Name: 中通量筛选法评估对精子中 ca2 +信号和反应的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学习中通量筛选法评估化合物对人类精子钙信号和顶体反应的影响。该方法利用荧光染色和图像细胞术实现快速高通量筛选，为生殖生物学研究提供可靠的精子功能评估平台。

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作者谨此感谢蒂莫·斯特伦克（Timo Strünker）实验室在其团队访问期间对AR和DLE的指导。此外，我们还要感谢哥本哈根大学医院国立医院生殖与发育科的同事们在建立这两种检测方法过程中提供的协助。本项目得到了丹麦环境保护局作为内分泌干扰物研究中心下设项目的支持，以及丹麦创新基金（资助编号：005-2010-3 和 14-2013-4）的资助。

本方案中人类精液样本的采集与分析遵循丹麦首都地区研究伦理委员会的指导原则。所有精液样本均在志愿者捐赠者知情同意后获取。样本送达后即进行完全匿名化处理。每位捐赠者因参与研究的不便，每份样本获得500丹麦克朗（约合75美元）的酬金。样本在送达当日进行分析，并在实验室实验结束后立即销毁。
注意：中通量 Ca2+-信号检测在步骤 4-5 中描述，中通量顶体反应检测在步骤 6-7 中描述。人输卵管液（HTF+）培养基的制备方案见步骤 1，用于检测的精子细胞纯化过程见步骤 2-3。
1. 人输卵管液（HTF+）培养基的制备
注意：使用适当规格的容量瓶、1 L 量筒、磁力搅拌器、表 1 和 表 2 中列出的盐类、纯化水、0.2 µm 孔径滤器以及 50 mL 塑料管。
<ol>
	<li>用纯化水配制盐类的储备溶液（表1）。
	<ol>
		<li>加入所列数量的盐 表1 将适量纯化水加入适当体积的容量瓶中，至略低于目标体积处，使用磁力搅拌器充分混匀。</li>
		<li>当盐完全溶解后，移除磁子，并加入纯化水至所需最终体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将储备液转移至瓶中，保存至使用。 
	注意： 储备液可长期保存并重复使用：葡萄糖和HEPES置于-20 °C保存，其余储备液于室温（RT）保存。</li>
	<li>配制1升HTF+ 来自储备液的培养基（表2）。
	<ol>
		<li>确保所有储备液在使用前完全溶解并充分混匀。</li>
		<li>加入所列的储备液和盐的量 表2 加入1升量筒中，并加纯水至900毫升。</li>
		<li>使用磁力搅拌器充分混匀，并用 NaOH 溶液调节 pH 至 7.35。</li>
		<li>移除磁铁，并加入纯化水至1,000 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无菌滤液 HTF+ 通过0.2 µm孔径滤器过滤培养基，分装HTF+ 将培养基转移至50 mL塑料管中，4 °C保存备用。</li>
	<li>实验开始前，向50 mL等分试样中加入165 µL的Na-丙酮酸盐，使Na-丙酮酸盐的终浓度为0.33 mM。 
	注意： 人类输卵管液培养基也可从多家商业供应商处获得。使用 4 mM HCO₃⁻ 时3- 培养基中，样品可在孵育箱中闭盖孵育，无需额外补充CO₂2 在空气中保持pH无显著漂移。若CO2 孵箱可用时，相应量的 CO2 可使用 Henderson-Hasselbalch 方程计算，并加以利用。若使用 25 mM HCO3- 培养基中，样品应在开放盖子的条件下于CO₂培养箱中孵育2 含相应浓度CO₂的培养箱2 （取决于大气压，通常为5-10%），以避免pH值漂移。CO₂的具体含量2 可以使用 Henderson-Hasselbalch 方程进行计算。</li>
</ol>
2. 通过上游法纯化活动精子细胞（图1）
注意：使用洁净的广口塑料容器收集精液样本，并准备一个培养箱、50 mL 塑料离心管、可将 50 mL 塑料离心管以 45° 角放置的管架、HTF+ 培养基（按步骤 1 配制或从商业供应商获取）、离心机以及人血清白蛋白（HSA）。
<ol>
	<li>获取通过手淫方式新鲜捐献的人类精液样本，并射入洁净的广口塑料容器中。仅使用符合世界卫生组织（WHO）人类精液检查与处理实验室手册所规定参数的精液样本。</li>
	<li>将样本在 37 °C 下孵育 15–30 分钟，使其充分液化。</li>
	<li>将 50 mL 含 4 mM HCO3- 的 HTF+ 培养基加热至 37 °C。</li>
	<li>将洁净的 50 mL 塑料离心管以 45° 角度置于试管架中（以增加液体间的表面积）。每毫升原始精液使用 1 支试管。</li>
