Name: 哺乳动物细胞周期内蛋白质激酶 rna 激活的 rna 相互作用研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学习利用甲醛交联和免疫沉淀技术，在全基因组范围内鉴定哺乳动物细胞周期中蛋白质激酶PKR的RNA相互作用分子，深入了解转录后调控机制及其在神经退行性疾病中的潜在作用。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过韩国科技信息通信部资助的基础科学研究中心项目（NRF-2016R1C1B2009886）支持。

1. 溶液和细胞的制备
<ol>
	<li>溶液配制
	<ol>
		<li>对于细胞培养基，通过向500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）来配制HeLa细胞培养用培养基。 
		注意：可向细胞培养基中添加抗生素，但我们不使用抗生素。</li>
		<li>对于0.1%的多聚甲醛，将4%（w/v）多聚甲醛在热板上加热溶解于1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并用1×PBS稀释以配制30 mL的0.1%（v/v）多聚甲醛溶液。 
		注意：所有操作均需在通风橱中进行，注意避免煮沸多聚甲醛溶液。0.1%溶液需避光保存，并于4 °C储存。溶液应在一个月内使用完毕。 
		注意：最终的0.1%（v/v）多聚甲醛溶液pH值应约为7。</li>
		<li>配制fCLIP裂解缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、15 mM NaCl、10 mM EDTA、0.5%（v/v）Nonidet-P40（NP-40）、0.1%（v/v）Triton X-100、0.1%（v/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1%（w/v）脱氧胆酸钠。加入三蒸水（TDW）至40 mL。4 °C保存。</li>
		<li>配制fCLIP洗涤缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、10 mM EDTA、0.1%（v/v）NP-40、0.1%（v/v）Triton X-100、0.1%（v/v）SDS和0.1%（w/v）脱氧胆酸钠。加入TDW至40 mL。4 °C保存。</li>
		<li>配制4×蛋白酶K缓冲液（4× PK缓冲液）：400 mM Tris-HCl（pH 7.5）、200 mM NaCl、40 mM EDTA和4%（v/v）SDS。加入TDW至40 mL。室温保存。</li>
		<li>配制fCLIP洗脱缓冲液：20 mL 4× PK缓冲液、21 g尿素和8.5 mL TDW。现用现配。</li>
		<li>配制RNA洗脱缓冲液：0.3 M NaOAc和2%（w/v）SDS。室温保存。</li>
		<li>配制2× RNA上样染料：0.025%（w/v）溴酚蓝、0.025%（w/v）二甲苯青、5 mM EDTA、0.05%（w/v）SDS和95%（v/v）甲酰胺。-20 °C保存。</li>
		<li>配制1× TBE缓冲液：0.089 M Tris-硼酸盐和0.002 M EDTA。配制500 mL TBE缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S期或M期阻滞细胞的制备
	<ol>
		<li>分别接种约750,000或约1,000,000个HeLa细胞用于S期或M期阻滞样品。在37 °C和5% CO2条件下培养24小时。</li>
		<li>用2 mM胸腺嘧啶处理细胞，并在37 °C下孵育18小时。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞两次。加入新鲜培养基，并在37 °C下孵育9小时。</li>
		<li>对于S期阻滞细胞，用2 mM胸腺嘧啶处理细胞；对于M期阻滞细胞，用100 ng/mL诺考达唑处理细胞。在37 °C下孵育15小时后收集细胞。 
		注意：可通过FACS检测细胞周期样品的均一性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 甲醛交联与免疫沉淀
<ol>
	<li>细胞收获
	<ol>
		<li>对于S期样品，使用细胞刮刀收集细胞，并转移至15 mL锥形管中。对于M期样品，轻敲细胞培养皿侧壁以脱落处于M期阻滞的细胞，并将其转移至15 mL锥形管中。 
		注意：为提高M期阻滞细胞的均一性，请勿使用细胞刮刀。</li>
