利用 Sniper-Cas9 通过定向进化在不损失靶上活性的前提下最小化 CRISPR-Cas9 的脱靶效应

在自然界中，Cas9 是一种针对入侵病毒的免疫蛋白，而进化过程更倾向于选择具有广泛特异性的 Cas9，这种 Cas9 能够切割发生自发突变的病毒 DNA。我们构建了一种人工定向进化系统，该系统更倾向于筛选出具有高特异性的优化 Cas9 变体。在 Sniper 筛选系统中，阴性筛选和阳性筛选同时进行。

可同时筛选出脱靶活性降低但靶上活性得以保留的Cas9变体。通过对整个Cas9序列随机引入突变以构建待筛选文库，从而有可能发现位于非预期位点的突变。

目前，许多学术界和工业界的研究人员正在使用Y型Cas9进行治疗开发。然而，Y型Cas9的特异性尚未优化，可能导致脱靶效应。在人类中，这意味着随机基因可能发生意外突变，从而引发严重副作用。

目前有许多类似 Cas9 的酶正在被开发用于治疗领域。我们的技术可用于提高其他 DNA 和核酸酶（如 Jipinger、Thailand 以及 CPF1 等 Cas9 类蛋白）的特异性。构建足够大的文库是提高获得具有重要功能变体可能性的关键。

务必确保冷却步骤的高效率，并使用高效的感受态细胞。开始该操作时，将1纳克含有双错配的CCDB质粒和SGRNA质粒加入50微升已解冻的BW25141 GOI细胞中。用移液器轻轻混匀细胞，然后转移至预冷的0.1厘米电穿孔比色皿中。

通过电穿孔将两种质粒转化至大肠杆菌中。电穿孔完成后，立即加入250 µL SOC培养基。轻轻吹打溶液以混匀细胞与培养基，并将混合液转移至1.5 mL微量离心管中。

回收转化后的细胞，并在32摄氏度下轻轻振荡培养一小时。同时，按照文本方案中的说明继续制备Snyper筛选细胞。当准备进行Snyper筛选时，使用此前描述的电穿孔方法，将各文库中制备好的Cas9变体质粒各100纳克转入Snyper筛选细胞中。

然后，将250 µL细胞转移至新的1.5 mL微量离心管中。加入250 pg ATC，使其终浓度为10 ng/mL。将含有ATC和不含ATC的细胞在32 °C条件下轻轻振荡培养1小时，进行复苏。

将25微升不含ATC的回收细胞涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂平板上。向含有ATC的回收细胞中加入ATC，使其在245毫米LB琼脂平板中的终浓度为每毫升100纳克。立即将含ATC的细胞涂布于含有氯霉素、卡那霉素和阿拉伯糖的LB琼脂平板上。

将所有平板在32摄氏度下孵育过夜。第二天，拍摄平板照片。使用开源CFU软件计数可存活菌落数量，并确保非选择性平板上的菌落数量至少比文库的多样性大十倍，以覆盖所有变异体。

从三个文库的筛选平板上挑取存活的菌落。将这些混合菌落转移至 250 毫升 LB 培养基中，加入氯霉素，并在 42 摄氏度下过夜培养。首先，加载 Cas OF finder 软件以选择靶位点。

选择适用于特定 Cas9 类型和目标基因组的 PAM 类型。填写查询序列选项卡。选择错配数量，然后点击提交按钮。

几秒后，将显示靶向位点和脱靶位点。通常，选择含有一至三个错配的脱靶位点。接下来，根据文本方案中所述步骤，订购带有模板序列的CRRNA和Track RRNA寡核苷酸，并扩增该模板。

取2 µL扩增的模板DNA，在2%琼脂糖凝胶上进行分析，然后纯化模板。将反应混合物在37 °C下孵育过夜。次日，加入0.5 µL DNA酶，于37 °C孵育15至30分钟，然后纯化sgRNA。

然后，在100单位RNA酶抑制剂存在下，将10微克体外转录的RNA与250单位小牛肠碱性磷酸酶在3摄氏度下孵育3小时，随后纯化处理后的sgRNA。首先，将HEK293T细胞培养于添加了10% FBS和1%抗生素的DMEM培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下维持培养。接着，将2微克野生型或Snyper Cas9蛋白与2微克sgRNA混合，在室温下孵育10分钟，以形成RNP复合物。

用胰蛋白酶消化并计数细胞，然后洗涤细胞，并按照文本方案中的说明将细胞重悬于电穿孔缓冲液中。使用1300伏、30毫秒的单次脉冲，将RNP复合物电穿孔转入细胞中。电穿孔后立即把细胞接种到48孔板中，每孔加入500微升DMEM培养基，培养基中添加10%胎牛血清和1%抗生素。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，使用添加10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基培养HEK293 T细胞。转染前一天，用胰蛋白酶消化并计数细胞。

若在48孔板规模下操作，每孔接种10,000个细胞，并加入250微升完全培养基。使用基于脂质的转染试剂，准备250纳克P3S Cas9质粒和250纳克SGRNA用于转染。然后，将质粒混合于25微升无血清MEM中。

取1微升转染试剂与25微升无血清MEM培养基混合。室温孵育5分钟。将质粒混合物与转染试剂混合物混合，室温孵育20分钟，以形成质粒脂质体复合物。

此后，将 50 微升该混合物直接加入每个含有细胞的孔中。轻轻前后摇动培养板以混匀。转染后，在二氧化碳培养箱中 37 摄氏度下孵育细胞 48 至 72 小时，然后检测外源基因的表达。

在分离先前制备的基因组DNA后，通过使用靶向目标位点和脱靶位点的引物对基因组DNA进行PCR扩增，构建深度测序文库。然后，使用索引引物对每个样本进行标记。将文库混合后，利用高通量测序仪进行双端测序。

在完成 Snyper 筛选后，可通过将选择性 LB 平板上的菌落数除以非选择性 LB 平板上的菌落数，计算出存活菌落的百分比。尽管使用 SP Cas9 文库进行筛选时，该百分比通常非常低，但可通过利用存活菌落池重复筛选来富集真正的阳性结果。一次典型的 Snyper 筛选显示，在第三次筛选后可获得 100% 的存活率。

可使用核糖核蛋白复合物（RNP）或质粒编码的Snyper Cas9对多个靶点进行转染，并通过靶标扩增子测序检测相应的靶向和脱靶活性。在大多数靶点上，Snyper Cas9表现出与野生型相当的靶向活性，同时具有更高的特异性比率。此外，使用截短的sgRNA可进一步提高特异性。

在第一次清洗步骤中实现较高的转化效率非常重要，以避免丢失具有高特异性的克隆。后续筛选步骤对转化效率的依赖程度较低，因为在初次筛选步骤中克隆已被富集，丢失它们的可能性较小。在Snyper筛选中将会发现多个克隆。

应尽可能在多种不同靶标中对这些克隆的靶向效应和脱靶效应进行表征，以筛选出性能最佳的克隆。通过该方法，科研人员可以在不损失靶向活性的前提下提高Cas9样酶的特异性。此外，科研人员在优化过程中无需预先了解蛋白质的结构信息。