在自然界中,Cas9是一种免疫蛋白,可抵御入侵病毒,进化后更喜欢具有混杂特异性的Cas9,这种特异性可以通过自发突变切割病毒DNA。我们构建了一个人工定向进化系统,它更喜欢具有高特异性的优化的Cas9变种。负选择和正面选择在狙击手筛查系统中同时工作。
Cas9 具有减少的目标活动,还可以同时筛选具有减少目标活动以及保持目标活动。随机引入整个Cas9序列的突变,以生成要筛选的库。这使得在意外位置找到突变成为可能。
目前,许多学术界和工业界的研究人员正在使用Y型Cas9进行治疗开发。但是,Y 型 Cas9 的特异性未得到优化,这可能导致紧密包装。在人类中,这意味着随机基因的意外突变,这可能导致严重的副作用。
有许多Cas9像酶,这是正在开发的治疗。我们的技术可用于提高其他DNA和核的特异性,如吉平格,泰国和Cas9也如CPF1。使库足够大是增加获得具有重要功能的变体的可能性的关键。
确保冷却步骤效率高,并使用高效称职的电池。为了开始这个程序,添加一个CCDB质粒和SGRNA质粒的南图,双不匹配到解冻的BW25141 GOI细胞的50微升。通过移液轻轻混合细胞,并将它们转移到预冷却的0.1厘米电穿孔盒中。
通过电穿孔将大肠杆菌与两个质粒进行转化。电穿孔完成后,立即添加250微升S、SOC介质。轻轻移液溶液,混合细胞和介质,将混合物转移到1.5毫升微离心管中。
恢复转化的细胞,并在32摄氏度下孵育,轻轻摇晃一小时。继续准备文本协议中概述的 Snyper 筛选单元。当准备执行 Snyper 筛选时,使用前面描述的 elctropation 过程,将 Snyper 筛选细胞与每个库中准备好的 Cas9 变种质粒的 100 纳米图进行转换。
然后,将250微升细胞转移到一个新鲜的1.5毫升微离心管。将 250 个 ATC 象形图添加到每毫升 10 毫微克的最终浓度中。在32摄氏度下用轻轻的震动孵育一小时,恢复含 ATC 和 ATC 无 ATC 的细胞。
在含有氯霉素和卡纳霉素的LB汞板上回收无 ATC 细胞的板 25 微升。将 ATC 添加到回收的 ATC 中,在 245 毫米 LB 的汞板上,最终浓度为每毫升 100 毫微克。立即将含 ATC 的细胞板镀在含有氯霉素、卡那霉素和阿拉伯糖的 LB 碳中。
在32摄氏度下孵育所有板过夜。第二天,拍下盘子。使用开放式 CFU 软件,计算可行菌落的数量,确保非选择性板上的菌落数量至少比库的多样性大十倍,以涵盖所有变体。
从所有三个库中拉出在选择性板块上幸存下来的殖民地。将这些池菌落转移到250毫升的LB介质中,辅以氯霉素,并在42摄氏度下孵育过夜。首先,加载 Cas OF Finder 软件以选取目标站点。
选择适用于特定类型的 Cas9 和目标基因组的 PAM 类型。填写查询序列选项卡。选择不匹配的数字,然后单击提交按钮。
几秒钟后,将出现目标站点和目标外站点。通常,选择一到三个不匹配的离目标站点。接下来,订购具有模板序列的CRRNA和轨道RRNA寡,并放大文本协议中概述的模板。
在2%的加糖凝胶上分析放大模板DNA的两微升,然后净化模板。在37摄氏度下孵育反应混合物过夜。第二天,加入0.5微升DNAse,在37摄氏度下孵育15至30分钟,然后净化SGRNA。
然后,在100个单位的RNAse抑制剂存在的情况下,用250个单位的小牛肠道碱性磷酸酶治疗10微克的体外转录RNA,在3摄氏度下进行3小时,然后净化经过的SGRNA。首先,在DMEM中保持 HEK293 T 细胞,在 37 摄氏度下辅以 10%FBS 和 1% 抗生素,辅以 5% 的二氧化碳。接下来,将野生型或Snyper Cas9蛋白的两微克与两微克的SGRNA混合,并在室温下孵育十分钟,使RNP复合物。
trypsin化和计数细胞,然后洗涤它们,并在电穿孔缓冲液中准备,如文本协议中所述。使用 1300 伏特的脉冲将 RNP 复合物电化到电池中,间隔 30 毫秒。电穿孔后立即将细胞板放在一个48孔的板上,板上装满了500微升的DMEM,并辅以10%FBS和1%抗生素。
在37摄氏度下孵育,二氧化碳含量为5%。在 DMEM 中保持 HEK293 T 细胞,并在 37 摄氏度下以 10% FBS 和 1% 抗生素补充 5%二氧化碳。转染前一天,对细胞进行三试和计数。
如果工作在48井规模,板10,000细胞每井和250微升的完整生长介质。使用基于脂质的转染试剂,准备250纳米的P3S Cas9质粒和250纳米的SGRNA转染。然后,将质粒混合在25微升无血清 MEM 中。
用25微升无血清 MEM 稀释一微升转染试剂。在室温下孵育这种混合物五分钟。将质粒混合物与转染试剂混合物结合,在室内孵育20分钟,形成质粒脂质胺复合物。
在此之后,将这种混合物的50微升直接添加到每个含有细胞的井中。轻轻摇动板来回混合。在转染后48至72小时,在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育细胞,然后进行转基因表达检测。
在隔离先前准备的基因组DNA后,通过GDNA的PCR扩增生成深度测序库,并基于目标和非靶点。然后,使用索引底注标记每个样本。使用下一代测序机使池库具有配对的端排序。
执行 Snyper 屏幕后,可以通过将选择性 LB 板上的菌落数除以非选择性 LB 板上的菌落数来计算生存菌落的百分比。虽然使用 SP Cas9 的库执行此百分比通常非常低,但可以通过使用幸存的池重复屏幕来丰富真正的正命中数。具有代表性的 Snyper 屏幕显示,在第三个屏幕之后,获得 100% 的存活率。
使用 RNP 或质粒编码的 Snyper Cas9 进行转染,可针对各种目标进行,并可对目标安培康测序进行目标上和目标外活动测量。在大多数目标,Snyper Cas9 显示的目标活动水平和更高的特异性比相比野生类型。截断的 SGRNA 也可用于进一步提高特异性。
在第一个清洁步骤中,更高的转换效率非常重要,不要丢失具有高特异性的克隆。以后的筛选步骤重复的转换效率较低,因为克隆在第一个筛选步骤中已经丰富,并且丢失克隆的可能性较小。在 Snyper 屏幕中,我们将发现多个克隆。
这些克隆的目标和非目标活动应在尽可能多的不同目标中进行描述,以选择具有最佳性能的克隆。通过这种方法,科学家可以提高Cas9样酶的特异性,而不会损失目标活性。此外,科学家不需要事先了解蛋白质的结构来改进。