		<li>在室温下以380 × g 离心3分钟。弃去上清液，加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，然后转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以10,000 × g 离心30秒。彻底弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲醛交联
	<ol>
		<li>加入750 μL 0.1%多聚甲醛，在室温下作用10分钟以固定细胞。</li>
		<li>加入250 μL 1 M甘氨酸，在室温下继续孵育10分钟以终止反应。在4 °C下以10,000 × g 离心30秒，彻底弃去上清液。</li>
		<li>用1 mL PBS重悬细胞沉淀。在4 °C下以10,000 × g 离心30秒，弃去上清液。</li>
		<li>用400 μL fCLIP裂解缓冲液（含0.2% (v/v) 蛋白酶抑制剂和2% (v/v) RNase抑制剂）重悬细胞。冰上孵育10分钟，并使用超声破碎仪进行超声处理。</li>
		<li>加入11 μL 5 M NaCl，使NaCl终浓度约为150 mM。短暂涡旋混匀后，在4 °C下以21,130 × g 离心15分钟。将上清液转移至预冷的1.5 mL微量离心管中。 
		注意：另取40 μL上清液置于新的离心管中作为输入样品（input sample），并在4 °C下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫沉淀
	<ol>
		<li>将20 μL Protein A磁珠加入1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>用400 μL fCLIP裂解缓冲液洗涤磁珠。在4 °C下以1,000 × g 离心1分钟。弃去上清液，小心加入400 μL fCLIP裂解缓冲液。通过倒置管体3~4次轻轻重悬磁珠。</li>
		<li>重复洗涤步骤三次。最后一次洗涤后，彻底弃去上清液。</li>
		<li>将磁珠重悬于300 μL fCLIP裂解缓冲液中，加入8.3 μL 5 M NaCl使NaCl终浓度约为150 mM。加入10 μL PKR抗体，在4 °C旋转孵育3小时。</li>
		<li>在4 °C下以1,000 × g 离心1分钟。弃去上清液，加入400 μL fCLIP洗涤缓冲液。通过倒置管体3~4次轻轻重悬磁珠。</li>
		<li>重复洗涤步骤两次。最后一次洗涤后，彻底弃去上清液。 
		注意：切勿使用涡旋振荡器，应手动轻轻倒置管体。</li>
		<li>加入300 μL裂解液，在4 °C旋转孵育3小时。 
		注意：延长孵育时间可能导致非特异性结合增加。</li>
		<li>在4 °C下以1,000 × g 离心1分钟。弃去上清液，加入400 μL fCLIP洗涤缓冲液。通过倒置管体3~4次轻轻重悬磁珠。</li>
		<li>重复洗涤步骤三次。最后一次洗涤后，彻底弃去上清液。</li>
		<li>加入300 μL fCLIP洗脱缓冲液，在25 °C恒温振荡器中孵育3小时，以从磁珠上洗脱PKR蛋白。 
		注意：fCLIP洗脱缓冲液需新鲜配制。</li>
		<li>在室温下以1,000 × g 离心，将上清液转移至洁净的硅化管中。 
		注意：也可使用普通微量离心管，但推荐使用硅化管，以防止后续去交联步骤（步骤2.3.12）中液体蒸发。</li>
		<li>加入300 μL蛋白酶K（20 mg/mL），在65 °C下孵育过夜。 
		注意：建议使用带加热盖的恒温振荡器，以避免蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA提取
	<ol>
		<li>加入580 μL酸性酚-氯仿试剂，涡旋振荡30秒。在37 °C孵育1小时。</li>
		<li>涡旋振荡30秒，在室温下以12,000 × g 离心10分钟。</li>
		<li>将上层水相转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。加入1/10体积的3 M NaOAc、0.5 μL共沉淀剂（如Glycoblue）以及等体积的异丙醇。在-20 °C孵育过夜。</li>
		<li>在4 °C下以最大转速离心1小时以沉淀核酸。 
		注意：若未观察到RNA/DNA沉淀，可额外加入0.5 μL共沉淀剂并再离心1小时。重复此操作直至可见沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，加入1 mL 75%乙醇。在4 °C下以12,000 × g 离心5分钟。再重复洗涤一次。彻底弃去上清液，并在室温下干燥沉淀。</li>
		<li>加入42 μL TDW、5 μL DNase I缓冲液、1 μL RNase抑制剂和2 μL DNase I，在37 °C孵育1小时。</li>
		<li>加入150 μL TDW和200 μL酸性酚-氯仿试剂，涡旋振荡30秒。在室温下以12,000 × g 离心10分钟。</li>
