Name: 用细胞遗传学技术测定芽孢杆菌的受精率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 学习使用DAPI细胞遗传学技术测定烟粉虱的受精率与初级性比。该方法可在三小时内完成，为研究半翅目害虫的行为生态学及制定防治策略提供可靠工具。

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本研究由美国国家科学基金会（NSF）资助（项目编号：DEB-1020460）以及美国农业部农业与食品研究计划（USDA AFRI）资助（项目编号：2010-03752），资助对象均为 M.S.H.。作者感谢 Brennan Zehr 以精湛的技术和沉稳的心态对烟粉虱卵进行染色。作者感谢 Mike Riehle 允许使用其荧光显微镜进行成像。作者感谢 Suzanne Kelly 和 Marco Gebiola 提供卵的图像。作者感谢 Suzanne Kelly 和 Jimmy Conway 在实验关键阶段提供的帮助。

注意：确保所有操作均在通风良好的环境或通风橱中于室温下进行。本方案中所有“滴”均定义为5–20 µL，具体体积取决于操作者的偏好。
1. 初始设置
<ol>
	<li>让雌性粉虱在干净的叶片上产卵。可用于产卵的装置示例包括夹式笼或裁剪后置于培养皿中琼脂上的叶片。在夹式笼或培养皿盖上制作一个可封闭的小孔，以便插入和移除成虫。&#160;或者，将收集到的成虫容器迅速置于冰上，随后将其放置于叶片上。为确保能够观察到精子在卵中转变为雄性原核的过程，产卵与固定卵之间的时间应控制在60分钟以内。 
	注意：未从叶片上移除的卵可继续培养至成虫，用于记录成虫的性别比例。</li>
	<li>在粉虱产卵前或产卵期间，先用肥皂和水清洗显微镜载玻片，充分干燥后，在一端拉伸覆盖一层石蜡膜，确保石蜡膜表面无破损（图1）。 
	注意：石蜡膜具有疏水性和半不透明性，有助于液体形成液滴，并使卵更易于观察。</li>
</ol>
2. 脱膜处理
<ol>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管，向石蜡膜上滴加次氯酸钠溶液（0.83% 次氯酸钠）。 
	注意： 每滴中仅保留 2–3 个卵，有助于更清晰地追踪卵的状况。若需处理大量卵，可将卵收集于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的液滴中。 
	警告： 次氯酸钠具有腐蚀性，操作时应佩戴手套，避免吸入。</li>
	<li>从叶片上移除成虫粉虱。</li>
	<li>将叶片置于显微镜下，以便清晰观察卵，并使用细探针小心地逐个收集卵。制作探针时，将微细针（minuten nadel&#160;）以 45° 或便于操作的角度插入熔化的吸头中（图 2）。</li>
	<li>将卵转移至次氯酸钠溶液或 1× PBS 中。若使用 1× PBS，在所有卵收集完毕后，先用玻璃巴斯德吸管吸除 PBS，再向卵中加入次氯酸钠溶液。 
	注意： 收集卵时，应缓慢从基部提起卵，直至卵柄从叶片脱离。卵柄具有黏性，卵通常会黏附在探针尖端，直至将其浸入次氯酸钠溶液中才会脱落。 
	注意：&#160;建议为每种试剂使用单独的玻璃巴斯德吸管，可通过加热改造吸管使尖端更细，以降低意外吸入粉虱卵的风险。为防止残留和污染，每次使用后需用去离子水清洗吸管。</li>
	<li>静置 10 分钟。若需研究超过 1 小时的卵的胚胎发育过程，可将卵在次氯酸钠溶液中保留长达 15 分钟。 
	注意： 对于不超过 1 小时的卵，10 分钟处理已足够。</li>
</ol>
3. 固定
注意：这些步骤源自一种膜翅目昆虫的实验方案17。
<ol>
	<li>用玻璃巴斯德吸管移除含有卵壳碎片的漂白液，并弃去。用玻璃巴斯德吸管加入数滴冰醋酸，静置 3 分钟。 
	注意：此步骤应在通风橱中进行。冰醋酸具有腐蚀性，操作时应佩戴手套，避免吸入，尤其需避免与残留的漂白液共同挥发产生的气体接触。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管移除冰醋酸，再用玻璃巴斯德吸管加入数滴克拉克溶液（无水乙醇:冰醋酸 = 3:1）。静置直至大部分溶液挥发（或最长 10 分钟）。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管向卵中加入数滴 70% 乙醇，静置直至大部分乙醇挥发（或最长 10 分钟）。</li>
</ol>
4. 染色
<ol>
	<li>用玻璃巴斯德移液管吸除残留的乙醇，并用玻璃巴斯德移液管向卵中滴加数滴 1× PBS，使 pH 接近 7.0。将显微镜载玻片置于湿度培养盒中以防止干燥，例如放入内有湿润纸巾的空移液器吸头盒中（图3）。静置至少30分钟。 
	注意：若需暂停操作，此时为最佳节点，前提是湿度培养盒能有效防止样品干燥。</li>
	<li>用玻璃巴斯德移液管吸除 1× PBS，并用玻璃巴斯德移液管滴加 0.1 μg/mL DAPI（一种DNA荧光染料）。将载玻片置于避光的湿度培养盒中，静置至少15分钟。 
	注意：DAPI 具有刺激性，操作时需佩戴手套。</li>
</ol>
5. 清洗
<ol>
	<li>用玻璃巴斯德吸管移除DAPI。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管向卵中加入数滴1× TBST（由30 g Tris、43.8 g NaCl、5 mL 吐温-20、1.0 g NaN3 [pH 7.5] 配制成5×溶液，再用PCR级水稀释至1 L）孵育。孵育5分钟后，用玻璃巴斯德吸管吸出1× TBST。重复此步骤2次。</li>
</ol>
6. 封片
<ol>
	<li>最后一次洗涤后，小心地将石蜡膜上的所有卵用移液器转移至显微镜载玻片的洁净区域。去除多余的1×TBST，然后加入20 µL封片剂（80%甘油、20% 1×TBST，含2%正丙基-没食子酸），并在卵上轻轻加盖一片洁净的盖玻片。</li>
	<li>如需长期保存，用透明指甲油密封盖玻片，随后将载玻片置于2 °C避光保存，或立即在荧光显微镜下观察。</li>
</ol>

