Name: 一种可靠、可重复的可重复的大鼠部分股骨缺陷模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 了解大鼠节段性股骨缺损模型的建立方法，该模型采用外固定支架稳定骨折部位，结合BMP-2胶原海绵支架促进骨再生，为骨科修复治疗研究提供可靠、可重复且经济适用的实验平台。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）设备资助项目1S10OD023676-01的支持，以及威斯康星大学骨科与康复学系和医学院与公共卫生学院的额外支持。我们谨此致谢威斯康星大学卡博内癌症中心支持资助项目P30 CA014520及其小型动物影像设施的使用，同时感谢NIH培训资助项目5T35OD011078-08对H. Martin的支持。我们还感谢Michael和Mary Sue Shannon对肌肉骨骼再生合作项目的资助。

本研究中使用的大鼠每日护理均遵循《美国兽医协会动物安乐死指南：2013年版》16。在项目开始前，威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会已对本实验方案进行评估并批准实施。
1. 动物
<ol>
	<li>使用体重约为 350 g 的远交系 Sprague-Dawley 雄性大鼠。</li>
</ol>
2. 骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）浸渍海绵支架的制备
注意：支架制备应在植入股骨前立即进行（参见步骤 6.14）。
<ol>
	<li>按照已上市的rhBMP-2骨移植试剂盒的使用说明操作，该试剂盒包含胶原海绵、冻干rhBMP-2和用于重悬的无菌水17。在保持无菌条件下，用无菌水将rhBMP-2重悬至浓度为1.5 mg/mL。</li>
	<li>使用无菌剪刀和无菌尺，修剪浸有rhBMP-2的胶原海绵，使其重塑为适合5 mm × 3 mm × 3 mm缺损的形状。</li>
	<li>使用注射器将rhBMP-2溶液均匀滴加在胶原海绵上，使其充分吸收。</li>
</ol>
3. 自定义外固定装置的制备
注意：更完整的尺寸列表请参见图1A。
<ol>
	<li>使用线锯或其他合适工具，将铝板坯料（6061型，厚度0.088英寸）切割成两块（1.4英寸 × 6英寸）。</li>
	<li>将其中一块固定在铣床上，使用1/8英寸、90°尖角的碳化钨钻铣刀，沿长度方向加工四条“V”形槽（深度0.035英寸）。另一块保持未切割状态。</li>
	<li>从这两块材料上分别切割出宽度为0.3英寸的单个板片（图1B）。测量并钻出适用于4-40螺纹的螺钉孔。对带有“V”形槽的板片攻制4-40螺纹，对无槽板片则钻出适用于#4螺钉的通孔。</li>
	<li>对两块板片进行打磨，以圆滑边缘并减轻重量（图1C）。</li>
	<li>使用4-40、18-8不锈钢圆头内六角螺钉（0.25英寸长）将两块板片拧合在一起，使带槽面与平整板面紧密贴合（图1D）。</li>
</ol>
4. 麻醉程序与镇痛
<ol>
	<li>通过将大鼠置于诱导室中并输送 4 L/min 的 O₂ 和 4% 异氟烷来诱导麻醉2/min，使用4%异氟烷。 
	注意：研究人员必须避免吸入麻醉气体，并在实验室内保持适当的通风橱和通风条件。</li>
	<li>在大鼠失去翻正反射后将其从舱室中取出，连接鼻罩，并通过鼻部给予维持剂量的麻醉剂（O2 输送速率为2-3 L/min，异氟烷浓度为0.8%。</li>
	<li>将大鼠置于加热垫上或保温灯下，以防止低体温。</li>
	<li>通过捏脚趾或测试眼睑反射来确认麻醉深度是否足够。</li>
	<li>为眼睛涂抹润滑剂，以防止角膜干燥。</li>
	<li>在大鼠躯干/背部远离手术部位处皮下注射缓释丁丙诺啡（1 mg/kg），以在术后提供长达3天的镇痛作用。</li>
