用于小鼠中枢神经系统鼻内递送siRNA时的小鼠定位装置

本方案详细介绍了用于将生物分子经鼻递送至小鼠中枢神经系统的定位装置的使用方法。使用该装置可显著减少对小鼠的操作和处理时间，从而提高该技术的效率和可重复性。开始操作前，需通过足底反射评估小鼠的麻醉水平，以维持其手术麻醉状态。

接下来，将定位装置放置在适当的距离和高度，以便方便地接触所有所需的试剂。然后，将眼膏涂抹在动物的眼睛上。使用固定椅带将一只小鼠固定，确保小鼠的前肢在放松且无不适的姿势下提供自然支撑。

对剩余小鼠重复上述操作。将每只小鼠轻轻放置在指定的固定椅上，使其背部与椅背支撑平行，并与椅座呈90度角。让动物自然处于头朝下、向前的位置，不要推压或施加压力。

将所有小鼠固定后，立即开始鼻内接种。进行鼻内给药时，用微量移液器吸取 2 µL RVG9R siRNA 复合物溶液。用惯用手持移液器，并用另一只手加以支撑，以避免给予 siRNA 时发生不受控制的移动。

将约两微升的液滴放置在靠近小鼠一侧鼻孔的位置，使其能够直接吸入。如果难以形成微小液滴，请更换新的移液器吸头并重复操作。在小鼠吸气时，用食指轻轻下压其头部并保持五秒钟，维持该姿势。

为防止药物流入肺部，在小鼠吸气时，用食指轻轻将小鼠头部向下压住并持续五秒至关重要。此后立即启动秒表，计时三到四分钟，以便为第一只小鼠的另一侧鼻孔进行接种。该时间间隔对于小鼠完成首次给药的吸入并恢复正常的呼吸节律是必要的。

在第一只小鼠两侧鼻孔交替接种的三到四分钟间隔内，完成装置上其余三只小鼠每只单侧鼻孔的鼻内接种。当秒表响起时，接种第一只小鼠的第二侧鼻孔，并按上述方法依次对其他小鼠重复操作。重复该步骤，直至四只小鼠均完成 20 至 30 微升的接种量。

完成整个接种过程大约需要 30 至 45 分钟。将动物放回指定的笼子中。在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得让其无人看管。

为评估基因沉默效果，使用RNA纯化试剂盒从不同脑区提取RNA，利用cDNA合成试剂盒将RNA逆转录为cDNA，并使用引物对进行qPCR检测。首先利用本文所述的小鼠定位装置，检测了RVG9R肽段（标记Alexa Fluor 488）在脑部递送的效果。接种后48小时，切除多种器官以检测A488荧光强度。

在阴性对照组的所有器官中均未检测到任何信号。另一方面，仅在RVG9R接种组小鼠的大脑中检测到强烈的A488荧光信号。此外，还比较了小鼠放置位置与仰卧位法和清醒状态法在效果上的差异。

结果表明，将小鼠头部置于向下和前倾的位置，可改善 RVG9R A488 在整个脑组织中的穿透性和沉积效果。为进一步确认 siRNA 向脑部的递送情况，在单次经鼻给予与 Cy5 标记的 siRNA 形成复合物的 RVG9R 后，进行了全脑扫描。与 PBS 或 RVM9R 相比，RVG9R 复合物在主要脑区（包括嗅球、皮层、海马、丘脑、下丘脑、中脑和小脑）均显示出 siRNA 的显著富集。

该定位装置可用于向小鼠中枢神经系统递送药物或分子。其应用范围包括治疗药物的测试以及中枢神经系统内细胞机制的研究。研究人员已使用该定位装置证明了siRNA在治疗西尼罗河病毒病中的有效性，并探索了其他中枢神经系统疾病的治疗方法。