Name: 利用 niper-cas9 在不损失目标活动的情况下通过定向进化, 最大限度地减少 crispr-cas9 的非目标效应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 了解利用定向进化优化CRISPR-Cas9特异性的Sniper筛选系统，在保持靶点活性的同时减少脱靶效应。该方法可筛选高保真Cas9变体，适用于基因治疗研究。

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本研究得到了韩国科技信息通信部（2017M3A9B4061406）以及韩国国家研究基金会（NRF）由韩国政府（MSIT）资助的项目（资助编号：2017M3A9B4061404 和 2018M3A9H3020844）对 Jungjoon K. Lee 的支持。编码 pGRG36 的质粒由 Nancy Craig 惠赠（Addgene 质粒 #16666），p11-LacY-wtx1 质粒由 Huimin Zhao 惠赠。

<ol><li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li>
<li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li>
<li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048(2018).</li>
<li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li>
<li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li>
<li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5%27+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218(2017).</li>
<li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190(2017).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191(2017).</li>
<li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+easy+and+efficient%3A+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39(2006).</li>
<li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenCFU%2C+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072(2013).</li>
<li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154(2005).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-Analyzer%3A+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li>
<li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li>
</ol>

ToolGen 已就 Sniper-screen 提交了专利申请（PCT/KR2017/006212，状态：待审，发明人：Jungjoon K. Lee）。Jungjoon K. Lee、Joonsun Lee、Minhee Jung 和 Euihwan Jeong 是 ToolGen 公司的员工。

对于希望避免繁琐筛选流程以获得 Sniper-Cas9 的研究者，Sniper-Cas9 蛋白及其编码质粒均可获取。利用这些材料，应确定 sgRNA 的最佳长度，即能够提供最高特异性比率的长度。此外，建议以核糖核蛋白复合物（RNP）形式递送 Sniper-Cas9 和 sgRNA，因为与质粒形式递送相比，通常可实现更高的特异性比率。与 Sniper-Cas9 不同，其他工程化 Cas9 变体不兼容截短的 sgRNA6,7 或以 RNP 形式递送8（HiFi-Cas9 除外）。
对于Sniper-screen而言，错配序列的选择是最关键的步骤。应避免选择与目的基因（GOI）序列具有较低切割活性相关联的错配sgRNA。否则，具有野生型特异性水平的Cas9变体会无法切割含有错配靶位点的大肠杆菌（E. coli）基因组DNA，从而导致大量背景菌落的产生，危及整个筛选过程。
与酵母相比，大肠杆菌（E. coli）具有更快的倍增时间以及更高的转化效率，因此Sniper-screen相较于基于酵母的筛选方法具有优势。此外，与其他将错配位点携带在质粒上的大肠杆菌（E. coli）系统相比，Sniper-screen应具有更高的灵敏度：在我们的系统中，基因组DNA仅有一个拷贝，因此错配位点也只有一个拷贝，而在单个大肠杆菌（E. coli）细胞内则存在大量质粒。
其他可诱导双链断裂（DSBs）的DNA内切酶（如SaCas9或Cpf1）的特异性也可通过使用Sniper-screen进行优化。然而，Sniper-screen无法直接用于提高碱基编辑器的特异性，因为碱基编辑器不会在大肠杆菌（E. coli）的基因组DNA中诱导双链断裂。由于碱基编辑器在其系统核心中使用Cas9的切口酶或失活版本，因此可通过利用Sniper-screen筛选获得的阳性结果来提高碱基编辑器的特异性。