</ol>
5. 无菌制备与抗生素预防措施
<ol>
	<li>使用13号刀片剃除后肢周围的毛发th 肋、足、背中线和腹中线作为边缘。</li>
	<li>使用浸有10%聚维酮碘的无菌2×2纱布擦拭剃毛区域，随后用70%乙醇擦拭，重复各4次，交替进行。</li>
	<li>向手术侧股四头肌注射头孢唑林（20 mg/kg），采用肌内注射方式。</li>
	<li>术后7天内，在饮水中给予恩诺沙星（0.25 mg/ml），以持续提供抗生素保护。</li>
	<li>在整个研究期间，将大鼠置于含药物饲料（例如 Uniprim）中，以预防针道感染。</li>
	<li>术后每天在皮肤-钢针交界处涂抹双重抗生素软膏一次，持续3天。 
	注意：避免任何外部固定针或夹具松动，因其可能导致感染发生。</li>
</ol>
6. 手术步骤
注意：务必努力保持无菌区域和工作空间，并在整个操作过程中遵循无菌技术。
<ol>
	<li>将剃毛后的大腿穿过带窗的透明粘性铺巾，用无菌毛巾覆盖手术台，以建立无菌区域。</li>
	<li>触诊股骨，使用#15刀片在皮肤上做一前外侧切口，从髌骨延伸至股骨近端的大转子处。</li>
	<li>沿肌间隔小心切开腿部外侧筋膜，将前方的股外侧肌（股四头肌的一部分）与后方的腘绳肌分离，直至暴露股骨外侧。保留臀中肌腱在大转子上的止点。</li>
	<li>进行细致且无创的环周软组织剥离，从外侧开始暴露股骨干中段。操作时使用#15刀片，使刀片始终平行于骨面轮廓，轻柔地将肌肉从下方骨面分离；同时使用骨膜剥离器将已分离的肌肉从暴露的骨面抬起，并环绕股骨干继续剥离，直至股骨干中段周围7–10 mm范围内的软组织完全清除，为截骨术做好准备。 
	注意：避免损伤股骨内侧的神经血管束。</li>
	<li>插入四根1.0 mm克氏针（Kirschner针，k针）：在股骨外侧垂直于骨面，近端和远端各置入两根，方向由外侧直穿至内侧。确保所有克氏针均贯穿双侧皮质（双皮质固定），以获得足够的稳定性（图2A）。</li>
	<li>首先插入最远端的克氏针，位置位于股骨外侧髁水平。将导向夹具紧贴股骨远端外侧，插入一根带螺纹尖端的1.0 mm克氏针。</li>
	<li>保持夹具与骨面接触的位置不变，根据夹具上的孔位确定最远端克氏针的进针点。确定位置后，根据需要沿臀肌腱纤维方向平行切开，形成一个小间隙以便近端克氏针穿过，从而最大限度减少对肌腱的医源性损伤。在此间隙中钻入一根1.0 mm无螺纹克氏针，同样确保针体贯穿双侧皮质（图2B）。</li>
	<li>保持夹具紧贴骨面，钻入两根1.0 mm带螺纹克氏针，分别位于未来缺损区域的两侧。确保克氏针贯穿双侧皮质（图2C）。</li>
	<li>将外固定杆放置于距皮肤表面1 cm高度处，拧紧螺钉以锁定固定杆。剪除多余的克氏针长度（图2D）。</li>
	<li>在准备截骨（制造缺损）前，将小型弯形拉钩置于股骨前侧和后侧周围，以保护邻近的软组织、肌肉及神经血管束。使用约5 mm的矢状摆动锯片，极其谨慎地在股骨干中段制造一个5 mm的节段性骨缺损。锯切时施加轻而均匀的压力，避免造成不必要的骨折（图2E）。</li>
	<li>在制造骨缺损过程中，根据需要使用少量冲洗液（室温0.9%无菌生理盐水（NS）），以防止骨组织发生热坏死。</li>
	<li>骨缺损形成后，用10 mL生理盐水冲洗伤口。</li>
	<li>向伤口局部注射0.1 mL含肾上腺素（1:200,000）的0.25%布比卡因，作为镇痛剂和血管收缩剂。</li>
	<li>将胶原海绵或经rhBMP-2浸泡的海绵支架（来自步骤2）裁剪为5 mm × 3 mm × 3 mm大小，植入骨缺损处。每个支架应尺寸合适，能够跨越缺损的长度和体积，以帮助海绵稳定就位。 
	注意：若需进行生物发光成像，可在本步骤同时按照下文步骤7.1–7.3所述制备并注射mRNA复合物。</li>