	<li>向每支试管中加入 4 mL 预热的 HTF+ 培养基。</li>
	<li>小心地将 1 mL 液化后的精液样本用移液器加至含有 4 mL 预热 HTF+ 的每支试管底部。避免产生气泡。</li>
	<li>盖紧管盖，并在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>轻柔地吸取并尽可能多地将上层液体部分（含活动精子的 HTF+）转移至新的 15 mL 塑料离心管中，注意不要混入底层部分（含不动和死亡细胞的精液）。通常，安全转移 3.5 mL 上层液体而不扰动底层部分是可行的。为避免吸液时产生湍流，可将移液器吸头最末端以 45° 角剪去 1–2 mm，以获得更大的开口。</li>
	<li>用 HTF+ 补充 15 mL 塑料离心管至满，以洗涤细胞，并在室温下以 700 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>轻柔地吸除并弃去上清液，将精子细胞沉淀重悬于 2 mL HTF+ 中。</li>
	<li>取 20 µL 精子悬液转移至两个小型塑料管中，用于精子浓度测定（见步骤 3）。</li>
	<li>用 HTF+ 补充 15 mL 塑料离心管至满，以洗涤细胞，并在室温下以 700 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>轻柔地吸除并弃去上清液，将精子细胞沉淀重悬至 10 × 106 个细胞/mL（根据步骤 2.11 测定的细胞浓度进行调整）。
	<ol>
		<li>对于使用未获能精子细胞的实验（常规 Ca2+ 信号检测）
		<ol>
			<li>将细胞重悬于含 4 mM HCO3- 的 HTF+ 中。</li>
			<li>每毫升 HTF+ 中加入 30 µL 人血清白蛋白（HSA）（100 mg/mL），使终浓度为 3 mg/mL。</li>
			<li>盖紧管盖，并在 37 °C 下孵育 ≥1 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于使用获能精子细胞的实验（顶体反应检测）
		<ol>
			<li>将细胞重悬于含 25 mM HCO3- 的 HTF+ 中。</li>
			<li>每毫升 HTF+ 中加入 30 µL HSA（100 mg/mL），使终浓度为 3 mg/mL。</li>
			<li>松盖放置，并在 37 °C 下孵育 ≥3 小时，同时提供相应浓度的 CO2（见步骤 1，通常为 5–10% CO2）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 精子细胞计数
注意：精子细胞可采用手动计数50，或如本文所述使用影像细胞计数仪51进行计数。请使用影像细胞计数仪、涡旋振荡器、S100缓冲液、SP1样本盒以及经游上法纯化的精子细胞（按步骤2制备）。
<ol>
	<li>根据预期浓度（通过步骤 2.10 中对沉淀物的目测评估），在圆底 2 mL 管中用 S100 缓冲液将 20 µL 等分试样稀释 10、20、30、50 或 90 倍。选择最接近预期浓度的稀释倍数（例如，若预计上泳后精子浓度为每毫升 15 × 106 个精子细胞，则将 20 µL 精子样本与 380 µL S100 缓冲液混合，稀释倍数为 20）。</li>
	<li>使用涡旋振荡器在最大 700 rpm 条件下充分混匀 10 秒，将 SP1-检测盒浸入样本中，并完全按下白色推杆，将一定量样本吸入检测盒内。</li>
	<li>打开图像细胞仪，将检测盒放入托盘中，并根据所选稀释倍数（步骤 3.1 中确定）运行“PI 染色人精子细胞计数检测”Count of PI Stained Human Sperm Cells Assay。</li>
	<li>用另一份 20 µL 样本重复步骤 3.1–3.3，使用与第一次 20 µL 样本测得浓度最接近的稀释倍数。</li>
	<li>根据两次测量结果计算精子细胞浓度的平均值。</li>
	<li>将精子细胞浓度的平均值乘以原始体积，得到总精子细胞数（在步骤 2 中，该原始体积为 2 mL）。</li>
</ol>
4. 胞内游离Ca²⁺浓度变化的测定2+-浓度（[Ca2+]i使用 Ca2+-荧光测定法（图2）
注意：使用荧光酶标仪、384孔板、Fluo-4 AM、上游泳法纯化的精子细胞（步骤2中制备）、待测化合物以及阳性和阴性对照品、自动重复移液器和12通道移液器。
<ol>