<ol><li>Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnov%2C+EL+%22The+Theory+of+Sex+Allocation%22">The Theory of Sex Allocation</a>. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).</li>
<li>Godfray, H. C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGodfray%2C+HCJ+%22Parasitoids%3A+behavioral+and+evolutionary+ecology%22">Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Bourke, A. F. G., Franks, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBourke%2C+AFG+%22Social+Evolution+in+Ants%22">Social Evolution in Ants</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).</li>
<li>Pascal, S., Callejas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecific+competition+between+biotypes+B+and+Q+of+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+from+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain.</a> Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).</li>
<li>Liu, S. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+mating+interactions+drive+widespread+invasion+and+displacement+in+a+whitefly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly.</a> Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).</li>
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<li>Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mating+behavioural+interactions+and+life+history+traits+in+the+competition+between+alien+and+indigenous+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Entomological+Research%22%5BJournal%5D)">Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies.</a> Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).</li>
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<li>Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heat+shock+on+survival+and+reproduction+of+two+whitefly+species%2C+Trialeurodes+vaporariorum+and+Bemisia+tabaci+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B.</a> Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).</li>
<li>Boykin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci+nomenclature%3A+Lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned.</a> Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).</li>
<li>Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+insight+into+reproductive+incompatibility+between+putative+cryptic+species+of+the+Bemisia+tabaci+whitefly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex.</a> Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案首次实现了对烟粉虱（B. tabaci）受精率或初级性别比例的检测。该方案的难点在于要求研究人员掌握快速处理粉虱卵的技术，确保从产卵到固定的时间不超过1小时。在预实验中发现，产卵后3小时或更久才固定的卵已过于成熟，无法观察受精情况，因为此时合子融合已完成，有丝分裂已经开始。在产卵后1至3小时之间，原核逐渐呈现更圆的形态。虽然早期出现两个核提示卵子已受精，但稍后两个原核在准备融合时可能紧贴在一起而看似单个核；更晚些时候，第一次有丝分裂的两个子核则在雄性和雌性卵中均可见到。因此，在这些较晚的时间点上，两性之间的区别不再明确，我们建议将产卵至固定的间隔严格控制在1小时内，以作为保守措施。此外，在每次液体转移过程中需学会轻柔操作卵，避免卵被意外吸入移液器中。在荧光显微镜下观察时，部分卵可能在操作过程中破裂，导致原核和卵黄外泄，此类卵无法进行性别鉴定和计数。然而，一旦操作者熟练掌握上述步骤，整个方案可在3小时内便捷完成，且无需过夜固定步骤。本方案还具有灵活性，可根据需要进行调整，用于染色较老的卵，适用于希望观察发育过程的研究人员。
该实验方案的一个应用是性别分配研究。...