	<li>使用4-0可吸收缝线以单纯间断缝合法关闭肌肉层；使用4-0可吸收缝线以连续皮下缝合法关闭皮肤层，并用皮肤粘合剂封闭突出克氏针周围的缝隙。</li>
	<li>将大鼠从鼻罩中取出，继续置于加热垫上，持续监测直至大鼠能够稳定维持直立姿势。此时将其转移至清洁笼中恢复。</li>
</ol>
7. 复合mRNA的制备与生物发光成像
注意：应在发光成像前1天的手术过程中进行mRNA复合物的转染。操作mRNA时应使用无菌技术。
<ol>
	<li>将10 µL编码海肾荧光素酶（Gaussia luciferase）的mRNA（储存浓度为1 µg/µL）与30 µL脂质转染试剂混合。</li>
	<li>让mRNA-脂质复合物在室温下孵育至少5分钟以使其形成。脂质转染试剂将压缩mRNA分子，从而稳定mRNA并提高转染效率。 
	注意：如果复合物未立即使用，可在冰上保存最多1小时。</li>
	<li>使用带滤芯吸头的20 µL移液器，将一半体积的mRNA复合物分别注射至缺损的远端和近端。</li>
	<li>次日，在成像前3分钟，按照步骤4.1所述方法，使用吸入式异氟烷麻醉大鼠。</li>
	<li>将大鼠置于一个 体内 配备鼻锥的成像室，用于输送维持用异氟烷（0.8% 异氟烷，O₂）2 2-3 L/min的输送速率）</li>
	<li>在缺损附近注射用生理盐水重悬的腔肠素，剂量为每公斤体重4 mg。</li>
	<li>使用生物发光成像系统获取图像 体内 成像系统（IVIS）按照制造商说明书操作18.</li>
</ol>
8. 成像方案
<ol>
	<li>在对普通放射照相设备进行校准后，一台X射线系统19，使用吸入式异氟烷麻醉大鼠，方法如前所述（参见 步骤 4.1）并将大鼠置于吸入式异氟烷鼻罩中（0.8% 异氟烷，O2 2-3 L/min 的输送速率，用于拍摄股骨前后位（AP）X线片。
	<ol>
		<li>当大鼠处于仰卧位时，将手术侧后肢向前推进，同时屈曲髋关节和膝关节。将膝关节屈曲至约90°，用胶带将足底面向下固定于靠近体壁的位置。将胫骨置于股骨前方，以避免骨骼影像重叠。为实现髋关节轻度外展，于腹股沟区域放置一块透明海绵（厚度约15 mm）。随后获取股骨的前后位（头尾位）影像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后立即、4周和12周时重复拍摄该股骨前后位X线影像。使用胶带和纱布妥善固定动物的肢体，以确保成像质量和一致性。</li>
	<li>将大鼠从鼻罩中取出，并持续监测直至大鼠能够稳定维持直立姿势，然后放回笼中。</li>
</ol>
9. 组织学实验步骤
<ol>
	<li>根据美国兽医协会（AVMA）伦理标准，使用吸入 CO2 的方法在密闭容器中对大鼠实施安乐死16。</li>
	<li>安乐死后，剃除后肢毛发，去除手术侧肢体的皮肤，并在髋关节处分离股骨。仔细清除手术侧股骨上的所有软组织（包括肌肉、肌腱和韧带），仅保留缺损部位周围的一层薄肌肉，以防止在解剖过程中对愈合区域造成意外损伤。</li>
	<li>将股骨置于室温下的10%中性缓冲福尔马林溶液中固定3至4天，福尔马林与组织体积比应保持为15:1。在固定过程中间时段更换一次固定液。</li>
	<li>使用pH值为6.5的15%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液对股骨进行脱钙处理，持续3至4周。定期采集连续X线片以判断脱钙终点。</li>
	<li>沿矢状面中线从前向后纵向切开股骨，将组织送检进行常规石蜡包埋及苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色。</li>
	<li>将H&amp;#38;E染色切片送至病理学家处进行组织学评估。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益或收益。本文作者未直接或间接获得任何利益。