在本文中，我们旨在通过结合多种策略来提高Cas9的特异性。目前已有多种方法用于避免CRISPR-Cas9的脱靶效应。例如，可使用截短的sgRNA以实现更高的特异性1。此外，可通过将Cas9的递送方式从质粒形式改为核糖核蛋白（RNP）形式来提高特异性2。已根据先前报道的合理化设计，对Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）蛋白中的特定氨基酸残基进行了修饰3,4,5。或者，也可随机改变氨基酸残基，并利用酵母6或E. coli7,8筛选系统鉴定出特异性最高的Cas9变体。
然而，许多研究团队报告称，采用旨在削弱Cas9与底物之间非特异性相互作用的设计所构建的Cas9变体，其靶向活性较低。7,8,9,10,11,12我们开发了一种 E. coli基于定向进化系统Sniper-screen筛选随机突变的Cas9变体。一个 E. coli 筛选系统相较于酵母系统具有优势，因其具有更快的倍增时间和更高的转化效率 E. coli.
Sniper筛选法利用三种不同的质粒以及整合到大肠杆菌（E. coli）基因组中的目的基因（GOI），同时进行阴性与阳性筛选。Cas9变体由低拷贝数质粒上的CMV-PltetO1双启动子系统表达，使得在E. coli中鉴定出的候选变体可直接在哺乳动物细胞中进行测试，无需亚克隆步骤。目的基因（GOI）通过Tn7转座子系统导入E. coli基因组中。sgRNA质粒含有温度敏感型复制起点，可表达靶向GOI的sgRNA，但sgRNA与GOI序列之间并非完全匹配。第三个质粒上存在一个完全匹配的sgRNA靶位点，该质粒携带ccdB基因，其编码一种可致死的毒素蛋白，能够抑制DNA旋转酶（gyrase）活性。在此系统中，表达具有高脱靶活性Cas9变体的细胞会因基因组DNA中错配位点处产生双链断裂（DSBs）而被清除；另一方面，表达低靶向活性Cas9变体的细胞也会因ccdB基因的致死性表达而被淘汰。通过调节无水四环素（ATC）的浓度，可改变Cas9变体的表达水平，从而调整筛选压力。
我们推断，将错配的sgRNA靶位点定位于基因组DNA而非质粒上，将提高该系统的灵敏度。这种方法的优势在于，基因组中仅有一个靶位点，而在单个大肠杆菌（E. coli）细胞内可能存在多个含有靶位点的质粒。
利用该系统，我们鉴定出一种Cas9变体Sniper-Cas9，其在靶向活性方面达到与野生型Cas9相当的水平，同时脱靶活性较野生型Cas9显著降低。通过使用截短型sgRNA或以核糖核蛋白复合物（RNP）形式递送，而非质粒递送，Sniper-Cas9可实现更高的特异性比率。

<table><tbody><tr><td>小牛肠道碱性磷酸酶（CIP）</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>盐酸无水四环素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37919 或 94664</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Welgene</td><td>LS203-01</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Enzynomics</td><td>R003L</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4408</td><td></td></tr><tr><td>Diversify PCR 随机诱变试剂盒</td><td>Clontech</td><td>630703</td><td>易错 PCR 试剂盒</td></tr><tr><td>DNA 打散试剂盒</td><td>Jena Bioscience</td><td>PP-103</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Welgene</td><td>LM001-17</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Endura 电转感受态细胞（DUO）</td><td>Lucigen</td><td>60242-2</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 文库构建用电转感受态细胞</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Welgene</td><td>S101-01</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 电穿孔设备</td></tr><tr><td>GeneMorph II 随机诱变试剂盒</td><td>Agilent</td><td>200550</td><td>易错 PCR 试剂盒</td></tr><tr><td>基因组 DNA 提取试剂盒</td><td>GenAll</td><td>106-152</td><td>gDNA 提取试剂盒</td></tr><tr><td>甘油</td><td>BioShop</td><td>GLY001.1</td><td></td></tr><tr><td>GP/MP 电穿孔杯，0.1 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>BR165-2089</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 电穿孔设备</td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>人源细胞系</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Acros Organics</td><td>450810500</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-阿拉伯糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>LaboPass PCR 纯化试剂盒</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>LaboPass 质粒小提试剂盒</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>小提试剂盒</td></tr><tr><td>LB 琼脂 Miller</td><td>Formedium</td><td>LMM0202</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤 Miller</td><td>Formedium</td><td>LMM0102</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 组装预混液</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>吉布森组装（等温 &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; 重组）混合液</td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>Thermo</td><td>MPK5000</td><td>RNP 电穿孔设备</td></tr><tr><td>Neon 转染系统 10 &amp;micro;L 试剂盒</td><td>Thermo</td><td>MPK1096</td><td>RNP 电穿孔设备</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740420.50</td><td>中提试剂盒</td></tr><tr><td>Oligo Clean &amp; Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>可实现低洗脱体积的 DNA 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>LS31985070</td><td>转染培养基</td></tr><tr><td>p11-lacY-wtx1</td><td>Addgene</td><td>#123945</td><td></td></tr><tr><td>pgrg36</td><td>Addgene</td><td>#16666</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 诱变菌株</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸酶</td><td>NEB</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>核糖核苷酸溶液套装</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0251L</td><td></td></tr><tr><td>Turbo Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Enzynomics</td><td>R013L</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Red 感受态细胞</td><td>Agilent</td><td>200129</td><td></td></tr></tbody></table>