性别分配研究，即对雄性和雌性后代相对投资的研究，是行为生态学的基石1,2,3除了在检验行为适应性模型方面具有重要意义外，了解生物体的性别分配策略还可能改进其种群动态模型。在许多物种中，性别分配由母体控制。要确定性别分配，关键在于明确初级性比，即卵产出时雌性个体所占的比例。尽管成虫羽化时的性比可为性别分配提供线索，但幼体阶段雌雄个体间不同的发育死亡率通常会显著扭曲成虫性比。在膜翅目（Hymenoptera）昆虫（包括蚂蚁、蜜蜂和黄蜂）的一些物种中，研究人员已通过细胞遗传学检测方法确定了初级性比，即对胚胎进行染色以观察其遗传DNA。由于膜翅目昆虫为单双倍体系统，即将发育为雄性的卵为单倍体（n），仅包含雌性原核；而将发育为雌性的卵为双倍体（2n），同时包含雄性和雌性原核。尽管粉虱科（Aleyrodidae）——一类以植物汁液为食的半翅目（Hemiptera）昆虫，通称粉虱——也具有单双倍体系统，但目前尚未建立可用于测定这类昆虫初级性比的可靠检测方法。考虑到该科中少数全球性重要害虫受到的广泛关注，以及性比在粉虱种间竞争相互作用中的重要性，这一现状或许令人意外。4,5,6,7,8,9,10 以及在种群动态研究中普遍存在。在单双倍体昆虫中，性比不受性别决定系统的限制，因此可能存在选择性受精以及随环境变化的可变性比。2. 本文介绍一种用于确定统称为烟粉虱的粉虱复合种初级性比的技术， B. tabaci 这一物种名称涵盖了全球超过28个物种11并包含一些对全球危害最严重的入侵性害虫12,13该技术在确定性别分配模式中的应用 B. tabaci 以及其他粉虱科昆虫将有助于更严格地研究各种可能影响粉虱初级性比和种群动态的变量，包括温度、寄主植物、内共生细菌或植物/粉虱病原体。
我们不了解有任何可与之相比的卵染色技术 B. tabaci与用于其他昆虫卵的染色方法相比，该方案更为便捷14 因为它省略了过夜固定步骤，因此可在3小时内完成。作为一个应用示例，一种内共生细菌， 立克次体 近似种 贝利埃利希体， 与我们实验室品系中的雌性偏向相关 B. tabaci 中东-小亚细亚1型（MEAM1）15,16。在一个 B. tabaci MEAM1 实验室品系（&#34;MAC1,&#34; 来自马里科帕农业中心），我们测试了是否 立克次体-感染的（R+) 雌性受精的卵子数量多于未感染的（R-雌性。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBST</td><td>任意</td><td></td><td>5x 溶液由 30 g Tris、43.8 g NaCl、5 mL Tween-20 和 1.0 g NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 溶于 PCR 级水定容至 1 L，pH 7.5</td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Clorox</td><td></td><td>任何家用漂白剂均可使用，只要可稀释至含 0.83% 次氯酸钠</td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI 二乳酸盐</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc300415</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>任意</td><td></td><td>稀释至 70% EtOH</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>本实验使用 Nikon Eclipse 50i，但任何配备 340/380 nm 激发滤光片且放大倍数至少为 4–10 倍的荧光显微镜均可使用</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Mallinckrodt</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Wild</td><td></td><td>本实验使用 Wild M5A 显微镜，但任何能使操作者清晰观察到粉虱卵的显微镜均可使用</td></tr><tr><td>显微镜载玻片盖片</td><td>任意</td><td></td><td>本方法适用于 18 mm × 18 mm 的盖片。若使用更大的盖片，则需增加封片介质用量。</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型针（Minuten nadel pins）</td><td>BioQuip</td><td>1208SA</td><td>微型针可选，可用于与移液器吸头配合制成探针</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正丙基没食子酸酯（n-propyl-gallate）</td><td>Sigma/Santa Cruz Biotechnology</td><td>P3130/sc-250794</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管，长 5.75 英寸。若操作者需延长并缩小吸管口径，可能还需使用本生灯</td></tr><tr><td>PCR 级水</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>任意</td><td></td><td>移液器吸头可选，可用于与微型针配合制成探针</td></tr><tr><td>小型滴管胶头</td><td>任意</td><td></td><td>必须能与巴斯德吸管匹配</td></tr><tr><td>Tris</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用细胞遗传学技术测定烟粉虱 bemisia tabaci 的卵受精率