	<li>将22.7 µL二甲基亚砜（DMSO）加入含50 µg Fluo-4 AM的试剂瓶中，配制成2 mM Fluo-4 AM储备液，并充分混匀。</li>
	<li>向新试管中加入700 µL上浮法回收的精子悬液（按步骤2所述为已获能或未获能状态）。700 µL精子样本量可用于分析384微孔板中24个孔组成的一行（用于检测3个对照和9种化合物，每种设两个复孔）。</li>
	<li>向700 µL精子悬液中加入3.5 µL Fluo-4 AM储备液，使Fluo-4 AM的终浓度为10 µM。</li>
	<li>37 °C 避光孵育 45 分钟。</li>
	<li>以 700 x g 离心样品 g 孵育10分钟，吸除上清液以去除过量的Fluo-4。</li>
	<li>在HTF中重悬染色后的沉淀+ 至 5 × 106 细胞/mL（即, 使用第4.2步中所取细胞悬液体积的2倍</li>
	<li>在步骤4.4和4.5的孵育和离心期间，分别配制化合物和对照品的稀释液。
	<ol>
		<li>在HTF中稀释化合物，同时设置阴性对照（含载剂的缓冲液）和阳性对照（孕酮）+将化合物和对照品稀释至所需终浓度的3倍，因为在步骤4.16中将其加入精子细胞时会进行1:3的稀释。</li>
		<li>将稀释液的试管放置于试管架上，试管之间的间距应与4.16步骤中使用的12通道移液器的移液头间距相对应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用自动重复移液器（24步，每步50 µL）。
	<ol>
		<li>用移液器将经Fluo-4染色的精子样品轻轻吹打混匀，上下吹打一次即可。</li>
		<li>向384孔微孔板的一行中的24个孔各加入50 µL等分试样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将微孔板放入30 °C的荧光酶标仪中，并关闭抽屉。</li>
	<li>选择适用于Fluo-4的实验方案。在480 nm处激发荧光，并在520 nm处记录发射光信号。使用该设置下尽可能快的循环时间。 
	注意： 每个孔和底部光学元件至少使用10次闪光，条件允许时。</li>
	<li>选择一行中的一个孔，并调节增益至目标值20%。</li>
	<li>开始测量。</li>
	<li>在前5个循环中控制基线。
	<ol>
		<li>如果荧光信号随时间逐渐增强或减弱，应立即停止实验，重新调整增益参数，然后重新开始实验。</li>
		<li>如果某一行中各个孔的基线差异较大，则可能是步骤 4.8 中移液操作不够准确，或样品在移液前未充分混匀。应弃用该次实验。</li>
		<li>如果该行各孔的荧光读数在前5个循环期间保持一致且稳定，则继续进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经过10个循环（用于基线）后，暂停实验。</li>
	<li>推出装有微孔板的抽屉。</li>
	<li>使用12通道移液器（分两步，每步25 µL），迅速将25 µL已配制的化合物和对照品溶液（来自步骤4.7）加入同一行的12个孔的双复孔（共24孔）中。由于各孔中已含有50 µL染色精子样本，溶液将被稀释至1:3。</li>
	<li>尽快继续测量（抽屉将自动关闭），以避免遗漏添加化合物和对照物后诱导的任何荧光信号。添加化合物和对照物后的荧光变化（ΔF）将被记录。</li>
	<li>运行实验，直至记录到阳性对照和目标化合物的荧光信号。</li>
	<li>停止实验，并将原始荧光数据导出，按步骤5进行分析。 
	注意： 通常使用 Fluo-4 AM 作为 Ca2+-敏感的荧光团在该检测中，但其他Ca2+-敏感的荧光染料也可使用，前提是其激发和发射光谱与荧光酶标仪的滤光片匹配。根据所选荧光染料的不同，需确保增益水平设置在一个“安全”范围内，使诱导产生的荧光信号峰值处于仪器的检测量程之内。可通过在特定增益设置下向一个孔中加入离子霉素来测试：若由此产生的荧光信号超过阈值，则应降低增益后重新尝试。部分研究者使用Pluronic F-127以促进Fluo-4的加载1,13，但研究发现这并非必要2同时测量的最大行数取决于两个因素。1）仪器的循环时间：如果循环时间过长，[Ca2+]i 可能会被遗漏。每次最多测量两行，以保持较短的循环时间；2）步骤4.16中的移液速度：使用12通道移液器，可快速将12种不同溶液加入1或2行的12个重复孔（共24孔）中（例如，一行预先用溶剂预孵育，另一行预先用抑制剂预孵育），而不会错过诱导的Ca2+ 峰。然而，不建议尝试将24种不同的溶液同时加入两行以进行并行测量，因为在连续的两次移液步骤之间必须更换移液吸头，这会引发Ca2+ 峰可能被遗漏。</li>