利用 sniper-cas9 通过定向进化在不损失靶上活性的前提下最小化 crispr-cas9 的脱靶效应

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

将成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（Cas9）开发为治疗手段时，必须避免其潜在的有害脱靶效应。已有多种方法被设计用于降低此类效应。本文介绍一种基于大肠杆菌（Escherichia coli）的定向进化方法，称为Sniper筛选法（Sniper-screen），用于获得一种具有优化特异性和保留靶向活性的Cas9变体，即Sniper-Cas9。利用Sniper筛选法，可同时进行阳性与阴性筛选。该筛选还可使用其他单导向RNA（sgRNA）序列重复进行，以富集真正的阳性克隆。通过使用CMV-PltetO1双启动子表达Cas9变体，可在哺乳动物细胞中快速检测文库的整体表现。本文还描述了进一步提高Sniper-Cas9特异性的方法。首先，既往研究表明，使用截短型sgRNA可提高Cas9的特异性。与其他工程化Cas9不同，Sniper-Cas9在与截短型sgRNA联用时仍能保持野生型（WT）水平的靶向活性。其次，Sniper-Cas9可采用核糖核蛋白（RNP）形式递送，而非质粒形式，且不会影响其靶向活性。

完成狙击手筛选（Sniper-screen）后，可通过将含有氯霉素、卡那霉素、阿拉伯糖和ATC的LB平板（CKAA）上的菌落数除以仅含氯霉素和卡那霉素的LB平板（CK）上的菌落数，计算出存活菌落的百分比。当使用SpCas9文库进行狙击手筛选时，该百分比通常非常低。通过使用存活菌落池重复筛选，可富集真正的阳性结果。例如，在本代表性狙击手筛选中，第三次筛选后获得了100%的存活率（图1）。可利用核糖核蛋白复合物（RNP）或质粒编码的Sniper-Cas9对多个靶点进行转染，并通过靶向扩增子测序检测相应的靶上和脱靶活性（图2）。在大多数靶点上，Sniper-Cas9相较于野生型（WT）表现出相当的靶上活性水平以及更高的特异性比率。截短的sgRNA也可用于进一步提高特异性（图3）。然而，由于在大多数情况下，与全长sgRNA相比，截短的sgRNA会导致较低的靶上活性，因此其应用仅限于少数靶点。因此，必须测试不同长度的sgRNA（从17到20个核苷酸），并同时检测其靶上和脱靶活性，以优化特异性。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg" /> 
图1：使用不同随机Cas9变体文库进行的代表性Sniper筛选。 突变文库、EP文库I和EP文库II表示使用不同商业试剂盒构建的文库。第一轮、第二轮和最终轮表示富集筛选进行的次数7。该图已根据Lee等人的研究修改7。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg" /> 
图2：通过质粒或核糖核蛋白（RNP）递送的20碱基向导序列与WT-Cas9或Sniper-Cas9配对时的靶向与脱靶活性。特异性比率通过将靶向活性除以脱靶活性计算得出。误差条表示标准误（SEM）（n = 3）7。本图改编自Lee等人的研究7。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg" /> 
图3：使用不同长度的sgRNA靶向FANCF01和AAVS位点时，Sniper-Cas9与WT-Cas9的靶向活性和脱靶活性比较。 特异性比率通过将靶向位点的插入缺失频率除以相应脱靶位点的插入缺失频率来确定。图中注明了在5'末端具有匹配鸟嘌呤的sgRNA（GX18或GX19）以及在5'末端不具有匹配鸟嘌呤的sgRNA（gX17、gX18、gX19或gX20）。当标准化的靶向活性过低时，未计算特异性比率。 &#60;70%7该图已根据 Lee 等人的研究修改。7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种优化CRISPR-Cas9系统以在不降低靶上活性的前提下提高其特异性的实验方案。我们采用一种名为Sniper-screen的定向进化方法，筛选具有理想特性的Cas9突变体。Sniper-Cas9可与截短的单导向RNA（truncated single-guide RNAs）以及核糖核蛋白（ribonucleoprotein）递送形式兼容，这两种策略均为已知可提高特异性的常用方法。