		<li>将上层水相转移至洁净的1.5 mL微量离心管中。加入20 μL 3 M NaOAc、0.5 μL共沉淀剂和1 mL 100%乙醇，在-80 °C孵育过夜。</li>
		<li>按照步骤2.4.4至2.4.5所述方法沉淀RNA并用75%乙醇洗涤。</li>
		<li>用适量TDW重悬RNA沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测序文库制备
<ol>
	<li>核糖体RNA（rRNA）去除
	<ol>
		<li>用28 μL的无核酸酶水（TDW）重悬步骤2.4.10中获得的RNA沉淀。 
		注意：总RNA的最大用量应少于5 μg。</li>
		<li>按照rRNA去除试剂盒的参考指南提供的操作步骤去除rRNA。</li>
		<li>通过加入160 μL磁珠纯化去除rRNA后的RNA。
		<ol>
			<li>用移液器吹打约15次混匀，并在室温下孵育15分钟。</li>
			<li>将离心管置于磁力架上，移除上清液。</li>
			<li>磁珠仍吸附在磁力架上时，加入300 μL 80%乙醇，并孵育30秒。</li>
			<li>更换为新鲜的300 μL乙醇溶液，在室温下将磁珠在磁力架上空气干燥12分钟。</li>
			<li>用12 μL无核酸酶水（TDW）重悬磁珠，并用移液器吹打15次混匀。</li>
			<li>将磁珠吸附至磁力架上，将上清液转移至新的洁净PCR管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据rRNA去除试剂盒提供的操作流程，进一步去除片段化的核糖体RNA（rRNA）。</li>
		<li>加入110 μL磁珠纯化RNA，并重复步骤3.1.3.1至3.1.3.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA标记与接头连接
	<ol>
		<li>在去除rRNA的RNA样本中加入2 μL 10×CIAP缓冲液、1 μL RNase抑制剂和2 μL南极碱性磷酸酶。在37 °C孵育1小时，随后在65 °C孵育5分钟以灭活磷酸酶。</li>
		<li>加入3 μL 10×PNK缓冲液、1.5 μL RNase抑制剂、1.5 μL T4多核苷酸激酶（PNK）酶、0.8 μL r-ATP和1.7 μL无核酸酶水（TDW）。在37 °C孵育50分钟。</li>
		<li>加入1.5 μL 10 mM ATP，并在37 °C继续孵育40分钟。</li>
		<li>加入170 μL RNA洗脱缓冲液终止反应。</li>
		<li>加入200 μL酸性酚-氯仿溶液，涡旋振荡30秒。在室温下以12,000 × g离心10分钟。</li>
		<li>将上层水相转移至新的洁净1.5 mL微量离心管中。加入20 μL 3 M NaOAc、0.5 μL共沉淀剂和1 mL 100%乙醇。在-80 °C孵育过夜。</li>
		<li>沉淀RNA，并按照步骤2.4.4至2.4.5所述方法用75%乙醇洗涤。用4.5 μL无核酸酶水（TDW）重悬，再加入9 μL 2×RNA上样染料。</li>
		<li>将样本在95 °C加热5分钟，上样至10%尿素-PAGE凝胶。</li>
		<li>以370 V电压电泳40分钟。 
		注意：上样前需以370 V预电泳90分钟。</li>
		<li>在凝胶约100–500核苷酸区域切胶并捣碎。</li>
		<li>加入700 μL 0.3 M NaCl，在4 °C旋转孵育过夜。</li>
		<li>将溶液转移至纯化柱中，在室温下最大转速离心5分钟。</li>
		<li>将流出液转移至新的洁净1.5 mL微量离心管中。加入1/10体积的3 M NaOAc、0.5 μL共沉淀剂和等体积异丙醇。在-20 °C孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3'端接头连接
	<ol>
		<li>按照步骤2.4.4至2.4.5所述方法沉淀RNA并用75%乙醇洗涤。</li>
		<li>用6.5 μL无核酸酶水（TDW）重悬RNA沉淀，并加入1 μL 10 μM的3'接头。</li>
		<li>将溶液转移至PCR管中，在70 °C孵育2分钟。</li>
		<li>加入1 μL 10×连接缓冲液、0.5 μL RNase抑制剂和1 μL T4 RNA连接酶2。在28 °C孵育1小时，25 °C孵育6小时，22 °C孵育6小时。</li>
		<li>加入12 μL 2×RNA上样染料，在95 °C加热5分钟。</li>
		<li>按照步骤3.2.9至3.2.13所述方法对连接了3'接头的RNA进行凝胶纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5'端接头连接
	<ol>