骨科损伤（如完全性骨折）的小型动物模型能够支持探索成骨机制以及评估生物材料治疗潜力的研究20。本研究介绍了一种通过定制外固定器稳定的节段性骨缺损大鼠模型，该模型可由实验室与生物医学工程团队轻松复制，用于进一步研究承重条件下的骨修复过程。
以往在大鼠模型中使用临界尺寸骨缺损的研究通常依赖于内固定钢板21,22,23,24。尽管两种固定方法在临床上均可接受，但外固定具有明显优势，包括造成更少的软组织损伤和失血量，减少总的植入物表面积以最大限度降低细菌定植的机会，并允许术后调节以及分阶段的外科干预6。以往的动物骨折外固定模型采用了不同的钢板材料、钢针固定方式和/或骨切割方法12,</...

骨科创伤外科专注于治疗各种复杂的骨折。临床上，由于周围肌肉和骨膜的再生能力降低以及局部血管生成失败，大段骨干骨缺损的治疗一直较为困难1。现代治疗方法包括手术固定联合植骨、延迟植骨（Masquelet技术）、骨搬运、融合或截肢2,3,4。对于创伤后仍保留行走功能且远端肢体功能良好的大多数患者而言，保肢显然是更优的治疗选择5。这些保肢治疗通常需要在较长的治疗过程中进行分期手术干预。一些学者认为，与内固定相比，外固定在这些应用中更具优势，因其植入时对组织的损伤更小、植入物表面积更小，且术后固定器更具可调节性6。然而，目前一项前瞻性随机对照试验正在进行中，旨在澄清在胫骨严重开放性骨折治疗中内固定与外固定之间的争议7。遗憾的是，无论选择哪种治疗方法，并发症和治疗失败的发生率仍然较高8,9。无论采用何种治疗方式，针对节段性骨缺损，外科医生都必须应对节段性骨干缺损所带来的重大挑战。矫正节段性缺损时，必须在最大程度稳定骨骼的同时，促进成骨过程10,11。
由于临床上重要但发生率较低的骨干临界尺寸节段性骨缺损，建立一种有效且可重复的动物模型对于推动研究团队改进治疗技术并最终改善临床预后至关重要。研究人员需要开展研究 在体内 哺乳动物模型中的生理性愈合机制。尽管此类外固定模型已经存在12,13,14,15我们希望为未治疗动物的骨不连提供一种更可靠的评估方法，通过选择经济型固定材料以降低成本，并制定一个简明的手术方案，便于未来研究的推广应用。本方案的主要目标是在大鼠中建立一种可靠且可重复的骨干临界缺损模型。该手术操作通过在12周内评估大鼠股骨的固定稳定性与骨愈合情况来进行验证。次要目标包括：尽可能构建经济实惠的模型、简化手术入路与固定方式，以及确保动物的伦理福利。作者及研究团队已开展初步实验，测试了多种不同的生物材料和潜在再生疗法，以促进该节段性骨缺损的愈合。

