Name: 一种新的坏死性肠结肠炎人上皮肠素模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 了解利用人新生儿肠道组织培养肠类器官并施用脂多糖诱导炎症反应的方法，用于研究坏死性小肠结肠炎。该模型克服了动物模型的局限性，为儿科肠道疾病研究提供了符合伦理的替代方案。

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本工作获得了美国国立卫生研究院糖尿病与消化及肾脏疾病研究所资助（K08DK106450）以及美国小儿外科协会 Jay Grosfeld 奖项对 C.J.H. 的支持。

已获得机构审查委员会批准（IRB #2013-15152），用于在芝加哥安和罗伯特·H·卢里儿童医院（伊利诺伊州芝加哥）进行肠切除术的患者的组织样本采集。所有实验方案均遵循机构及国家关于人类福祉的指南和法规。在所有情况下，样本采集前均须获得家长书面知情同意。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>准备用于完整组织采集的培养基储备液：1 L 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、110 mL 胎牛血清（FBS）、11 mL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）和 1.1 mL 过滤除菌的胰岛素（终浓度 0.1%）。将储备液储存于 4 °C。</li>
	<li>准备螯合缓冲液 #1：30 mL 培养基（如步骤 1.1 所述）、600 µL 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度 10 mM）、300 µL 庆大霉素（终浓度 1%）和 60 µL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）。将储备液储存于 4 °C。</li>
	<li>准备螯合缓冲液 #2：30 mL 培养基（如步骤 1.1 所述）、300 µL 0.5 M EDTA（终浓度 5 mM）、300 µL 庆大霉素（终浓度 1%）和 60 µL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）。将储备液储存于 4 °C。</li>
	<li>准备人源类肠培养基：41.4 mL DMEM/F-12、5 mL FBS（终浓度 10%）、500 µL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）、500 µL L-谷氨酰胺（终浓度 1%）、500 µL 庆大霉素（终浓度 1%）、100 µL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）、500 µL 1 M N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）（终浓度 10 mM）、500 µL 100x N-2 补充剂和 1 mL 50x B-27 补充剂（不含维生素 A），总体积为 50 mL。将储备液储存于 -20 °C。</li>
	<li>准备完全人源类肠培养基：10 mL 人源类肠培养基（按步骤 1.4 制备）、10 µL 100 µg/mL Wnt3a（终浓度 100 ng/mL）、10 µL 100 µg/mL Noggin（终浓度 100 ng/mL）、10 µL 1 mg/mL R-Spondin（终浓度 1 µg/mL）、10 µL 500 µg/mL 表皮生长因子（EGF）（终浓度 50 ng/mL）、10 µL 1 M N-乙酰半胱氨酸（终浓度 1 mM）、10 µL 10 mM Y-27632（终浓度 10 µM）、10 µL 500 µM A-83（终浓度 500 nM）、10 µL 10 mM SB202190（终浓度 10 µM）、100 µL 1 M 烟酰胺（终浓度 10 mM）和 1 µL 100 µM [leu] 15-胃泌素 1（终浓度 10 nM）。总体积为 10 mL。将储备液储存于 4 °C。 
	注意：溶液必须在 48 小时内使用完毕。</li>
</ol>
2. 从完整组织中分离和接种隐窝
<ol>
	<li>在手术室采集样本时，将人小肠组织样本置于冰冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中。用冰冷的DPBS清洗样本，直至去除粪便和血液。将样本在4 °C条件下保存于RPMI 1640培养基中，直至准备进行隐窝分离。 
	注意：组织保存时间不得超过24小时。
	<ol>
		<li>确保样本中无粪便和血液残留。使用精细解剖剪去除多余的脂肪、手术夹或缝钉等。称量样本重量。 
		注意：建议取约0.75–2.5 g的组织块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织切成0.5 cm大小的片段，并放入30 mL螯合缓冲液#1（按步骤1.2配制）中。
	<ol>
		<li>在4 °C条件下低速振荡15分钟。</li>
		<li>用100 µm细胞筛网过滤组织，弃去滤过液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织加入30 mL螯合缓冲液#2（按步骤1.3配制）中。
	<ol>
		<li>在4 °C条件下低速振荡15分钟。</li>
		<li>用100 µm细胞筛网过滤组织，弃去滤过液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰上解冻500 mL基底膜基质，用于步骤2.8。</li>
	<li>将组织加入含有10 mL冷DMEM的50 mL锥形管中，手动剧烈震荡10秒。
	<ol>
		<li>通过100 µm细胞筛网过滤，收集滤过液（标记为#1）。将#1管置于冰上保存。</li>
		<li>将组织转移至另一支50 mL锥形管中，加入另外10 mL冷DMEM，手动剧烈震荡10秒。</li>
		<li>通过100 µm细胞筛网过滤，收集滤过液（标记为#2）。</li>
		<li>重复上述操作两次，共获得四支含有滤过液的锥形管（分别标记为#1–#4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将#1管溶液通过100 µm细胞筛网过滤，并将滤过液转移至15 mL锥形管中（标记为#1）。对#2–#4管重复相同操作。
