利用细胞遗传学技术测定烟粉虱 Bemisia tabaci 的卵受精率

Liz 开发的方案使我们能够确定粉虱的受精率。应用这一技术将加深我们对粉虱行为与生态学的理解。粉虱为单双倍体，因此受精率等于产卵时的性别比例。

据我们所知，本实验方案是首次针对粉虱描述的方法，可在三小时内完成。首先，在培养皿盖上制作一个可覆盖的孔洞，用于插入和取出成虫粉虱。设置一个湿度培养箱，并通过将一根细针以适宜操作的角度插入熔化的移液器吸头中，制备一根细探针。

可选步骤：用加热法延长玻璃移液管尖端，以便更方便地操作粉虱卵。然后，让雌性粉虱在一片洁净的叶片上产卵，将叶片剪裁至合适大小后置于培养皿中的琼脂上。在粉虱产卵期间，用肥皂和水清洗显微镜载玻片。

将其充分干燥，并在一端覆盖一层石蜡膜，以便液体形成液滴，更易于观察卵。去卵壳时，在移除成虫并收集卵之前，使用玻璃巴斯德吸管将83%次氯酸钠漂白液滴加到石蜡膜上。漂白剂和冰醋酸均具有腐蚀性。

应在通风橱或通风良好的区域戴手套操作。DAPI 也具有刺激性，应戴手套操作。随后，移除叶片上的成虫粉虱，并将叶片置于显微镜下。

小心地从基部抬起每个卵，直到卵柄从叶片上移除。在执行本方案前，应先在多个卵上进行练习。从基部缓慢抬起卵，一旦观察到卵柄已脱离叶片，即将卵完全从叶片上取下。

将两到三个卵转移至每滴漂白液中，静置10分钟。使用玻璃移液管弃去漂白液以固定卵。然后加入数滴冰醋酸，等待3分钟。

接下来，去除冰醋酸，加入数滴Clarke's溶液。然后等待10分钟，直至大部分溶液挥发。再加入数滴70%乙醇，并再次等待10分钟。

为了染色卵子，首先去除残留的乙醇。然后向卵子中加入数滴1×PBS，使pH接近7。将显微镜载玻片放入湿化室中，以防止干燥。

30分钟后，移除1×PBS，并滴加1微克/毫升的DAPI。将显微镜载玻片置于避光湿盒中，静置至少15分钟。清洗卵时，首先移除DAPI溶液。

然后向卵中加入数滴1xTBST。五分钟后，移除1xTBST。重复此洗涤步骤两次，共洗涤三次。

最后一次洗涤后，小心地将石蜡膜上的所有卵用移液器转移至显微镜载玻片的洁净区域。去除多余的 TBST 溶液，加入 20 微升封片剂。最后，将洁净的盖玻片覆盖在卵上，用透明指甲油密封盖玻片以长期保存，并使用荧光显微镜进行成像。

卵壳去除后进行DAPI核染色，通过荧光显微镜观察可确定受精情况及胚胎性别。雌性原核位于受精雌卵和未受精雄卵的中央附近，而精子仅在雌性卵的顶端附近呈现为一条明亮的条带。该技术的一个应用是判断细菌内共生体是否影响烟粉虱的初级性别比例。

例如，感染立克次体与未感染的烟粉虱（B.tabici）所产卵的初级性比在两种处理之间无显著差异。对于培养至成虫阶段的个体，感染与未感染立克次体的成虫也表现出类似结果，至少在本研究中未发现感染立克次体的雌性具有更高的受精率。通过使用本实验方案，可确定种间精子是否能够使卵子受精。

若未观察到受精现象，可回溯检查交配过程中精子是否成功转移，方法是观察雌性个体的受精囊中是否存在精子。若发生受精，可通过比较成虫的性别比例与受精率，来确定杂交后代发育的存活能力。