<table><tbody><tr><td>0.9% 无菌生理盐水</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>用于伤口冲洗和补液</td></tr><tr><td>10% 碘/聚维酮</td><td>Carefusion</td><td>1215016</td><td>用于皮肤准备</td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>VWR</td><td>89370094</td><td>用作固定剂</td></tr><tr><td>1mm 无螺纹克氏针</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1003.15</td><td>已灭菌，用于最靠近近端的针孔</td></tr><tr><td>1mm 有螺纹克氏针</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1005.15</td><td>已灭菌，用于最远端的3个针孔</td></tr><tr><td>2×2 纱布</td><td>Covidien</td><td>4006130</td><td>已灭菌，用于皮肤准备和吸收血液</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>4015304</td><td>用于关闭肌肉层和皮肤层</td></tr><tr><td>4-40 x 0.25&quot;, 18-8 不锈钢圆头内六角螺钉</td><td>通用</td><td></td><td>外固定架组件</td></tr><tr><td>4200 无线驱动器</td><td>Stryker</td><td>OR-S-4200</td><td>用于钻入克氏针</td></tr><tr><td>4×4 纱布</td><td>Covidien</td><td>1219158</td><td>已灭菌，用于吸收血液</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>用于皮肤准备</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer Healthcare LLC, 动物保健部门</td><td>312.10010.3</td><td>作为抗生素加入饮水中</td></tr><tr><td>头孢唑啉</td><td>Hikma Pharmaceuticals</td><td>8917156</td><td>术前抗生素</td></tr><tr><td>CleanCap Gaussia 荧光素酶 mRNA (5moU)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7205</td><td>编码 Gaussia 荧光素酶的修饰 mRNA，使用时需保持在冰上</td></tr><tr><td>天然腔肠素</td><td>NanoLight Technology</td><td>303</td><td>Gaussia 荧光素酶的底物，用于体内评估荧光素酶活性</td></tr><tr><td>双效抗生素软膏</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson consumer Inc</td><td>8975432</td><td>术后应用于针孔部位作为伤口护理</td></tr><tr><td>双切口微型刀片</td><td>Stryker</td><td>5400-003-410</td><td>用于在股骨上制造5mm缺损</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td>用于脱钙骨组织以进行组织学准备</td></tr><tr><td>缓释布托啡诺</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>用作为期3天的镇痛药</td></tr><tr><td>带孔洞的手术巾</td><td>3M</td><td>1204025</td><td>用于建立无菌区域</td></tr><tr><td>TPS 手持式连接线</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-4N</td><td>用于在股骨上制造5mm缺损</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>K&amp;amp;H Pet Products</td><td>121239</td><td>维持大鼠体温</td></tr><tr><td>六角头螺丝刀</td><td>Wiha</td><td>263/1/16 &quot; X 50</td><td>用于紧固外固定架</td></tr><tr><td>诱导室</td><td>通用</td><td></td><td>用于大鼠麻醉</td></tr><tr><td>用重组人骨形态发生蛋白-2浸润胶原海绵</td><td>Medtronic</td><td>7510200</td><td>临床上相关治疗，作为阳性对照</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td>用于大鼠麻醉</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>生物发光成像方式</td></tr><tr><td>定位夹具</td><td>定制</td><td></td><td>用于放置双皮质骨针</td></tr><tr><td>Lipofectamine MessengerMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>LMRNA003</td><td>mRNA 复合剂，可实现 mRNA 递送</td></tr><tr><td>Sensorcaine-MPF（布比卡因 (0.25%) 和肾上腺素 (1:200,000)）</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>NDC 63323-468-37</td><td>应用于手术部位以缓解疼痛并实现血管收缩</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Hospira</td><td>8904653</td><td>用作头孢唑啉粉末的溶剂</td></tr><tr><td>钛制外固定板</td><td>定制</td><td></td><td>使用废弃钛材料和铣床在实验室自制</td></tr><tr><td>全面性能系统 (TPS) 控制台</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-1</td><td>用于在股骨上制造5mm缺损</td></tr><tr><td>TPS 微型矢状锯</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-34</td><td>用于在股骨上制造5mm缺损</td></tr><tr><td>配备 DXA 的 Ultrafocus Faxitron</td><td>Faxitron</td><td></td><td>高分辨率放射成像方式</td></tr><tr><td>Uniprim 大鼠饲料</td><td>Envigo</td><td>TD.06596</td><td>含药大鼠饲料</td></tr><tr><td>TPS 通用手控开关</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-9</td><td>用于在股骨上制造5mm缺损</td></tr><tr><td>Vetbond 组织粘合剂</td><td>3M</td><td>1469</td><td>用于皮肤闭合</td></tr></tbody></table>