利用 Sniper-Cas9 通过定向进化在不损失靶上活性的前提下最小化 CRISPR-Cas9 的脱靶效应

将成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（Cas9）开发为治疗手段需要……

在自然界中，Cas9 是一种针对入侵病毒的免疫蛋白，而进化过程更倾向于选择具有广泛特异性的 Cas9，这种 Cas9 能够切割发生自发突变的病毒 DNA。我们构建了一种人工定向进化系统，该系统更倾向于筛选出具有高特异性的优化 Cas9 变体。在 Sniper 筛选系统中，阴性筛选和阳性筛选同时进行。可同时筛选出脱靶活性降低但靶上活性得以保留的Cas9变体。通过对整个Cas9序列随机引入突变以构建待筛选文库，从而有可能发现位于非预期位点的突变。目前，许多学术界和工业界的研究人员正在使用Y型Cas9进行治疗开发。然而，Y型Cas9的特异性尚未优化，可能导致脱靶效应。在人类中，这意味着随机基因可能发生意外突变，从而引发严重副作用。目前有许多类似 Cas9 的酶正在被开发用于治疗领域。我们的技术可用于提高其他 DNA 和核酸酶（如 Jipinger、Thailand 以及 CPF1 等 Cas9 类蛋白）的特异性。构建足够大的文库是提高获得具有重要功能变体可能性的关键。务必确保冷却步骤的高效率，并使用高效的感受态细胞。开始该操作时，将1纳克含有双错配的CCDB质粒和SGRNA质粒加入50微升已解冻的BW25141 GOI细胞中。用移液器轻轻混匀细胞，然后转移至预冷的0.1厘米电穿孔比色皿中。通过电穿孔将两种质粒转化至大肠杆菌中。电穿孔完成后，立即加入250 µL SOC培养基。轻轻吹打溶液以混匀细胞与培养基，并将混合液转移至1.5 mL微量离心管中。回收转化后的细胞，并在32摄氏度下轻轻振荡培养一小时。同时，按照文本方案中的说明继续制备Snyper筛选细胞。当准备进行Snyper筛选时，使用此前描述的电穿孔方法，将各文库中制备好的Cas9变体质粒各100纳克转入Snyper筛选细胞中。然后，将250 µL细胞转移至新的1.5 mL微量离心管中。加入250 pg ATC，使其终浓度为10 ng/mL。将含有ATC和不含ATC的细胞在32 °C条件下轻轻振荡培养1小时，进行复苏。将25微升不含ATC的回收细胞涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂平板上。向含有ATC的回收细胞中加入ATC，使其在245毫米LB琼脂平板中的终浓度为每毫升100纳克。立即将含ATC的细胞涂布于含有氯霉素、卡那霉素和阿拉伯糖的LB琼脂平板上。将所有平板在32摄氏度下孵育过夜。第二天，拍摄平板照片。使用开源CFU软件计数可存活菌落数量，并确保非选择性平板上的菌落数量至少比文库的多样性大十倍，以覆盖所有变异体。从三个文库的筛选平板上挑取存活的菌落。将这些混合菌落转移至 250 毫升 LB 培养基中，加入氯霉素，并在 42 摄氏度下过夜培养。首先，加载 Cas OF finder 软件以选择靶位点。选择适用于特定 Cas9 类型和目标基因组的 PAM 类型。填写查询序列选项卡。选择错配数量，然后点击提交按钮。几秒后，将显示靶向位点和脱靶位点。通常，选择含有一至三个错配的脱靶位点。接下来，根据文本方案中所述步骤，订购带有模板序列的CRRNA和Track RRNA寡核苷酸，并扩增该模板。取2 µL扩增的模板DNA，在2%琼脂糖凝胶上进行分析，然后纯化模板。将反应混合物在37 °C下孵育过夜。次日，加入0.5 µL DNA酶，于37 °C孵育15至30分钟，然后纯化sgRNA。