</ol>
5. 钙数据的分析2+-荧光光度法
<ol>
	<li>打开在步骤4中获得并导出的原始荧光数据。</li>
	<li>计算复孔的平均值。如果复孔之间存在较大差异，则舍弃该特定孔的数据。</li>
	<li>将前10个循环定义为基线。</li>
	<li>计算ΔF/F0 (%)，即在加入化合物和对照后，荧光随时间的变化量（ΔF）相对于前10个循环（基线）期间平均基础荧光（F0）的百分比变化。</li>
	<li>如果使用该数据生成剂量-反应曲线，需从其他孔的读数中减去阴性对照的读数，以消除加样误差。</li>
</ol>
6. 顶体反应的检测
注意：使用成像细胞仪、培养箱、荧光染料：碘化丙啶（PI）、FITC-PSA 和 Hoechst-33342，待测化合物以及阳性和阴性对照品，含有 0.6 M NaHCO3 和 0.37%（v/v）甲醛的蒸馏水固定液，A2 载玻片，以及经梯度上浮法纯化并完成获能处理的精子细胞（按步骤 2 制备）。
<ol>
	<li>在HTF+中配制含有PI（5 µg/mL）、FITC-PSA（50 µg/mL）和Hoechst-33342（100 µg/mL）的染色液，使用涡旋振荡器充分混匀，并避光保存至使用。</li>
	<li>将待测化合物及对照品配制成目标终浓度10倍的储备液，因为在步骤6.5中会进行1:10稀释。实验中必须包含一个阴性对照（溶剂对照），以及两个阳性对照：黄体酮（终浓度10 µM）和离子霉素（终浓度2 µM）。</li>
	<li>将240 µL已获能的精子细胞（按步骤2制备）分装至塑料离心管中。</li>
	<li>向每根试管中加入30 µL染色液。染料的终浓度为：PI 0.5 µg/mL，FITC-PSA 5 µg/mL，Hoechst-33342 10 µg/mL。</li>
	<li>向每根试管中加入30 µL含对照品或化合物的溶液（1:10稀释）。</li>
	<li>通过反复吹打或轻微涡旋轻柔混匀样品。由于机械应力可能影响结果，请避免过度混匀。</li>
	<li>在37 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>准备新的塑料离心管，每管加入100 µL固定液（含0.6 M NaHCO3和0.37%（v/v）甲醛的蒸馏水溶液），每支测试管对应一管。</li>
	<li>孵育结束后，通过吹打充分混匀样品，然后取50 µL测试样品加入含100 µL固定液的试管中。</li>
	<li>在加载A2载玻片的样品室前，先通过吹打充分混匀样品。小心加入约30 µL样品，避免产生气泡。 
	注意： 孵育过程中，活动精子容易发生聚集。细胞团块可能干扰检测结果（即使被排除分析）。因此，孵育后充分吹打混匀至关重要。同样，样品室中的气泡也会影响检测结果。因此，加样时应缓慢操作，当液体边缘即将交汇形成气泡时，应调整移液器角度以避免气泡产生。</li>
	<li>将加样完成的载玻片放入图像细胞仪的载物盘中，并关闭载物盘。</li>
	<li>选择FlexiCyte程序并点击运行。
	<ol>
		<li>设置FlexiCyte程序参数如下：分析通道数：2；分割图像所用通道：UV（LED365）；通道1：蓝色（LED475），曝光时间3,000 ms，发射滤光片560/35；通道2：绿色（LED530），曝光时间500 ms，发射滤光片675/75；最低分析细胞数：5000；排除聚集细胞：是。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤6.9–6.12，直至所有样品检测完毕。</li>
</ol>
7. 图像流式细胞术数据分析
<ol>
	<li>打开步骤6中获得的数据。</li>
	<li>创建以下两个图以评估测量结果。
	<ol>
		<li>在双指数尺度上创建Hoechst-33342强度与Hoechst-33342面积的散点图。该图可用于排除那些过小或过大、不符合人类精子细胞特征的Hoechst-33342阳性物体。</li>
		<li>在双指数尺度上创建FITC-PSA强度与PI强度的散点图。该图可通过四象限门控法评估发生顶体反应的精子细胞比例，从而将图中的细胞分为四组（图3）：1）PI阳性且FITC-PSA阳性组：顶体反应且非活精子细胞；2）PI阴性且FITC-PSA阳性组：顶体反应且活精子细胞；3）PI阳性且FITC-PSA阴性组：顶体完整且非活精子细胞；4）PI阴性且FITC-PSA阴性组：顶体完整且活精子细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