	<ol>
		<li>将15 mL锥形管#1–#4在4 °C条件下以200 × g离心15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中，小心移除#1–#4管中的上清液并弃去。避免扰动沉淀物上方的组织云状物，即使这意味着需保留少量上清液。
	<ol>
		<li>缓慢移液，将#1–#4管中沉淀物与残留上清液混匀。</li>
		<li>将#1–#4管中的混合液转移至同一个2 mL锥形管中。</li>
		<li>将该锥形管在4 °C条件下以200 × g离心20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除上清液，将沉淀物重悬于500 µL基底膜基质中。 
	注意：基底膜基质应始终置于冰上，后续操作需迅速进行。该产品在室温下会迅速聚合。
	<ol>
		<li>用移液器缓慢吸取50 µL组织/基底膜基质悬液，滴加至24孔板中每个孔的中央位置，液滴应呈圆顶状。 
		注意：使用预冷的移液器吸头有助于更顺畅地转移悬液，减少提前聚合。</li>
		<li>重复操作9次，共填充10个孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将24孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，以促进基质聚合。</li>
	<li>向每孔加入500 µL人源类肠道完全培养基（按步骤1.5配制），每2天更换一次培养基。</li>
	<li>在培养5–10天、观察到出芽结构后收集类肠道器官。收集方法详见步骤4和步骤5。</li>
</ol>
3. 实验性坏死性小肠结肠炎的诱导
<ol>
	<li>在第0天，向每个孔中的500 µL人源类肠器官完全培养基（按步骤1.5制备）加入10 µL浓度为5 mg/mL的脂多糖（LPS）。每2天更换一次，直至收集样本。</li>
</ol>
4. 石蜡包埋前准备
<ol>
	<li>轻柔地移除培养基。
	<ol>
		<li>加入 1 mL PBS，轻轻吹打上下混合，以溶解基底膜基质，注意避免裂解肠类器官。</li>
		<li>将 PBS/肠类器官混合液在 &#60;300 x g 条件下离心 5 分钟，沉淀后移除 PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 4% 多聚甲醛，在室温下固定 1 小时。</li>
	<li>在 &#60;300 x g 条件下离心 5 分钟以沉淀，然后移除 PBS。
	<ol>
		<li>用 1 mL PBS 轻柔洗涤，并在 &#60;300 x g 条件下离心 5 分钟以沉淀，然后移除 PBS。</li>
		<li>重复步骤 4.3.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将适量组织处理凝胶（约 300 µL）置于锥形管中，放入 65 °C 干浴培养箱中加热 3–10 分钟至完全液化，以使其充分融化。
	<ol>
		<li>将组织处理凝胶加入沉淀物中，轻柔混匀。</li>
		<li>在盖玻片上放置一个小的克隆环。</li>
		<li>将组织处理凝胶与肠类器官的混合物用移液器加入固定在盖玻片上的克隆环内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织处理凝胶与肠类器官的混合物置于 4 °C 下静置 1 小时，使其充分凝固。
	<ol>
		<li>将含有已凝固混合物的克隆环浸入 70% 乙醇中，为石蜡包埋做准备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 用于RNA和蛋白质提取的类器官收集
<ol>
	<li>轻轻从每个孔中移除完全人源类肠道培养基。</li>
	<li>加入 1 mL PBS，轻柔吹打上下混合，以溶解基底膜基质。注意不要使类肠体解离。
	<ol>
		<li>将 PBS/类肠体混合液转移至无菌的 2 mL 圆底离心管中。</li>
		<li>在 &#60;300 x g 条件下离心 5 分钟，以收集沉淀。</li>
		<li>小心移除 PBS，注意不要吸走类肠体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 5.2 共两次。</li>
	<li>置于 -80 °C 冻存，直至进行蛋白质和/或 RNA 提取。</li>
	<li>采用成熟的 qRT-PCR 和蛋白质印迹技术对类肠体进行基因表达分析和蛋白质分离。</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li>
<li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li>
<li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids%3A+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).</li>
<li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li>
<li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这种新型的离体人肠道类器官模型为研究坏死性小肠结肠炎（NEC）中的肠道屏障功能障碍提供了一种有效的方法。本文所介绍的类器官处理方法改编自Misty Good博士、Michael Helmrath博士和Jason Wertheim博士先前的研究工作10,11,12。
整个组织采集及隐窝分离的时间安排是本方案中的关键步骤。组织必须在手术切除的同时立即采集，并在组织送达实验室后尽快进行隐窝分离处理。本模型选用年龄小于3个月的患者组织。如确有需要，组织采集后可在24小时内延迟处理。此外，人源组织样本的质量显著影响隐窝分离的得率。研究发现，无基础病理改变的健康小肠组织，尤其是来自较年轻患者（&#60;2个月龄）的组织，可获得最佳结果。此外，应从切除标本中最健康的区域取材，通常选择远端部分。使用过大的肠段并不能提高隐窝分离效率，尤其是在本方案所述溶液用量条件下。长度约1-2 cm、重量为0.75-2.5 g的...

