中等通量筛选实验用于评估对人精子Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响

我们的检测方法可用于测试化合物对人类精子细胞功能的影响。具体而言，这些方法可用于快速、简便地筛选大量化合物对人类精子细胞内钙信号传导和顶体反应的影响。对该方法的可视化演示将有助于其他研究人员在各自实验室中建立类似的实验。

首先，将每个1毫升的原始精液样本分别加入一个50毫升离心管中，每管对应一份样本，将离心管以45度角放置于试管架上，并向每管中加入4毫升37摄氏度的人输卵管液（Human Tubal Fluid，HTF）培养基。接着，小心地用移液器将1毫升液化后的精液样本缓慢加入每根离心管底部，随后将离心管置于37摄氏度环境中孵育1小时。孵育结束后，使用经改造的移液器吸头，以45度角持握，轻柔地将含有活动精子的HTF培养基上清液尽可能多地转移至新的15毫升塑料离心管中。

为计数收集的精子细胞，根据预期浓度，将20微升等分试样用S100缓冲液在2毫升圆底试管中稀释10、20、30、50或90倍。将稀释后的精子细胞在700转/分钟条件下涡旋振荡10秒。接着，将SP1检测盒浸入样品中，并完全下压白色推杆，使样品的等分部分被吸入检测盒内。

然后将样本盒放入成像细胞计数仪的托盘中，并根据所应用的稀释因子运行碘化丙啶（PI）染色的人类精子细胞检测。为检测游离细胞内钙离子浓度的变化，轻柔地吹打精子样本上下一次，使用自动重复移液器将50 µL荧光染料标记的精子细胞分装至384孔微孔板中一整行的24个孔内。将微孔板置于30 °C的荧光酶标仪中，并选择适用于该荧光染料的检测程序。

选择精子细胞行中的一个孔，并将增益调节至目标值20%。然后开始测量。完成10个基线循环后，暂停实验，并抽出装有微孔板的抽屉。使用12通道移液器，迅速向该行的12个重复孔中每孔加入25 µL已配制好的待测化合物及对照品溶液，并立即将微孔板放回检测仪中以尽快继续测量。

仪器将捕获添加化合物或对照物后荧光发生的任何变化。进行顶体反应分析时，在将获能的精子细胞与适当的荧光染料、化合物或对照物孵育后，用移液器吹打混匀各样本，然后将每个测试样本各50微升加入到100微升固定液中。再次混匀样本，并将每个样本约30微升加入A2载玻片的一个腔室中，每样本使用一张A2载玻片。

然后将加载好的第一张载玻片放入影像流式细胞仪的载物台中。选择FlexiCyte实验方案，点击运行。此处可观察到一个代表性实验结果，该实验采用中通量钙信号检测方法，测试了四种化合物的作用，并设置了黄体酮阳性对照和缓冲液阴性对照。

在此图中，显示了由系列稀释浓度的孕酮诱导的细胞内游离钙浓度峰值百分比变化所得到的孕酮剂量-反应曲线。这些数据说明了一种阴性对照或两种阳性对照之一在中等通量顶体反应检测中对诱导获能人精子细胞发生顶体反应的影响。为避免遗漏诱导信号的峰值，必须迅速将化学物质加入到重复孔中，并立即开始后续的检测。

通过更换不同类型的荧光染料和染色剂，我们的检测方法可轻松调整，以解答不同的科学问题。这些检测方法已在多项研究中被用于测试大量化合物对人类精子功能的影响。