中通量 Ca2+ 信号检测基于对单个微孔的荧光测量，每个微孔含有约 250,000 个精子细胞。所捕获的信号来自孔内所有单个精子细胞的平均值。因此，该检测无法提供关于精子细胞内 [Ca2+]i 变化具体发生位置、发生 [Ca2+]i 变化的精子细胞比例，以及单个细胞间反应异质性的空间信息。要获得此类信息，必须采用单细胞分辨率的实验方法（例如，如文献50,52所述）。该技术的另一局限性在于时间分辨率，其量级为秒级。尽管在加入 25 µL 溶液时 50 µL 的精子样品已充分混匀，但测量只能在微孔板所在的抽屉重新放回荧光酶标仪后才可开始。若需更高的时间分辨率，则必须采用其他技术（例如停流式荧光测定法13,50）。与单细胞或单孔方法相比，中通量 Ca2+ 信号检测的优势在于，利用微...

本文所述的两种检测方法旨在研究多种化合物对人类精子中Ca2+信号传导和顶体反应的影响，已有若干文献在使用这些检测方法时报道过此类研究结果1,2,3,4,5,6,7。Ca2+信号传导和顶体反应均对正常人类精子细胞功能及男性生育力至关重要。
人类精子细胞的总体目标是使卵子受精。为了能够成功且自然地完成卵子受精，精子细胞在通过女性生殖道的过程中，其各项功能必须受到严密调控8,9。许多精子细胞功能通过细胞内 Ca2+ 浓度 [Ca2+]i 进行调控（例如精子运动能力、趋化性以及顶体反应）10。此外，一种称为获能的成熟过程（使精子获得受精能力）也部分受 [Ca2+]i 调控10。Ca2+ 外排型 Ca2+-ATP 酶泵11 在人类精子细胞膜上维持约 20,000 倍的 Ca2+ 浓度梯度，静息状态下的 [Ca2+]i 为 50–100 nM。当 Ca2+ 被允许跨膜进入细胞时（例如通过 Ca2+ 通道的开放），将发生显著的 Ca2+ 内流，导致 [Ca2+]i 升高。然而，精子细胞还含有细胞内 Ca2+ 储存库，这些储存库可释放 Ca2+，从而同样引起 [Ca2+]i 的升高12。有趣的是，迄今为止在人类精子细胞中发现的所有通道介导的 Ca2+ 内流均通过 CatSper（精子阳离子通道）实现，该通道仅在精子细胞中表达11。在人类精子细胞中，CatSper 可被内源性配体孕酮和前列腺素通过不同的配体结合位点激活13,14,15，从而引发 Ca2+ 快速内流进入精子细胞。卵子附近的两个主要来源可提供高水平的这些内源性配体：其一是卵泡液，其中含有高浓度的孕酮16。排卵时，卵泡液随成熟卵泡与卵子一同释放，并与输卵管内的液体混合17；另一个主要来源是包围卵子的卵丘细胞，它们释放高水平的孕酮和前列腺素。研究表明，精子细胞中由孕酮诱导的 Ca2+ 内流可介导精子向卵子的趋化性9,18，调控精子运动能力19,20，以及促进顶体反应21。这些由 [Ca2+]i 调控的精子功能必须在正确的时间以正确的顺序依次被激活，这对成功实现卵子受精至关重要8。与此一致的是，研究发现孕酮诱导的 Ca2+ 内流若处于次优水平，将与男性生育力下降相关22,23,24,25,26,27,28,29，而功能正常的 CatSper 对男性生育力至关重要26,30,31,32,33,34,35,36。
当精子细胞到达卵子时，受精过程需要依次发生一系列事件：1）精子细胞必须穿透周围的卵丘细胞层，2）与透明带结合，3）胞吐顶体内容物，即所谓的顶体反应。37，4）穿透透明带，以及 5）与卵细胞膜融合以完成受精38要完成这些步骤并使卵子受精，精子必须首先经历获能过程。11，当精子细胞离开含有精液的液体环境时开始 &#34;去获能&#34; 因素39 并游入含有高浓度碳酸氢盐和白蛋白的雌性生殖道液体中37获能使精子细胞能够发生超激活，即一种鞭毛剧烈摆动的运动形式，以及顶体反应。37超激活运动是穿透透明带所必需的40，顶体含有多种水解酶，有助于精子穿透过程41此外，顶体反应通过暴露精子表面某些特定的膜蛋白，使精子具备与卵子融合的能力，而这些膜蛋白是精卵融合所必需的。42因此，精子必须具备超激活能力和顶体反应能力，才能成功使卵子受精。40,42与小鼠精子细胞中观察到的情况相反43,44,45只有顶体完整的精子细胞才能与透明带结合46当人类精子细胞与透明带结合后，必须发生顶体反应才能穿透透明带41 并暴露与卵细胞融合所必需的特定膜蛋白38因此，人类精子顶体反应的发生时机对于受精能否成功至关重要。
如上所述，Ca2+信号转导对精子细胞的正常功能至关重要8，因此，能够大规模筛选化合物对人精子细胞中Ca2+信号转导的影响具有重要意义。同样，只有在正确的时间和位置发生顶体反应的人精子细胞才能穿透透明带并使卵子受精46,47，因此，能够检测化合物对人精子细胞顶体反应影响的能力也具有重要意义。为此，本文描述了两种中通量筛选方法：1）用于检测化合物对人精子细胞Ca2+信号转导影响的实验；2）用于检测化合物诱导人精子细胞发生顶体反应能力的实验。
Assay 1 是一种中通量 Ca2+-信号检测实验。该技术基于荧光酶标仪，可同时在多个孔中监测荧光随时间的变化。Ca2+-敏感的荧光染料，Fluo-4 的 Kd 用于 Ca2+≈ 335 nM，且以AM（乙酰氧基甲酯）形式存在时具有细胞膜通透性。使用Fluo-4可检测[Ca2+]i 随着时间推移以及向精子细胞中添加感兴趣化合物后进行检测。该检测方法由 Timo Strünker 实验室于 2011 年开发13 并已在此后多项研究中用于筛选对Ca有影响的化合物2+人类精子中的信号传导1,2,3,4,5此外，类似的方法已被用于筛选多种候选药物48此外，该检测方法还可用于评估药物的作用机制1,2,3,4,5，剂量-反应曲线1,2,3,4,5，竞争性抑制1,2，加性1,2，以及协同作用3 目标化合物