人肠类器官是一种源自人类肠道组织样本中分离出的肠隐窝干细胞的体外三维培养系统。该突破性模型由Hans Clevers等人于2007年首次建立，其基础是发现了小鼠小肠隐窝中的Lgr5+干细胞1。他们的研究为建立可在无显著遗传或生理改变的情况下连续传代的多种细胞类型的体外肠道上皮培养体系奠定了基础2。自该发现以来，肠类器官已被用作研究正常消化生理功能以及肠道疾病（如炎症性肠病、宿主-病原体相互作用）和再生医学等领域的新模型2。
利用类肠器官（enteroids）作为研究肠道病理生理学的离体模型，相较于其他技术具有多项优势。过去几十年中，研究人员主要依赖动物模型和永生化的肠道癌来源细胞系来研究肠道生理学3,4,5。单细胞培养无法体现正常肠上皮中存在的多种细胞类型，因而缺乏细胞间的相互作用，以及在蛋白质表达、信号传导和病原体诱导疾病方面的肠段特异性6。类肠器官中的干细胞可分化为多种主要的上皮细胞类型，包括肠吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等3。它们具有极性，能够执行上皮转运功能，并表现出肠段特异性6。由于类肠器官能够重现人类肠上皮的多种细胞类型，因此可克服基于癌细胞系统的这一公认局限性。随着时间推移，细胞系的衍生株经过亚克隆后会逐渐演化，表现出更广泛的蛋白质表达和定位差异3。相反，类肠器官可在传代过程中保持显著稳定的遗传和生理特性2。尽管目前已存在多种坏死性小肠结肠炎（NEC）的动物模型，但不同物种对损伤和治疗干预的反应可能存在显著差异。由于这些局限性，来自动物模型的治疗手段在进入人体试验时，有90%因毒性或疗效差异而失败3。类肠器官作为有前景的临床前模型，有望克服上述缺陷，从而更深入地理解复杂的肠道病理生理机制，并推动更成功且具成本效益的治疗创新。最近的研究证据还表明，生成类肠器官所用组织的年龄在生物学上仍具有重要意义7。这一点对我们的模型尤为关键，因为本研究中使用的类肠器官来源于新生儿组织，因而与NEC患者的生理状态具有高度相关性。
类肠器官作为人类疾病模型的应用价值不断扩展，有望为严重且普遍的疾病找到治疗方法。坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种毁灭性的新生儿肠道疾病，其特征为肠道组织坏死，常导致肠壁穿孔、败血症甚至死亡8。由于NEC的病理生理机制复杂且为多因素所致，其确切发病机制尚未完全阐明；然而，肠道通透性增加已被明确证实参与了疾病的发生过程8。鉴于在人类受试者（尤其是儿童）中研究NEC及潜在治疗药物存在伦理挑战，因此迫切需要利用源自人类新生儿组织的、具有生物学相关性的类肠器官模型来研究NEC。迄今为止，类肠器官在NEC研究中的应用仍较为有限。本实验方案描述了一种利用人肠道组织样本来源的类肠器官作为研究坏死性小肠结肠炎的新型离体（ex vivo）模型的方法。

