利用 niper-cas9 在不损失目标活动的情况下通过定向进化, 最大限度地减少 crispr-cas9 的非目标效应

在自然界中，Cas9是一种免疫蛋白，可抵御入侵病毒，进化后更喜欢具有混杂特异性的Cas9，这种特异性可以通过自发突变切割病毒DNA。我们构建了一个人工定向进化系统，它更喜欢具有高特异性的优化的Cas9变种。负选择和正面选择在狙击手筛查系统中同时工作。

Cas9 具有减少的目标活动，还可以同时筛选具有减少目标活动以及保持目标活动。随机引入整个Cas9序列的突变，以生成要筛选的库。这使得在意外位置找到突变成为可能。

目前，许多学术界和工业界的研究人员正在使用Y型Cas9进行治疗开发。但是，Y 型 Cas9 的特异性未得到优化，这可能导致紧密包装。在人类中，这意味着随机基因的意外突变，这可能导致严重的副作用。

有许多Cas9像酶，这是正在开发的治疗。我们的技术可用于提高其他DNA和核的特异性，如吉平格，泰国和Cas9也如CPF1。使库足够大是增加获得具有重要功能的变体的可能性的关键。

确保冷却步骤效率高，并使用高效称职的电池。为了开始这个程序，添加一个CCDB质粒和SGRNA质粒的南图，双不匹配到解冻的BW25141 GOI细胞的50微升。通过移液轻轻混合细胞，并将它们转移到预冷却的0.1厘米电穿孔盒中。

通过电穿孔将大肠杆菌与两个质粒进行转化。电穿孔完成后，立即添加250微升S、SOC介质。轻轻移液溶液，混合细胞和介质，将混合物转移到1.5毫升微离心管中。

恢复转化的细胞，并在32摄氏度下孵育，轻轻摇晃一小时。继续准备文本协议中概述的 Snyper 筛选单元。当准备执行 Snyper 筛选时，使用前面描述的 elctropation 过程，将 Snyper 筛选细胞与每个库中准备好的 Cas9 变种质粒的 100 纳米图进行转换。

然后，将250微升细胞转移到一个新鲜的1.5毫升微离心管。将 250 个 ATC 象形图添加到每毫升 10 毫微克的最终浓度中。在32摄氏度下用轻轻的震动孵育一小时，恢复含 ATC 和 ATC 无 ATC 的细胞。

在含有氯霉素和卡纳霉素的LB汞板上回收无 ATC 细胞的板 25 微升。将 ATC 添加到回收的 ATC 中，在 245 毫米 LB 的汞板上，最终浓度为每毫升 100 毫微克。立即将含 ATC 的细胞板镀在含有氯霉素、卡那霉素和阿拉伯糖的 LB 碳中。

在32摄氏度下孵育所有板过夜。第二天，拍下盘子。使用开放式 CFU 软件，计算可行菌落的数量，确保非选择性板上的菌落数量至少比库的多样性大十倍，以涵盖所有变体。

从所有三个库中拉出在选择性板块上幸存下来的殖民地。将这些池菌落转移到250毫升的LB介质中，辅以氯霉素，并在42摄氏度下孵育过夜。首先，加载 Cas OF Finder 软件以选取目标站点。

选择适用于特定类型的 Cas9 和目标基因组的 PAM 类型。填写查询序列选项卡。选择不匹配的数字，然后单击提交按钮。

几秒钟后，将出现目标站点和目标外站点。通常，选择一到三个不匹配的离目标站点。接下来，订购具有模板序列的CRRNA和轨道RRNA寡，并放大文本协议中概述的模板。

在2%的加糖凝胶上分析放大模板DNA的两微升，然后净化模板。在37摄氏度下孵育反应混合物过夜。第二天，加入0.5微升DNAse，在37摄氏度下孵育15至30分钟，然后净化SGRNA。

然后，在100个单位的RNAse抑制剂存在的情况下，用250个单位的小牛肠道碱性磷酸酶治疗10微克的体外转录RNA，在3摄氏度下进行3小时，然后净化经过的SGRNA。首先，在DMEM中保持 HEK293 T 细胞，在 37 摄氏度下辅以 10%FBS 和 1% 抗生素，辅以 5% 的二氧化碳。接下来，将野生型或Snyper Cas9蛋白的两微克与两微克的SGRNA混合，并在室温下孵育十分钟，使RNP复合物。

trypsin化和计数细胞，然后洗涤它们，并在电穿孔缓冲液中准备，如文本协议中所述。使用 1300 伏特的脉冲将 RNP 复合物电化到电池中，间隔 30 毫秒。电穿孔后立即将细胞板放在一个48孔的板上，板上装满了500微升的DMEM，并辅以10%FBS和1%抗生素。

在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。在 DMEM 中保持 HEK293 T 细胞，并在 37 摄氏度下以 10% FBS 和 1% 抗生素补充 5%二氧化碳。转染前一天，对细胞进行三试和计数。

如果工作在48井规模，板10，000细胞每井和250微升的完整生长介质。使用基于脂质的转染试剂，准备250纳米的P3S Cas9质粒和250纳米的SGRNA转染。然后，将质粒混合在25微升无血清 MEM 中。

用25微升无血清 MEM 稀释一微升转染试剂。在室温下孵育这种混合物五分钟。将质粒混合物与转染试剂混合物结合，在室内孵育20分钟，形成质粒脂质胺复合物。

在此之后，将这种混合物的50微升直接添加到每个含有细胞的井中。轻轻摇动板来回混合。在转染后48至72小时，在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育细胞，然后进行转基因表达检测。

在隔离先前准备的基因组DNA后，通过GDNA的PCR扩增生成深度测序库，并基于目标和非靶点。然后，使用索引底注标记每个样本。使用下一代测序机使池库具有配对的端排序。

执行 Snyper 屏幕后，可以通过将选择性 LB 板上的菌落数除以非选择性 LB 板上的菌落数来计算生存菌落的百分比。虽然使用 SP Cas9 的库执行此百分比通常非常低，但可以通过使用幸存的池重复屏幕来丰富真正的正命中数。具有代表性的 Snyper 屏幕显示，在第三个屏幕之后，获得 100% 的存活率。

使用 RNP 或质粒编码的 Snyper Cas9 进行转染，可针对各种目标进行，并可对目标安培康测序进行目标上和目标外活动测量。在大多数目标，Snyper Cas9 显示的目标活动水平和更高的特异性比相比野生类型。截断的 SGRNA 也可用于进一步提高特异性。

在第一个清洁步骤中，更高的转换效率非常重要，不要丢失具有高特异性的克隆。以后的筛选步骤重复的转换效率较低，因为克隆在第一个筛选步骤中已经丰富，并且丢失克隆的可能性较小。在 Snyper 屏幕中，我们将发现多个克隆。

这些克隆的目标和非目标活动应在尽可能多的不同目标中进行描述，以选择具有最佳性能的克隆。通过这种方法，科学家可以提高Cas9样酶的特异性，而不会损失目标活性。此外，科学家不需要事先了解蛋白质的结构来改进。