		<li>按照步骤2.4.4至2.4.5所述方法沉淀RNA并用75%乙醇洗涤。</li>
		<li>用4.2 μL无核酸酶水（TDW）重悬RNA沉淀，并加入1 μL 5 μM的5'接头。</li>
		<li>将溶液转移至PCR管中，在70 °C孵育2分钟。</li>
		<li>加入0.8 μL 10×连接酶缓冲液、0.4 μL RNase抑制剂、0.8 μL 10 mM ATP和0.8 μL T4 RNA连接酶1。在28 °C孵育1小时，25 °C孵育6小时，22 °C孵育6小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录与PCR扩增
	<ol>
		<li>在连接了5'接头的RNA样本中加入1 μL 4 μM的逆转录引物。在70 °C孵育2分钟后立即置于4 °C冷却。</li>
		<li>加入4 μL 5×FS缓冲液、4 μL 2.5 mM dNTP、1 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase抑制剂和1 μL逆转录酶。在50 °C孵育1小时，随后在70 °C孵育15分钟。</li>
		<li>准备PCR扩增
		<ol>
			<li>混合1 μL逆转录产物、1 μL 25 μM RPI引物、1 μL 25 μM RP1引物、10 μL 5×HF缓冲液、4 μL 2.5 mM dNTP、32.5 μL无核酸酶水（TDW）和0.5 μL高保真DNA聚合酶。</li>
			<li>运行PCR程序，共11~13个循环。 
			注意：PCR程序为：98 °C 30秒进行热启动，随后进行循环：98 °C 10秒、60 °C 30秒、72 °C 45秒，共重复11–13个循环，最后72 °C延伸5分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用40 μL磁珠纯化PCR产物，参照步骤3.1.3.1至3.1.3.6操作，但使用10 μL无核酸酶水（TDW）洗脱DNA。</li>
		<li>加入2 μL 10×DNA上样染料。将样本上样至6%丙烯酰胺凝胶，以200 V电泳30分钟。</li>
		<li>在室温下用Sybr Gold染色液（0.01% (v/v)，溶于1×TBE缓冲液）染色5分钟。</li>
		<li>在室温下用1×TBE缓冲液脱色5分钟。</li>
		<li>在凝胶约200–700核苷酸区域切胶并捣碎。</li>
		<li>加入700 μL 0.3 M NaCl，在室温下旋转孵育过夜以洗脱DNA。</li>
		<li>将全部溶液上样至纯化柱，在室温下最大转速离心5分钟。</li>
		<li>将流出液转移至新的洁净1.5 mL微量离心管中。加入1/10体积的3 M NaOAc、0.5 μL共沉淀剂和等体积异丙醇。在-20 °C孵育过夜。</li>
		<li>沉淀DNA并按照步骤2.4.4至2.4.5所述方法用75%乙醇洗涤。用20 μL无核酸酶水（TDW）重悬。</li>
		<li>使用测序仪对样本进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用qRT-PCR分析PKR相互作用RNA
<ol>
	<li>方法1：随机六聚体反转录
	<ol>
		<li>用8.5 μL的无核酸酶水（TDW）重悬第2.4.10步的RNA沉淀，并将溶液转移至PCR管中。</li>
		<li>加入0.5 μL的100 μM随机六聚体引物和4 μL的2.5 mM dNTP混合液。</li>
		<li>在65 °C加热5分钟，随后立即置于冰上孵育至少1分钟。</li>
		<li>配制反应混合液：4 μL的5× SSIV缓冲液、1 μL的100 mM DTT、1 μL的RNase抑制剂和1 μL的反转录酶（200 U/μL）。将该反应混合液加入RNA溶液中。</li>
		<li>在23 °C孵育10分钟，50 °C孵育10分钟，80 °C孵育10分钟。</li>
		<li>使用实时PCR系统分析cDNA。 
		注：实时PCR程序为：95 °C预变性3分钟；95 °C变性5秒、60 °C退火延伸10秒，共40个循环；熔解曲线分析为95 °C 30秒、65 °C 30秒、95 °C 30秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>方法2：链特异性反转录
	<ol>
		<li>配制反转录引物的总混合液：将含有CMV启动子序列及随后约20个核苷酸基因特异性序列的基因特异性反转录引物等量混合。 
		注：所有基因特异性反转录引物的总浓度为4 μM。</li>
		<li>用8.5 μL的无核酸酶水（TDW）重悬第2.4.10步的RNA沉淀，并将溶液转移至PCR管中。</li>
		<li>加入0.5 μL的4 μM反转录引物总混合液和4 μL的2.5 mM dNTP混合液。</li>