<table><tbody><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R&amp;D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>ThermoFisher</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（不含维生素 A）</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质（Matrigel）</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>Sigma</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gemini Bio-Pro</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma</td><td>G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（L-谷氨酰胺）</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-胃泌素 1</td><td>Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>ThermoFisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R&amp;D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>组织处理凝胶（Histogel）</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R&amp;D Systems INC</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型的人类上皮类肠体坏死性小肠结肠炎模型

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种严重危害新生儿的疾病，其特征是人类肠道上皮发生多种病理生理改变，导致肠道通透性增加、上皮修复受损以及细胞死亡增多。尽管已有多种动物模型用于研究 NEC，但不同物种对损伤和治疗干预的反应可能存在显著差异。此外，直接在人体尤其是儿童中研究疾病病理生理机制或新型治疗药物在伦理上具有挑战性。因此，建立一种基于人体组织的新型 NEC 模型具有重要意义。肠类器官（enteroids）是由肠道上皮细胞衍生而来的三维类器官，非常适合研究复杂的生理相互作用、细胞信号传导以及宿主-病原体防御机制。本文描述了一种从接受肠切除手术患者中分离肠道干细胞后培养人源肠类器官的实验方案。隐窝细胞在含有促进其向人类肠道上皮固有各种细胞类型分化的生长因子的培养基中进行培养。这些细胞生长于一种合成的、富含胶原蛋白的蛋白质混合物中，该混合物作为支架模拟细胞外基底膜。由此形成的肠类器官具备顶-基底极性。在培养基中联合使用脂多糖（LPS）可诱导肠类器官产生炎症反应，导致其组织学、基因表达和蛋白质表达的改变，类似于人类 NEC 中所观察到的变化。利用人体组织构建的 NEC 实验模型可能为药物和治疗方法在进入人体试验前提供更准确的测试平台，从而助力我们寻找该疾病的治愈手段。

铺板后立即观察，新分离的肠隐窝呈细长杆状。数小时内，类肠体将变为圆形（图1a）。接下来的数天内，类肠体将开始形成球状结构，如图1b所示。出芽现象应在5至10天之间出现（图1c），此时应进行类肠体的收集。
生长中的肠类器官还会表现出极性，具有集中的管腔、顶膜边界和基底外侧区域（图2）。肠类器官也显示出结构完整性，表现为强健的肌动蛋白细胞骨架（图3）。在培养数天后，经LPS处理的肠类器官会经历更多的细胞凋亡，且产量低于对照组（<strong class="xfi...

类肠器官正在成为研究人类疾病的一种新型模型。本方案描述了如何利用从新生儿组织获得的类肠器官，通过脂多糖（LPS）处理来模拟人类坏死性小肠结肠炎的类肠器官模型。所获得的类肠器官表现出类似于人类坏死性小肠结肠炎的炎症变化。

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种严重危害新生儿的疾病，其特征为人体肠道出现多种病理生理改变……

