单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

该方法展示了利用单分子计数技术对液体样品中蛋白质含量进行定量的校准过程。具体而言，该方法可以说明如何在单个分子水平上对蛋白质群体进行荧光标记。以往的方法采用整体测量来分析荧光分子与蛋白质分子的摩尔比，但无法揭示蛋白质群体标记的异质性程度。

我们的方法能够在单分子水平上直接实现这一目标。该方法可拓展用于超灵敏和高级的分子浓度检测，从而为未来的诊断技术奠定基础，实现对样本中致病分子的高效检测。该方法可用于基于荧光抗体的单一种类蛋白质分析，也可用于基于非特异性标记物的多种蛋白质种类分析，适用于电泳或色谱分离后的全部蛋白质。

该技术最关键的要点是获得数据的可重复性。在测量多个样本时，我建议尽可能保持相同的实验条件。本技术的可视化演示将展示如何使每个实验步骤稳定且可重复。

它还将展示一些生物化学实验方案中不常见的步骤，例如显微镜盖玻片的旋涂和清洗。开始此操作前，按照文本方案中的说明配制裂解缓冲液和1%吐温-20。使用氢氧化钠将pH值调节至12。

将100微升裂解缓冲液与1微升1摩尔的DDT和4微升50% CHAPS混合。加入1微升制备好的细胞培养物，通过缓慢移液混匀溶液以避免产生气泡。在室温下避光孵育5分钟，并轻轻振荡。

然后，通过缓慢吹打重悬溶液使其重新均质。加入一微克Cy3 NHS酯染料，并通过缓慢吹打混匀溶液，避免产生气泡。在室温下避光孵育10分钟，同时轻轻振荡。

重复此步骤，加入等量染料并孵育样本一次。加入100微升0.8摩尔的HEPES-氢氧化钠，调节溶液pH至7.2以终止反应。缓慢吹打混匀溶液。

接下来，加入 20 µL 生物素-2-胺和 5 µL EDC。通过缓慢吹打混匀溶液。室温避光孵育，轻度振荡反应一小时。

随后，使用截留分子量为10千道尔顿的超滤柱去除未反应的标记试剂，并浓缩样品。对蛋白质样品和分子量标准品进行常规SDS-PAGE电泳后，对凝胶成像以确定蛋白质条带的位置。根据条带位置，使用锋利的刀片切下包含目标蛋白质组分的凝胶部分。

首先，准备尺寸为 22 毫米 × 22 毫米、厚度为 0.15 毫米的盖玻片。使用等离子清洗仪将盖玻片暴露于空气等离子体中处理 1 分钟，以清洁并活化其表面。接着，使用旋涂仪将 200 µL 链霉亲和素缓冲液（avadin buffer）滴加到盖玻片上，先以 500 RPM 旋涂 5 秒，随后以 1000 RPM 旋涂 30 秒。

将盖玻片在室温下孵育15分钟，使其自然干燥。为准备用于蛋白样品的盖玻片，请使用已稀释的蛋白样品。将100 µL稀释后的样品置于链霉亲和素（avidin）包被的盖玻片中央。

室温避光孵育15分钟。制备阳性对照时，取100微升纯化的荧光素标记生物素，置于pH 7.2的5微摩尔HEPES-氢氧化钠溶液中，滴加于链霉亲和素包被的盖玻片中央。室温避光孵育15分钟。

制备阴性对照时，将200微升含2毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）但不含链霉亲和素（avadin）的5毫摩尔HEPES-氢氧化钠溶液旋涂在等离子体处理过的盖玻片上。随后加入100微升溶于pH 7.2的5微摩尔HEPES-氢氧化钠缓冲液中的纯化荧光标记生物素。室温下避光孵育15分钟。

此后，用移液器在盖玻片边缘加入 200 微升蒸馏水冲洗每一片盖玻片，注意移液器吸头不要接触盖玻片中央区域。重复此洗涤步骤三次。然后，将相同数量的新的盖玻片暴露于空气等离子体中处理一分钟。

将洁净的盖玻片置于每个已结合样品的盖玻片上，以防止干燥。启动宽场或全内反射荧光显微镜。将盖玻片放置于显微镜上，并找到焦平面。

然后，进行图块扫描以获取至少100张图像。在本研究中，每种标记蛋白在细胞中的标记均一性在经SDS-PAGE分离后进行定量分析。此处显示的是来自HeLa细胞裂解液的蛋白质不同分子量组分的原始图像数据，以及阳性和阴性对照。

蛋白样品和阳性对照每张图像中均显示出100至500个斑点，而阴性对照则几乎没有或完全没有斑点。这表明该过程能有效抑制染料与盖玻片表面的非特异性结合。蛋白样品和阳性对照的斑点强度直方图呈现多个峰，分别代表染料随机结合到蛋白质中的伯胺基团以及链霉亲和素四聚体结构上。

所有荧光点在持续激光激发下均表现出闪烁和逐步光漂白现象，表明实现了单分子水平的观测。标记占有率（LO）通过计算每个蛋白质样品中荧光点数量与阳性对照中荧光点数量的比值得出。从HeLa细胞裂解液样品测得的LO值在较小分子量组分中为50%，在较高分子量组分中可达90%。

未经过分离的全蛋白质组样品的LO被观察到为72%。使用新鲜配制的试剂并避免任何灰尘至关重要，尤其是在盖玻片制备过程中。按照此步骤，可在特定体积内进行单分子计数分析，以定量每种蛋白质的浓度。例如，可对任何粗提产物、凝胶电泳产物或毛细管电泳产物进行分析。

该技术为单分子荧光成像在分子医学、有机化学和组学分析中的应用开辟了道路。通过在浓度与分子数量之间建立联系。浓氢氧化钠具有腐蚀性，操作时应穿戴适当的防护装备。

此外，高功率激光辐射可能导致眼睛损伤，因此应佩戴防护眼镜。