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

少数几种吸食植物汁液的粉虱是全球最具破坏性的陆生害虫之一，因其对农作物造成严重损害并传播植物病毒。尽管已有大量研究探讨了这些粉虱在不同环境中的生物学特性，但一个关键的生活史参数——子代性别比例——却鲜有关注，而该参数对于预测种群动态具有重要意义。Bemisia tabaci 的初级性别比例（产卵时的性别比例）迄今尚未见报道，但可通过测定这种单倍二倍体昆虫的卵受精率来确定。该技术包括使用次氯酸钠溶液去除卵的 chorion（去壳），一系列固定步骤，以及应用通用DNA荧光染料 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，一种DNA结合型荧光染料）对雌性和雄性原核进行染色。本文介绍了该技术及其应用实例，用于检验一种胞内共生细菌Rickettsia sp. nr.bellii是否影响了B. tabaci的初级性别比例。该方法可有助于粉虱种群研究，或用于判断特定环境刺激下是否存在性别分配现象。

为了检验是否 立克次体 影响受精率 B. tabaci MEAM1 雌虫，我们进行了饲养 立克次体-感染的（R+）或未感染（R-) B. tabaci 在豇豆植株上（Vigna unguiculata分别饲养于不同的笼具中 27 °C，70% 相对湿度，以及 16 小时光照/8 小时黑暗的光周期。R+ 和 R- 四龄若虫粉虱被小心地从叶片上移除并进行分离 200 µL 剥离试管。成虫羽化后，按雌性个体占比50%分组收集，并转移至培养皿中的洁净叶片上n = 每片叶子约50–100只）进行4天交配。随后将约20只雌虫和若干雄虫转移至一片干净的叶盘（一片用于R- 成虫，用于R的一份+ 成虫置于盛有1%琼脂的35 mm培养皿中。培养皿盖经裁剪后使用细织物网筛封闭，既可防止成虫逃逸，又能减少冷凝水积聚。约45分钟后移除所有成虫，部分卵用于测定受精...