一种使用定制外固定架稳定的、可靠且可重复的大鼠股骨临界尺寸节段性骨缺损模型

A Reliable and Reproducible Critical-Sized Segmental Femoral Defect Model in Rats Stabilized with a Custom External Fixator

骨科研究高度依赖动物模型，以在活体（in vivo）条件下研究骨愈合机制并探索新的治疗方法。临床上，节段性骨缺损达到临界尺寸时治疗难度较大，而建立一种可靠且可活动的小型动物节段性股骨缺损模型将有助于相关研究。本研究提出了一种优化的手术方案，可稳定、可重复地在大鼠股骨上创建一个5 mm的临界皮质骨缺损，并使用外固定架进行固定。通过定制导向装置将4枚克氏针以双侧皮质固定方式置入，再连接改良的外固定装置实现稳定。使用摆动式骨锯制造骨缺损。将仅含胶原海绵或经重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）浸润的胶原海绵植入缺损区域，并通过X线片对骨愈合过程进行为期12周的监测。12周后处死大鼠，对切除的对照组和治疗组股骨进行组织学分析。结果显示，仅植入胶原海绵的骨缺损未实现骨性连接（形成骨不连），而接受rhBMP-2治疗的缺损则出现骨膜性骨痂形成及新骨重塑。动物在植入术后恢复良好，外固定装置在12周内有效维持了股骨缺损的稳定性。该简化的手术模型可广泛应用于活体（in vivo）骨愈合机制研究，以及新型骨科生物材料和再生疗法的评估。

手术由一名外科医生在一名助手的协助下进行，耗时约一小时。经过手术优化后，术中和术后并发症显著减少，且使用定位夹具装置可确保股骨缺损的尺寸（5 × 3 × 3 mm）和位置的一致性。大鼠在麻醉苏醒后立即恢复行走，未表现出任何异常行为模式；其步态无痛性跛行，且未见对外固定器产生不适反应。
最靠近近端的克氏针选用无螺纹克氏针（图2B），因为当使用带螺纹克氏针时，近端克氏针断裂的风险最高。在某些情况下，特别是在未使用rhBMP-2或支架的对照动物中，其骨缺损未表现出任何愈合或骨形成迹象，约8周后出现一根或多根克氏针尖端断裂，如仅植入海绵的对照组股骨X线片所示（图3）。
通过放射影像和组织学（H&amp;E 染色）分析骨愈合...