		<li>在65 °C加热5分钟，随后立即置于冰上孵育至少1分钟。</li>
		<li>通过混合4 μL的5× SSIV缓冲液、1 μL的100 mM DTT、1 μL的RNase抑制剂和1 μL的反转录酶（200 U/μL）配制反应溶液。将该反应溶液加入RNA与引物的混合液中。</li>
		<li>在50 °C孵育10分钟，80 °C孵育10分钟。</li>
		<li>使用实时PCR系统分析cDNA。 
		注：实时PCR程序与方法1中所述相同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li>
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<li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+%28PKR%29+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson%27s+disease+and+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li>
<li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li>
<li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer%27s+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li>
<li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%2C+PKR%2C+binds+preferentially+to+Huntington%27s+disease+%28HD%29+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li>
<li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine%2Fthreonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li>
<li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li>
<li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li>
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<li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li>
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<li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%2C+PKR%2C+down-regulates+CDC2%2Fcyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAU1+binding+3%27+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li>
<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li>
<li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins%3A+Lessons+from+DROSHA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

制备S期或M期阻滞样品的流程如图1所示。为将细胞阻滞在S期，我们采用胸腺嘧啶双阻滞法，即对细胞进行两次胸腺嘧啶处理，中间间隔9小时的释放期，以确保高效的阻滞效果（图1A）。对于M期阻滞，我们先用胸腺嘧啶处理一次细胞，随后释放9小时，再加入诺考达唑（nocodazole）以将细胞阻滞在前中期（图1B）。制备细胞周期样品的一个关键步骤是在第一次胸腺嘧啶阻滞后进行的释放步骤。为彻底去除胸腺嘧啶，必须使用新鲜PBS对细胞至少洗涤两次。洗涤不充分或残留的胸腺嘧啶可能导致细胞异质性增加和细胞活力下降。M期阻滞的成功可通过形态学观察来确认，即圆形细胞数量明显增多（图2A）。然而，根据形态判断，M期样品中仍含有大量间期细胞。为了仅收集M期阻滞的细胞，我们施加物理力使M期细胞从培养表面脱落。收获细胞的核含量进一步通过流式细胞术（FACS）检测，结果显示S期样品在2n至4n之间出现一个宽峰，而M期阻滞样品在4n处呈现一个...