实验2是一种中通量的顶体反应检测方法。该基于图像细胞仪的技术使用三种荧光染料——碘化丙啶（PI）、异硫氰酸荧光素偶联的豌豆凝集素（FITC-PSA）和Hoechst-33342，用于测定样品中发生顶体反应的活精子细胞数量。该方法由Zoppino等人49报道的类似流式细胞术方法改进而来，并已在多项研究中应用6,7。与钙离子（Ca2+）信号检测类似，该顶体反应检测也可用于评估目标化合物的剂量-反应曲线、抑制作用、加和效应以及协同效应。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 孔径滤膜</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>296-4545</td><td></td></tr><tr><td>1 L 量筒</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>3662-1000</td><td></td></tr><tr><td>1、4 和 2 mL 塑料管</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30120086 和 0030120094</td><td></td></tr><tr><td>12 道移液器</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>4861000813</td><td></td></tr><tr><td>384 孔多孔板</td><td>Greiner Bio-One, Germany</td><td>781096</td><td></td></tr><tr><td>15 和 50 mL 塑料管</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>0030122151 和 30122178</td><td></td></tr><tr><td>A2 载玻片</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>942-0001</td><td></td></tr><tr><td>自动重复移液器</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>4987000010</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于精液样本的洁净广口塑料容器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素（FITC-PSA）</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>L0770</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar OMEGA 荧光酶标仪</td><td>BMG Labtech, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无水葡萄糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>910-3015</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白（HSA）</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td>用于添加至 HTF+ 中</td></tr><tr><td>固定液，含 0.6 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 和 0.37%（v/v）甲醛的蒸馏水溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乳酸钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NC-3000 图像细胞仪</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>970-3003</td><td></td></tr><tr><td>移液器及吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>910-3002</td><td></td></tr><tr><td>纯化水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于放置 50 mL 塑料管并呈 45&amp;deg; 角的支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S100 缓冲液</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>910-0101</td><td></td></tr><tr><td>SP1-卡盒</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>941-0006</td><td></td></tr><tr><td>适当规格的容量瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