体内哺乳动物大段骨缺损模型对于研究骨愈合机制和骨科治疗方法的研究人员至关重要。本文介绍了一种通过外固定装置稳定大鼠股骨节段性缺损的可重复造模方案。

骨科研究在很大程度上依赖动物模型，以在体内研究骨愈合机制，并探索新的治疗方法。

本手术方案采用一种稳定且可重复的外固定节段性骨缺损模型，用于评估骨愈合机制及潜在再生疗法的效果。我们优化了一种具有挑战性的手术方法，以创建并稳定节段性骨缺损模型，该模型操作简便、成本较低，同时适用于长期愈合研究。该技术特别适用于研究需通过外固定进行治疗的创伤性临界尺寸骨干骨缺损，但该模型仍需进一步研究验证。为防止钻孔时发生骨折，应使用高转速和低压力穿透骨外侧皮质，然后降低转速以推进。根据生产商说明书，从骨形态发生蛋白管状骨移植套件中制备支架后，使用无菌剪刀和无菌直尺将胶原海绵修剪至适合5×3×3毫米的缺损。然后使用注射器将骨形态发生蛋白-2溶液均匀滴加在海绵表面，直至全部溶液体积被完全吸收。接下来，以麻醉大鼠的第13肋、后爪以及背侧和腹侧中线为边界，剃除后肢周围的毛发，随后用浸有10%聚维酮碘和70%乙醇的无菌纱布对暴露的皮肤进行四次交替擦拭消毒。为制造股骨缺损，将剃毛后的肢体穿过带窗的透明粘性手术巾，用无菌毛巾覆盖手术台面以建立无菌区域。触诊定位股骨，使用15号刀片在皮肤上做一前外侧切口，从髌骨延伸至股骨近端的大转子处。沿肌间隔小心切开小腿外侧筋膜，将前方股四头肌的股外侧肌与后方的腘绳肌分离，直至暴露股骨外侧。保持15号手术刀片与骨面轮廓平行，轻柔地将肌肉从下方骨骼上剥离，进行细致且无创伤的环周软组织解剖，从外侧开始，在股骨中段骨干处暴露骨面。使用骨膜剥离器在解剖过程中将肌肉从暴露的骨面抬起，并环绕股骨干进行操作，直至骨干中段周围七至十毫升范围内的软组织被完全清除。接下来，在股骨外上髁水平位置插入一根克氏针，随后将导向器紧贴股骨远端外侧放置，并插入一根直径为1毫米的带螺纹尖端克氏针。然后，在保持导向器与骨骼位置不变的情况下，根据导向器上的孔位确定最靠近近端的克氏针进针点。根据需要，沿臀肌肌腱纤维方向平行切开，以在组织中形成一个小间隙，使近端克氏针能够顺利穿过，同时尽量减少对肌腱造成的医源性损伤。将一根直径一毫米的无螺纹克氏针钻入间隙，并比较已钻入的克氏针与松动克氏针的高度，以确认克氏针已贯穿两层皮质骨。保持夹具与骨面接触的位置不变，于未来缺损区域两侧各钻入一根直径一毫米的带螺纹克氏针，确保克氏针贯穿两层皮质骨，然后将外固定架横杆置于距皮肤一厘米的高度。拧紧螺钉以固定横杆，并剪除多余的克氏针长度。使用小型弯型拉钩置于股骨前侧和后侧，以保护周围的软组织、肌肉及神经血管束，采用约五毫米的矢状摆动锯片，在轻柔且均匀的压力下，非常小心地在骨干中段制造一个五毫米的节段性骨缺损。制造骨缺损后，用10毫升0.9%生理盐水冲洗伤口，并向伤口局部注射0.1毫升含肾上腺素的0.25%布比卡因，作为镇痛剂和血管收缩剂。将浸有骨形态发生蛋白-2的海绵状支架植入骨缺损处，使用4-0可吸收缝线以单纯间断缝合方式关闭肌层。然后使用4-0可吸收缝线以连续皮下缝合方式关闭皮肤层，再用皮肤胶封闭突出钢针周围的任何间隙，并在术后立即以及术后4周和12周时获取股骨的前后位X线影像。仅含胶原海绵的阴性对照缺损显示，在近端与远端骨边缘之间无骨桥接形成迹象。在截断的股骨边缘附近可见少量新骨重塑，而缺损区域本身则表现为缺乏骨性组织，存在软骨以及部分残留血肿。含有经骨形态发生蛋白-2（BMP-2）浸泡的海绵的缺损区在术后仅四周即可观察到明显的骨愈合，表现为缺损区域出现放射线不透的骨痂桥接。至12周时，缺损区域内已形成大量新的矿化沉积。从股骨截断端延伸出的骨痂中可见显著的新骨膜骨生成，且在整个缺损区域内已发育出大量编织骨和板层骨的小梁结构。此外，未见软骨沉积。移除外固定器后，通过活体成像系统进行影像学观察，可可视化缺损区域内转染的生物发光细胞。例如，将编码高丝氨酸脱氢酶（Gaussia luciferase）的复合mRNA转染后，骨髓腔内的细胞会发出生物发光信号，可用于检测愈合过程中目的基因或蛋白表达的生物学变化。针的放置对于确保稳定且持久的外固定至关重要。针应垂直于股骨，并且相互平行，以最大限度地减少断裂和感染的风险。利用此模型，可以监测特定蛋白质表达等生物学机制，以更好地理解愈合过程，同时也可以测试不同的支架生物材料或治疗方法的治疗效果。我们希望这一技术能够使未来的研究人员更高效、更有效地利用外固定装置研究骨科愈合过程，从而将其研究成果转化为临床疗效的提升。避免吸入麻醉气体，在接触甲醛和EDTA时应穿戴适当的个人防护装备，操作手术器械时需格外小心，尤其是钻头和摆动式骨锯。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种可靠、可重复的可重复的大鼠部分股骨缺陷模型