然后，在100单位RNA酶抑制剂存在下，将10微克体外转录的RNA与250单位小牛肠碱性磷酸酶在3摄氏度下孵育3小时，随后纯化处理后的sgRNA。首先，将HEK293T细胞培养于添加了10% FBS和1%抗生素的DMEM培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下维持培养。接着，将2微克野生型或Snyper Cas9蛋白与2微克sgRNA混合，在室温下孵育10分钟，以形成RNP复合物。用胰蛋白酶消化并计数细胞，然后洗涤细胞，并按照文本方案中的说明将细胞重悬于电穿孔缓冲液中。使用1300伏、30毫秒的单次脉冲，将RNP复合物电穿孔转入细胞中。电穿孔后立即把细胞接种到48孔板中，每孔加入500微升DMEM培养基，培养基中添加10%胎牛血清和1%抗生素。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用添加10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基培养HEK293 T细胞。转染前一天，用胰蛋白酶消化并计数细胞。若在48孔板规模下操作，每孔接种10,000个细胞，并加入250微升完全培养基。使用基于脂质的转染试剂，准备250纳克P3S Cas9质粒和250纳克SGRNA用于转染。然后，将质粒混合于25微升无血清MEM中。取1微升转染试剂与25微升无血清MEM培养基混合。室温孵育5分钟。将质粒混合物与转染试剂混合物混合，室温孵育20分钟，以形成质粒脂质体复合物。此后，将 50 微升该混合物直接加入每个含有细胞的孔中。轻轻前后摇动培养板以混匀。转染后，在二氧化碳培养箱中 37 摄氏度下孵育细胞 48 至 72 小时，然后检测外源基因的表达。在分离先前制备的基因组DNA后，通过使用靶向目标位点和脱靶位点的引物对基因组DNA进行PCR扩增，构建深度测序文库。然后，使用索引引物对每个样本进行标记。将文库混合后，利用高通量测序仪进行双端测序。在完成 Snyper 筛选后，可通过将选择性 LB 平板上的菌落数除以非选择性 LB 平板上的菌落数，计算出存活菌落的百分比。尽管使用 SP Cas9 文库进行筛选时，该百分比通常非常低，但可通过利用存活菌落池重复筛选来富集真正的阳性结果。一次典型的 Snyper 筛选显示，在第三次筛选后可获得 100% 的存活率。可使用核糖核蛋白复合物（RNP）或质粒编码的Snyper Cas9对多个靶点进行转染，并通过靶标扩增子测序检测相应的靶向和脱靶活性。在大多数靶点上，Snyper Cas9表现出与野生型相当的靶向活性，同时具有更高的特异性比率。此外，使用截短的sgRNA可进一步提高特异性。在第一次清洗步骤中实现较高的转化效率非常重要，以避免丢失具有高特异性的克隆。后续筛选步骤对转化效率的依赖程度较低，因为在初次筛选步骤中克隆已被富集，丢失它们的可能性较小。在Snyper筛选中将会发现多个克隆。应尽可能在多种不同靶标中对这些克隆的靶向效应和脱靶效应进行表征，以筛选出性能最佳的克隆。通过该方法，科研人员可以在不损失靶向活性的前提下提高Cas9样酶的特异性。此外，科研人员在优化过程中无需预先了解蛋白质的结构信息。

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科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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