我们介绍一种使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的简单细胞遗传学技术，用于测定单双倍体入侵性害虫Bemisia tabaci的受精率和初级性比。

利用细胞遗传学技术测定烟粉虱 Bemisia tabaci 的卵受精率

少数几种吸食植物汁液的粉虱是全球最具破坏性的陆地害虫之一，因其对农作物造成的损害以及传播植物病毒而闻名。

Liz 开发的方案使我们能够确定粉虱的受精率。应用这一技术将加深我们对粉虱行为与生态学的理解。粉虱为单双倍体，因此受精率等于产卵时的性别比例。据我们所知，本实验方案是首次针对粉虱描述的方法，可在三小时内完成。首先，在培养皿盖上制作一个可覆盖的孔洞，用于插入和取出成虫粉虱。设置一个湿度培养箱，并通过将一根细针以适宜操作的角度插入熔化的移液器吸头中，制备一根细探针。可选步骤：用加热法延长玻璃移液管尖端，以便更方便地操作粉虱卵。然后，让雌性粉虱在一片洁净的叶片上产卵，将叶片剪裁至合适大小后置于培养皿中的琼脂上。在粉虱产卵期间，用肥皂和水清洗显微镜载玻片。将其充分干燥，并在一端覆盖一层石蜡膜，以便液体形成液滴，更易于观察卵。去卵壳时，在移除成虫并收集卵之前，使用玻璃巴斯德吸管将83%次氯酸钠漂白液滴加到石蜡膜上。漂白剂和冰醋酸均具有腐蚀性。应在通风橱或通风良好的区域戴手套操作。DAPI 也具有刺激性，应戴手套操作。随后，移除叶片上的成虫粉虱，并将叶片置于显微镜下。小心地从基部抬起每个卵，直到卵柄从叶片上移除。在执行本方案前，应先在多个卵上进行练习。从基部缓慢抬起卵，一旦观察到卵柄已脱离叶片，即将卵完全从叶片上取下。将两到三个卵转移至每滴漂白液中，静置10分钟。使用玻璃移液管弃去漂白液以固定卵。然后加入数滴冰醋酸，等待3分钟。接下来，去除冰醋酸，加入数滴Clarke's溶液。然后等待10分钟，直至大部分溶液挥发。再加入数滴70%乙醇，并再次等待10分钟。为了染色卵子，首先去除残留的乙醇。然后向卵子中加入数滴1×PBS，使pH接近7。将显微镜载玻片放入湿化室中，以防止干燥。30分钟后，移除1×PBS，并滴加1微克/毫升的DAPI。将显微镜载玻片置于避光湿盒中，静置至少15分钟。清洗卵时，首先移除DAPI溶液。然后向卵中加入数滴1xTBST。五分钟后，移除1xTBST。重复此洗涤步骤两次，共洗涤三次。最后一次洗涤后，小心地将石蜡膜上的所有卵用移液器转移至显微镜载玻片的洁净区域。去除多余的 TBST 溶液，加入 20 微升封片剂。最后，将洁净的盖玻片覆盖在卵上，用透明指甲油密封盖玻片以长期保存，并使用荧光显微镜进行成像。卵壳去除后进行DAPI核染色，通过荧光显微镜观察可确定受精情况及胚胎性别。雌性原核位于受精雌卵和未受精雄卵的中央附近，而精子仅在雌性卵的顶端附近呈现为一条明亮的条带。该技术的一个应用是判断细菌内共生体是否影响烟粉虱的初级性别比例。例如，感染立克次体与未感染的烟粉虱（B.tabici）所产卵的初级性比在两种处理之间无显著差异。对于培养至成虫阶段的个体，感染与未感染立克次体的成虫也表现出类似结果，至少在本研究中未发现感染立克次体的雌性具有更高的受精率。通过使用本实验方案，可确定种间精子是否能够使卵子受精。若未观察到受精现象，可回溯检查交配过程中精子是否成功转移，方法是观察雌性个体的受精囊中是否存在精子。若发生受精，可通过比较成虫的性别比例与受精率，来确定杂交后代发育的存活能力。

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Research

科研

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Genetics

遗传学

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