因子猎物（TF-prey）的情况下也会出现。理想情况下，非自激活菌株表现为本底呈白色或浅棕色，而阳性相互作用的菌落则更大且呈蓝色。自激活的 DNA 钓饵菌株则在缺乏组氨酸的培养基中表现出酵母生长，并在 X-gal 存在下所有菌落均呈现蓝色，这可能与酵母转录激活因子结合到 DNA 钓饵上有关8。所检测到的 TF-DNA 相互作用对应的报告基因活性强度（即菌落大小和蓝色深浅）取决于多个参数，包括结合亲和力、转录因子在酵母中的表达水平、结合位点数量及其与报告基因上游酵母最小启动子之间的距离，以及 DNA 钓饵菌株的报告基因本底活性。例如，弱相互作用在本底较低的钓饵中可能容易被检测到，但在自激活或本底不均一的钓饵中可能难以识别。还需注意的是，酵母中的报告基因活性水平并不一定与人类细胞中的调控活性相关，因为酵母与人类在染色质结构、核小体定位...

在此，我们介绍一种改进的酵母单杂交筛选方案，用于鉴定可结合人源特定DNA区域的转录因子（TFs）。该方法采用高通量筛选流程，可系统检测转录因子与目标DNA序列的结合能力。 &#62;单次实验中检测 1,000 个转录因子。

增强型酵母单杂交筛选技术用于鉴定结合人类DNA序列的转录因子

确定调控每个人类基因的转录因子（TFs）组合是一项艰巨的任务，需要整合大量实验和...