骨修复领域临床前研究的一个限制因素是对愈合骨病灶局部力学环境缺乏实验性控制。本文报道了一种可用于骨修复的外固定装置的设计与应用，该装置具有调节固定器刚度的能力 体内.

可调节刚度的外固定架用于大鼠股骨截骨术及节段性骨缺损模型

在生物医学研究中，动物模型常被用于模拟严重的骨损伤。由于小鼠体型较小，大多数研究团队难以在其体内建立稳定的骨缺损模型。本文中，我们描述了一种在小鼠中建立和分析实验性股骨缺损的简便方法。...

一种简单的小鼠股骨临界尺寸缺损模型

尽管小鼠模型在骨组织工程中是不可或缺的工具，但长骨缺损模型却较为稀少。这一需求促使了本实验方案的开发，该方案采用带有四枚螺钉的锁定钢板和专用导板，以建立并稳定可重复的股骨临界尺寸缺损，且具有较低的并发症发生率。...

建立经钢板内固定稳定的鼠股骨节段性临界尺寸缺损模型

本研究描述了一种可重复且详细的实验方案，该方案使用新开发的外固定器在大鼠股骨模型中进行牵张成骨（DO），在移除外固定器后可允许动物进行生理性的负重活动。...

一种高效且可重复的大鼠牵张成骨实验方案以实现功能性股骨再生

本文介绍了一种在大鼠股骨骨干组织中创建箱形腔隙缺损的实验方案。该模型可用于评估生物材料在生物力学应力条件下的性能，并探究与膜内成骨相关的骨再生机制。...

在大鼠股骨皮质骨中构建箱形骨腔缺损模型

本研究建立了一种大鼠股骨半节段性缺损模型，用于评估骨替代材料在无内固定或外固定条件下承受负荷时的力学性能和成骨性能。...

用于评估承重区域骨替代材料性能的大鼠半节段性骨干骨缺损模型

该研究创新性地结合缝合线与钛针，在大鼠桡骨骨折模型中实现稳定的内固定。通过微型计算机断层扫描（micro-CT）评估骨折愈合情况，并分离培养原代背根神经节（DRG）神经元以进行后续研究。...

一种新型大鼠桡骨骨折内固定模型的建立：骨折愈合评估与背根神经节分离

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。...

创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

当两种相邻的流体通过带有沟槽的微流控通道时，可被引导形成包裹预聚物核心的鞘层，从而 决定微纤维的形状和横截面。光引发聚合反应（如硫醇点击化学反应）非常适合将核心流体快速固化为具有预定尺寸和形状的微纤维。...

预设计尺寸与形状的聚合物及生物杂化纤维的微流控制备

血管化是实现成功组织工程的关键因素。因此，需要可靠的技术来评估组织构建物中血管网络的形成。本文介绍了一种简单且经济有效的方法，用于可视化并定量分析血管化 体内.

用于评估生物材料血管化的全层皮肤缺损模型 体内

了解大鼠节段性股骨缺损模型的建立方法，该模型采用外固定支架稳定骨折部位，结合BMP-2胶原海绵支架促进骨再生，为骨科修复治疗研究提供可靠、可重复且经济适用的实验平台。

一种使用定制外固定架稳定的、可靠且可重复的大鼠股骨临界尺寸节段性骨缺损模型

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