中等通量筛选实验用于评估对人精子ca2+信号传导和顶体反应的影响

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+信号传导对精子细胞的正常功能和男性生育力至关重要。同样，顶体反应对于人类精子穿透透明带并使卵子受精的能力也极为关键。因此，研究化合物（如环境化学物质或候选药物）对人类精子中Ca2+信号传导和顶体反应的影响具有重要意义，既可以评估其对精子功能可能产生的不利影响，也可探索其作为避孕剂的潜在用途。本文介绍了两种中等通量检测方法：1）基于荧光的检测法，用于评估化合物对人类精子Ca2+信号传导的影响；2）图像细胞计量学检测法，用于评估人类精子的顶体反应。这些检测方法可用于大规模筛选化合物对人类精子Ca2+信号传导和顶体反应的影响。此外，还可利用这些方法为单个化合物生成高度特异性的剂量-反应曲线，确定两种或多种化合物之间可能存在的相加或协同效应，并通过使用CatSper抑制剂进行竞争性抑制实验来研究其药理作用机制。

代表性实验结果展示了4种化合物（A、B、C和D）与阳性对照（progesterone）及阴性对照（buffer）对[Ca2+]i 使用中等通量 Ca 检测法检测人精子中的钙离子2+信号转导实验可参见 图4a. 在 图4b，显示了由峰值 ΔF/F 得出的黄体酮剂量反应曲线0 (%) 数据由黄体酮系列稀释浓度在另一项中通量钙检测实验中测得2+-信号检测实验。对Ca2+-信号检测实验的说明见步骤5。在中等通量顶体反应检测实验中，使用阴性对照（DMSO）或两种阳性对照（孕酮和离子霉素）处理已获能的人类精子细胞以诱导顶体反应，其代表性实验结果如上图所示 图3. 从3种测试条件下获得的象限门控散点图如图所示。顶体反应数据的分析方法在第7步中说明。
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本文描述了两种用于评估化合物对人精子Ca2+信号传导和顶体反应影响的中通量检测方法。这些方法可用于快速、简便地筛选大量化合物对人精子Ca2+信号传导和顶体反应的影响。

中等通量筛选实验用于评估对人精子Ca2+信号传导和顶体反应的影响

Ca2+信号对精子细胞的正常功能和男性生育力至关重要。同样，顶体反应对于人类精子的受精能力也极为关键。

我们的检测方法可用于测试化合物对人类精子细胞功能的影响。具体而言，这些方法可用于快速、简便地筛选大量化合物对人类精子细胞内钙信号传导和顶体反应的影响。对该方法的可视化演示将有助于其他研究人员在各自实验室中建立类似的实验。首先，将每个1毫升的原始精液样本分别加入一个50毫升离心管中，每管对应一份样本，将离心管以45度角放置于试管架上，并向每管中加入4毫升37摄氏度的人输卵管液（Human Tubal Fluid，HTF）培养基。接着，小心地用移液器将1毫升液化后的精液样本缓慢加入每根离心管底部，随后将离心管置于37摄氏度环境中孵育1小时。孵育结束后，使用经改造的移液器吸头，以45度角持握，轻柔地将含有活动精子的HTF培养基上清液尽可能多地转移至新的15毫升塑料离心管中。为计数收集的精子细胞，根据预期浓度，将20微升等分试样用S100缓冲液在2毫升圆底试管中稀释10、20、30、50或90倍。将稀释后的精子细胞在700转/分钟条件下涡旋振荡10秒。接着，将SP1检测盒浸入样品中，并完全下压白色推杆，使样品的等分部分被吸入检测盒内。然后将样本盒放入成像细胞计数仪的托盘中，并根据所应用的稀释因子运行碘化丙啶（PI）染色的人类精子细胞检测。为检测游离细胞内钙离子浓度的变化，轻柔地吹打精子样本上下一次，使用自动重复移液器将50 µL荧光染料标记的精子细胞分装至384孔微孔板中一整行的24个孔内。将微孔板置于30 °C的荧光酶标仪中，并选择适用于该荧光染料的检测程序。选择精子细胞行中的一个孔，并将增益调节至目标值20%。然后开始测量。完成10个基线循环后，暂停实验，并抽出装有微孔板的抽屉。使用12通道移液器，迅速向该行的12个重复孔中每孔加入25 µL已配制好的待测化合物及对照品溶液，并立即将微孔板放回检测仪中以尽快继续测量。仪器将捕获添加化合物或对照物后荧光发生的任何变化。进行顶体反应分析时，在将获能的精子细胞与适当的荧光染料、化合物或对照物孵育后，用移液器吹打混匀各样本，然后将每个测试样本各50微升加入到100微升固定液中。再次混匀样本，并将每个样本约30微升加入A2载玻片的一个腔室中，每样本使用一张A2载玻片。然后将加载好的第一张载玻片放入影像流式细胞仪的载物台中。选择FlexiCyte实验方案，点击运行。此处可观察到一个代表性实验结果，该实验采用中通量钙信号检测方法，测试了四种化合物的作用，并设置了黄体酮阳性对照和缓冲液阴性对照。在此图中，显示了由系列稀释浓度的孕酮诱导的细胞内游离钙浓度峰值百分比变化所得到的孕酮剂量-反应曲线。这些数据说明了一种阴性对照或两种阳性对照之一在中等通量顶体反应检测中对诱导获能人精子细胞发生顶体反应的影响。为避免遗漏诱导信号的峰值，必须迅速将化学物质加入到重复孔中，并立即开始后续的检测。通过更换不同类型的荧光染料和染色剂，我们的检测方法可轻松调整，以解答不同的科学问题。这些检测方法已在多项研究中被用于测试大量化合物对人类精子功能的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