增强型酵母单杂交实验的目的是鉴定出能够结合特定DNA序列的转录因子集合。该技术的优势在于，一次实验即可同时评估超过1000个转录因子。相比之下，染色质免疫沉淀技术每次只能评估一个转录因子。该方法是功能基因组学中的一项关键技术，可用于鉴定与基因启动子和增强子结合的转录因子谱系，并识别与非编码变异位点结合发生改变的转录因子。本实验操作将由我实验室的博士后 Dr.Xing Liu 演示。将含有转录因子猎物阵列的酵母甘油保存菌种板置于冰上解冻。使用12通道移液器重悬酵母，并在1至3分钟内进行下一步操作。将酵母点样到Sc缺失色氨酸矩形平板时，使用高密度阵列机器人，选择96孔板作为来源板，96个琼脂平板作为目标板，以及96头长针垫。针垫不可重复使用，应予以丢弃。选择“Spot Many”程序，每块96孔板制作两个副本。请勿使用循环或重访选项，以避免冷冻菌种发生回传污染。同时，选择在源孔中上下涡旋混匀酵母的选项。按照说明确定放置平板的位置和时间，让机器人将酵母点样到Sc缺失色氨酸的矩形平板上。将点样后的阵列装入袋中，并在30摄氏度下倒置（琼脂面朝上）培养2至3天。为了在Sc缺失色氨酸的矩形平板上生成384菌落阵列，选择96个琼脂平板作为源板，384琼脂平板作为目标板，以及96个短针垫。然后选择 1:4 阵列单源程序。通过此方法，可将四块 96 菌落板合并为一块 384 菌落板。请勿使用回收或重复访问选项，以避免不同板之间的交叉污染。将平板装袋，并将点样后的384菌落阵列倒置于琼脂面上，在30摄氏度下孵育2天。为在Sc缺失色氨酸矩形平板上生成1536菌落阵列，选择384琼脂平板作为源板，1536琼脂平板作为目标板，以及384短针垫。然后选择1:4单源检测程序。目的是将每个菌落复制为四个菌落，以获得四份重复样本。由于需要将每个菌落复制四次，请使用回收和重新访问选项。按照机器人的指示操作，待机器人将酵母点样到平板上后，将点样后的1536菌落阵列平板倒置（琼脂面朝上），装入袋中，并在30°C下培养3天。为了在Sc缺失色氨酸矩形平板上扩增1536菌落阵列，选择1536琼脂平板作为来源，1536琼脂平板作为目标，并使用1536短针垫。选择“复制多个”程序以复制3至4份。使用循环和重复访问选项，但在切换至阵列中不同平板时应丢弃针垫，以避免交叉污染。让机器人在缺乏色氨酸的Sc矩形平板上扩增1536菌落阵列。最后将平板装入袋中，于30摄氏度倒置培养3天，用于后续杂交步骤。为准备用于杂交的DNA诱饵菌株菌苔，将DNA酵母诱饵菌株点种于缺乏尿嘧啶和组氨酸的Sc平板上，在30摄氏度下培养3天。用无菌牙签将酵母划线接种于直径15厘米的缺乏尿嘧啶和组氨酸的Sc培养基平板上，使每个平板可容纳12至16种不同菌株。在30°C条件下培养平板一天。次日，用无菌牙签将酵母再次划线接种于直径15厘米的缺乏尿嘧啶和组氨酸的Sc培养基平板上，使每个平板容纳4种不同菌株。将培养板在30摄氏度下孵育一天。孵育结束后，用无菌牙签刮取酵母，注意不要刮到任何琼脂。将酵母加入含有500微升无菌水的1.5毫升离心管中。现在将10到15颗无菌玻璃珠和酵母悬液加入YAPD矩形平板中。充分地向各个方向振荡一分钟，以确保酵母均匀分布在平板上。立即倒置平板，并轻敲使玻璃珠落入盖子中。去除并回收珠子。将平板装入袋中，倒置（琼脂面朝下），在30摄氏度下孵育1至2天。随后，进行接合步骤。为了使酵母DNA诱饵菌株与转录因子阵列菌株杂交，使用机器人将转录因子阵列转移至YAPD矩形平板上。选择1536孔琼脂平板作为源板和目标板，并选择1536短针垫。选择“复制多个”程序。选择 4 个源板，并启用回收和重访选项。每个转录因子阵列板可用于转移 3 到 4 个 YAPD 板。用于接合的转录因子阵列板应为培养 2 到 3 天的菌板，但不应超过此时间，否则接合效率可能降低。为了将DNA诱饵菌株的菌苔转移至已含有转录因子阵列的YAPD平板上，选择1536孔琼脂平板作为源板和目标板，并使用1536短针针垫。选择“复制多个”程序。在源板中设置半径约为0.6毫米的随机偏移，以避免从同一位置取酵母，并在目标板上选择“混合”模式，以促进酵母菌株之间的接触。以含有DNA诱饵菌株的菌苔作为源，以点样了转录因子阵列的YAPD平板作为靶，在封袋后将平板倒置（琼脂面朝上），于30摄氏度培养一天。为筛选二倍体酵母，选择1536琼脂平板作为源和靶，并选择1536短针垫。选择复制程序。在源板和目标板上选择“混合”（Mix）模式。让机器人将交配后的酵母从YAPD平板转移到缺乏尿嘧啶和色氨酸的Sc平板上，随后将平板装入袋中，在30摄氏度下倒置（琼脂面朝上）培养2至3天。接下来，选择1536孔琼脂平板作为源板和目标板，并选择1536短针垫。选择复制程序。使用机器人将二倍体酵母从缺乏尿嘧啶和色氨酸的Sc平板转移到含有3-AT和X-gal的读出矩形平板上。将平板装入袋中，并在30°C下倒置（琼脂面朝上）培养最多7天。对于报告基因活性背景较高的DNA诱饵菌株，应在第2、3、4天拍照；否则，在第4天和第7天拍照。将转录因子阵列板置于室温下，并在7天后再次复制，以进行下一轮筛选。为了说明利用增强型酵母单杂交实验可获得的实验结果类型，我们对 CCL15 和 IL17F 基因的启动子区域与包含 1086 种人类转录因子的阵列进行了筛选。CCL15 启动子是一个非自激活 DNA 钓饵的示例，在该系统中，即使是较弱的相互作用也能被轻易检测到。IL17F 启动子则是自激活 DNA 钓饵的一个示例，其报告基因活性背景不均一，部分转录因子的相互作用可以被检测到，而对其他一些转录因子而言，报告基因活性是否高于背景水平尚不明确。在进行增强型酵母单杂交实验时，可能会出现若干问题。例如，菌落过小且无法完成转移。通常情况下，约有95%的转录因子猎物菌落能够正常生长。在此示例中，平板的某一部分没有酵母生长。该问题通常与杂交步骤失败有关，原因可能是1536针垫未能与DNA诱饵菌株菌苔、转录因子阵列或杂交平板中的酵母充分接触。在这两个示例中，均未检测到相互作用。这一问题通常与报告基因（尤其是 LacZ）发生意外的失活突变，或自激活水平过高掩盖了相互作用有关。在此情况下，平板上会出现随机分布的蓝色斑点，这通常与细菌污染有关。最重要的是要注意平板的正确制备。 确保添加所有组分，并保持琼脂高度均匀，因为后续所有步骤均依赖于此。尽管大多数试剂无显著危害性，但始终佩戴手套至关重要，以避免样本和培养板受到污染。与任何DNA结合实验一样，重要的是通过功能实验（如报告基因检测、转录因子敲低或敲除，随后检测靶基因表达水平）来验证所鉴定出的相互作用。该方法已实现了对调控特定生物过程中相关基因的转录因子的鉴定，以及对与非编码疾病相关变异位点发生交替结合的转录因子的鉴定。

enhanced-yeast-one-hybrid-screens-to-identify-transcription-factor

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

强化酵母单杂交筛网识别与人 dna 序列结合的转录因子

高通量酵母质粒过表达筛选

我们对传统的酵母双杂交筛选方法进行了改进，该方法是一种用于鉴定蛋白质相互作用的有效遗传学工具。这种改进显著缩短了实验周期，减轻了工作量，更重要的是减少了假阳性结果的数量。此外，该方法具有良好的可重复性和可靠性。...

改良的酵母双杂交系统用于鉴定与生长因子前颗粒蛋白相互作用的蛋白质

在本视频中，我们展示了改良的酵母单杂交实验方法，该方法可用于检测多种蛋白质与靶DNA的相互作用。转化后的酵母细胞在报告基因上游含有靶DNA序列，同时表达转录因子蛋白。当这些蛋白形成复合物并结合到靶DNA上时，报告基因将被表达，并可通过酶学方法进行检测。...

改良的酵母单杂交法检测异源蛋白复合物-DNA相互作用

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本文所述的改良型酵母单杂交检测方法是对经典酵母单杂交（Y1H）检测技术的扩展，可用于在异源系统中研究并验证任何功能基因组学中的异源蛋白复合物-DNA相互作用。...

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增强型酵母单杂交筛选技术用于鉴定结合人类DNA序列的转录因子

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