类肠体是由肠上皮细胞衍生的三维类器官，非常适合用于研究复杂的生理相互作用、细胞信号传导以及宿主对病原体的防御机制。本实验方案描述了如何在从接受肠切除手术的患者中分离出肠干细胞后，进行人类类肠体的培养。在我们的培养基中共同给予脂多糖可诱导类肠体产生炎症反应，导致组织学、基因和蛋白质表达的改变，这些改变与人类坏死性小肠结肠炎中所观察到的变化相似。鉴于在人体尤其是儿童中研究坏死性小肠结肠炎及潜在治疗药物存在伦理挑战，利用这种基于人类新生儿组织的新型且具有生物学相关性的类肠体坏死性小肠结肠炎模型显得尤为理想。该技术的主要优势在于，类肠体能够重现人类肠上皮的多种细胞类型，并克服了动物模型和基于细胞系统的公认局限性。本次操作将由外科住院医师Christie Buonpane和本实验室的技术员Carrie Yuan进行示范。在手术室内采集样本时，应将人小肠组织样本置于冷的DPBS中。用冷的DPBS冲洗样本，直至其血液和粪便残留物完全清除。 将样本保存在 RPMI 1640 培养基中，置于 4°C 下，直至准备进行隐窝分离。准备操作时，再次检查样本是否已清除粪便和血液。使用精细的解剖剪刀去除多余的脂肪组织以及手术夹和缝合钉。称量组织样本，取约0.75至2.5克的组织块。接着将组织切成0.5厘米见方的小块，放入含有30毫升螯合缓冲液一的离心管中。在4°C条件下，以低速振荡15分钟。随后，使用孔径为100微米的细胞滤筛过滤组织，并弃去滤过液。将过滤后的组织加入含有30毫升螯合缓冲液二号的离心管中。在4摄氏度下以低速振荡15分钟。将组织通过100微米滤膜过滤，并弃去滤过液。随后，将500微升基底膜基质置于冰上解冻，以备后续使用。取部分组织加入含有10毫升冷DMEM的50毫升锥形管中，并用手剧烈振荡10秒。将此悬液通过100微米细胞滤筛过滤，并收集滤过液。将此管置于冰上保存。在另一50毫升锥形管中加入少量组织和10毫升冷DMEM，用手剧烈震荡10秒。将此悬液通过100微米细胞滤筛过滤，并收集滤过液。重复该过程两次，共进行四次，直至获得四个分别标记为一至四的锥形管，每管均含有滤过液。随后，将编号为一的试管中的溶液再次通过100微米细胞滤筛过滤，并将滤过液转移至另一个标记为一号的15毫升锥形管中。对第2至第4管重复此步骤。将15毫升离心管在4摄氏度条件下以200 × g离心15分钟。在超净工作台中，移除每管中的上清液并弃去。避免扰动紧邻沉淀物上方的组织云状物，即使这意味着需留下部分上清液。在每个离心管中，缓慢地上下吹打，使沉淀物与残留的上清液充分混匀。将每管中的混合液转移至一个2毫升的锥形离心管中，在4°C条件下以200 × g离心20分钟。此后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 500 µL 预先解冻的基底膜基质中。使用预冷的移液器吸头将 50 µL 该悬液加至 24 孔板中孔的中央。此样品应呈现圆顶状。重复此操作过程九次，共填充10个孔。将24孔板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟，以使凝胶聚合。随后，向每个孔中加入500 µL完全人源类肠道培养基。在相同条件下继续孵育，并确保每两天更换一次培养基。首先，在第0天，向每孔中500微升完整的人类类肠道培养基加入10微升LPS，使其终浓度为每毫升5毫克。随后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育，并每两天更换一次添加了LPS的培养基，直至收样。为进行石蜡包埋，首先轻轻移除培养基，加入1毫升PBS，轻柔吹打上下混匀，以溶解基底膜基质，同时注意避免裂解肠类器官。以低于300 ×g的转速离心5分钟，使类器官沉淀，随后移除PBS。加入4%多聚甲醛，在室温下静置1小时以固定样本。以低于300 ×g的速度离心5分钟，使多聚甲醛沉淀，然后去除多聚甲醛。用1毫升磷酸盐缓冲液轻轻洗涤，并以低于300 ×g的速度离心5分钟，然后去除磷酸盐缓冲液。用 PBS 重复此洗涤步骤一次。将所需量的组织处理凝胶放入锥形管中，在 65 摄氏度的干浴孵育器中加热 3 至 10 分钟，直至完全液化。随后，将熔化的组织处理凝胶加入沉淀物中，轻轻混匀。将一个小型克隆环放入盖玻片中。用移液器将组织处理凝胶与类肠体混合物加入固定在盖玻片上的克隆环内。在4°C条件下静置一小时，使组织处理凝胶与类肠体混合物凝固。然后，将含有凝固混合物的克隆环浸入70%乙醇中，以准备进行石蜡包埋。接种后，新分离的肠隐窝呈长杆状。数小时内，肠类器官将变为圆形。在接下来的几天内，肠类器官将开始形成球状结构。出芽现象通常在5到10天之间出现，此时应进行肠类器官的收集。生长中的肠类器官还表现出极性，具有中心管腔、顶膜边界以及基侧区域。类肠体还表现出由强健的肌动蛋白细胞骨架所代表的结构完整性。培养数天后，经LBS处理的类肠体出现更多的细胞凋亡，且产量低于对照组。与对照组相比，在LPS处理的类肠体中，如在坏死性小肠结肠炎的小鼠模型中所见的人类NEC情况类似，Toll样受体4的表达增加。也可收集类肠体，利用已建立的qRT-PCR和蛋白质印迹技术进行基因表达分析和蛋白质提取。

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免疫学与感染

一种新的坏死性肠结肠炎人上皮肠素模型

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了解利用人新生儿肠道组织培养肠类器官并施用脂多糖诱导炎症反应的方法，用于研究坏死性小肠结肠炎。该模型克服了动物模型的局限性，为儿科肠道疾病研究提供了符合伦理的替代方案。

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