中通量筛选法评估对精子中 ca2 +信号和反应的影响

通过刺激诱发单个精子的[Ca2+]i信号变化进行评估。将具有运动能力的精子细胞用Ca2+敏感型荧光染料（AM酯法）负载后，固定于可灌流的腔室中。利用时间推移荧光显微镜对细胞成像，并通过灌流介质施加刺激。单个细胞（或特定区域）的反应通过Excel软件进行离线分析。...

人类精子中Ca2+信号成像技术

细胞内 Ca2+ 动态变化在精子生理学中具有重要意义，而 Ca2+ 敏感染料则为研究这些变化提供了多功能工具。通过群体实验（荧光测定法和停流荧光测定法）和单细胞实验（流式细胞术和单细胞成像），可用于追踪人精子细胞中时空性的 [Ca2+]...

使用四种技术测量人类精子细胞内 Ca2+ 的变化：常规荧光测定法、停流荧光测定法、流式细胞术和单细胞成像

本文介绍了评估精子细胞膜完整性的方法，该细胞特征与精子的受精能力密切相关。我们描述了三种用于荧光检测精子膜的技术：特异性荧光探针的同步染色、荧光显微镜检查，以及专用于精子的流式细胞术。此外，还展示了这些方法联合应用的实例。...

用于评估精子膜的荧光测定技术

我们描述了如何应用细胞外通量分析仪来实时监测小鼠精子获能过程中糖酵解和氧化磷酸化的变化。...

使用细胞外通量分析仪测量小鼠精子获能过程中糖酵解和氧化磷酸化的变化

本方案描述了如何在全细胞构型下对哺乳动物精子细胞进行电生理记录，旨在直接记录离子通道的活性。该方法在描述多种精子离子通道的电生理特性方面发挥了重要作用，并有助于揭示其分子身份及调控机制。...

记录哺乳动物精子细胞质膜上的电流传导

本实验方案提供了一种实用方法，可利用单台流式细胞仪对人类精子的细胞凋亡、线粒体膜电位及DNA损伤进行检测。...

流式细胞术分析用于检测人类精子功能缺陷的生物标志物

活体小鼠精子顶体钙动力学与胞吐作用的实时成像

采用功能性磁共振成像（fMRI）和生理监测来研究针灸对中枢神经系统和周围神经系统的影响。针灸激活了边缘-旁边缘-新皮层网络，该网络与默认模式网络高度重叠，从而调节神经活动，这种作用可能与其在周围神经系统中的自主神经效应相关。...

利用fMRI监测针灸对人脑的影响

卵子及其周围的胞外包被常会释放多肽、蛋白质和小分子，这些物质可与精子进行通讯，引导精子趋向卵子，从而促进受精。本文利用蛙类精子，描述并比较了两类用于检测精子趋化性吸引的实验方法——精子聚集实验和精子追踪实验。...

检测蛙类精子趋化性的两种测定方法

本文介绍了一种高效的方法，用于深入研究旁分泌来源的活性氧（ROS）诱导内皮细胞Ca2+信号的可视化。该方法利用共培养模型，检测旁分泌来源的ROS所触发的血管内皮细胞内Ca2+动员。...

由旁分泌来源的活性氧触发的血管钙2+信号转导的可视化

学习中通量筛选法评估化合物对人类精子钙信号和顶体反应的影响。该方法利用荧光染色和图像细胞术实现快速高通量筛选，为生殖生物学研究提供可靠的精子功能评估平台。

中等通量筛选实验用于评估对人精子Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响

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