蛋白激酶RNA激活型（PKR），也称为真核起始因子2-α激酶2（EIF2AK2），是一种特征明确的蛋白激酶，可传递RNA提供的信息。它属于真核翻译起始因子2α亚基（eIF2α）激酶家族，在感染发生时通过磷酸化eIF2α的丝氨酸51位点来抑制全局翻译1。在此过程中，PKR被病毒来源的双链RNA（dsRNA）激活，dsRNA为PKR的二聚化和自磷酸化提供了平台2。除了eIF2α外，PKR还可磷酸化p53、胰岛素受体底物1、抑制因子κB以及c-Jun氨基末端激酶（JNK），从而调控多种信号转导通路的活性3,4,5,6。
PKR最初被发现是一种激酶，在脊髓灰质炎病毒感染过程中通过识别病毒的双链RNA（dsRNA）使eIF2α发生磷酸化7,8。越来越多的研究发现，PKR在免疫反应之外也具有多种功能，其异常激活或功能障碍与多种人类疾病相关。活化/磷酸化的PKR（pPKR）在细胞凋亡过程中经常被观察到，也是退行性疾病患者（尤其是亨廷顿病、帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病）的常见特征9,10,11,12,13。此外，PKR在多种应激条件下（如代谢应激和热休克）也会被激活14,15,16,17。另一方面，PKR的抑制会导致细胞增殖增加，甚至引发恶性转化18,19。PKR的功能在正常脑功能和细胞周期中也十分重要，因为在M期pPKR水平会升高20,21,22。在此背景下，pPKR可抑制全局翻译，并为正确细胞分裂所必需的关键有丝分裂信号系统提供调控线索20。此外，在中国仓鼠卵巢细胞中，PKR的持续活化会导致G2/M期细胞周期阻滞23。因此，PKR磷酸化受到负反馈环路的调控，以确保在M/G1期转换期间迅速失活21。
尽管PKR具有多种功能，但由于缺乏标准化的高通量实验方法来捕获和鉴定能够激活PKR的双链RNA（dsRNA），我们对PKR激活机制的理解仍然有限。先前的研究表明，PKR可与由两个反向重复的Alu序列（IRAlus）形成的dsRNA相互作用20,24，但在人类细胞中，细胞周期或应激条件下是否还存在其他能够激活PKR的细胞内dsRNA，这一可能性尚未被探索。传统上鉴定RNA结合蛋白（RBP）所结合RNA的方法是利用紫外光交联RNA-RBP复合物25,26,27。最近一项研究在小鼠系统中应用了这种紫外交联方法，发现小核仁RNA可在代谢应激过程中调控PKR的激活16。通过利用甲醛的高交联效率，&#160;我们提出了一种替代方法，用于鉴定HeLa细胞在细胞周期中与PKR相互作用的RNA28。类似的方法已被用于研究其他双链RNA结合蛋白（dsRBP），如Staufen和Drosha29,30,31。我们发现，PKR可与多种非编码RNA相互作用，包括短散在核元件（SINE）、长散在核元件（LINE）、内源性逆转录病毒元件（ERV），甚至α卫星RNA。此外，我们还发现PKR可与线粒体RNA（mtRNA）相互作用，这些mtRNA通过重链RNA与轻链RNA之间的互补配对形成分子间双链结构28。最近的一项研究进一步支持了我们的数据，表明某些mtRNA以双链形式存在，并可激活如黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）等dsRNA传感器，从而诱导干扰素的产生32。更重要的是，mtRNA的表达水平及其亚细胞定位在细胞周期进程以及多种应激因素作用下受到调控，这可能在其调控PKR激活能力方面具有重要意义28。
本文介绍了一种新近开发的甲醛交联免疫沉淀（fCLIP）方法的详细实验方案，用于在细胞周期过程中捕获并分析与PKR相互作用的RNA。我们展示了利用胸腺嘧啶和诺考达唑制备细胞周期阻滞样本的方法。随后，介绍了fCLIP流程以分离与PKR结合的RNA，并描述了构建高通量测序文库以鉴定这些RNA的方法。此外，我们详细阐述了使用qRT-PCR分析PKR结合RNA的具体步骤，特别是采用链特异性逆转录方法来分析mtRNA的链取向性。本方案针对HeLa细胞和PKR蛋白进行了优化，但其中关键步骤——如细胞周期样本制备、fCLIP以及链特异性qRT-PCR分析——可轻松修改，用于研究细胞内双链RNA或鉴定其他dsRBP蛋白的RNA互作分子。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris，pH 7.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris，pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微型离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td><td>Biosolution</td><td>BN015</td><td></td></tr><tr><td>10X DNA 上样缓冲液</td><td>TaKaRa</td><td>9157</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3' 接头</td><td></td><td></td><td>5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'</td></tr><tr><td>3 M 醋酸钠，pH 5.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' 接头</td><td></td><td></td><td>5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>酸性酚-氯仿，pH 4.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>磁珠用于 DNA/RNA 纯化</td></tr><tr><td>南极碱性磷酸酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>抗-DGCR8 抗体</td><td></td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>抗-PKR 抗体 (D7F7)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>抗-PKR 抗体 (Milli)</td><td>Millipore EMD</td><td>07-151</td><td></td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-2056-01</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝钠盐</td><td>Sigma-aldrich</td><td>B5525</td><td></td></tr><tr><td>小牛肠碱性磷酸酶</td><td>TaKaRa</td><td>2250A</td><td></td></tr><tr><td>25 cm 两位置细胞刮刀</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>CMV 启动子序列</td><td></td><td></td><td>5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合物 (2.5 mM)</td><td>TaKaRa</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，无水，ACS 级</td><td>Alfa-Aesar</td><td>A9951</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Merck</td><td>M-TMS-013-BKR</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Merck</td><td>104008</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bio-basic</td><td>GB0235</td><td></td></tr><tr><td>甘油蓝共沉淀剂 (15 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Merck</td><td>8.18766.1000</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext rRNA 耗竭试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E6318</td><td>rRNA 耗竭试剂盒</td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>正常兔 IgG</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>PCR 正向引物 (RP1)</td><td></td><td></td><td>5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'</td></tr><tr><td>PCR 索引反向引物 (RPI)</td><td></td><td></td><td>5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'</td></tr><tr><td>带平盖 PCR 管，0.2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>高保真聚合酶</td></tr><tr><td>带摆动转子的 PlateFuge 微型离心机</td><td>Benchmark</td><td>c2000</td><td></td></tr><tr><td>多核苷酸激酶 (PNK)</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K，重组，PCR 级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：CO1 重链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：CO1 轻链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：CO2 重链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：CO2 轻链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：CO3 重链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：CO3 轻链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：CYTB 重链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：CYTB 轻链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：GAPDH</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：ND1 重链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：ND1 轻链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：ND4 重链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：ND4 轻链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：ND5 重链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：ND5 轻链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：ND6 重链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>qPCR 引物序列：ND6 轻链</td><td></td><td></td><td>正向/反向：5&amp;prime;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&amp;prime;/5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>随机六聚体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>重组 Dnase I (Rnase-free) (5 U/&amp;mu;L)</td><td>TaKaRa</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>重组 Rnase 抑制剂 (40 U/&amp;mu;L)</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero rRNA 去除试剂盒</td><td>Illumina</td><td>MRZH116</td><td>rRNA 去除试剂盒</td></tr><tr><td>旋转混合器</td><td>FINEPCR, ROTATOR AG</td><td>D1.5-32</td><td></td></tr><tr><td>RT 引物序列：CO1 重链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：CO1 轻链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：CO2 重链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：CO2 轻链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：CO3 重链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：CO3 轻链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：CYTB 重链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：CYTB 轻链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：GAPDH</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：ND1 重链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：ND1 轻链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：ND4 重链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：ND4 轻链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：ND5 重链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：ND5 轻链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：ND6 重链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>RT 引物序列：ND6 轻链</td><td></td><td></td><td>5&amp;prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>硅化聚丙烯 1.5 mL G 型管</td><td>Bio Plas</td><td>4167SLS50</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Biosesang</td><td>S1010</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase In Rnase 抑制剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080093</td><td>用于文库构建的逆转录酶</td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆转录酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090010</td><td>用于 qRT-PCR 的逆转录酶</td></tr><tr><td>SYBR gold 核酸染色剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 1 (ssRNA 连接酶)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA 连接酶 2，截短型 KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf ThermoMixer C 配 ThermoTop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胸苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tris-硼酸-EDTA 缓冲液 (TBE)</td><td>TaKara</td><td>T9122</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink Protein A Sepharose 磁珠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22810</td><td>Protein A 磁珠</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Bioruptor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Bio-basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP (10 &amp;mu;Ci/&amp;mu;L, 3.3 &amp;mu;M)</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A100UC</td><td></td></tr></tbody></table>

研究哺乳动物细胞周期中蛋白激酶rna激活剂的rna相互作用分子

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

蛋白激酶RNA激活蛋白（PKR）是先天免疫反应蛋白家族的成员，能够识别病毒RNA的双链二级结构。当与病毒双链RNA（dsRNA）结合后，PKR会发生二聚化并随之发生自磷酸化。磷酸化的PKR（pPKR）被激活，进而诱导真核翻译起始因子2α亚基（eIF2α）的磷酸化，从而抑制全局翻译。越来越多的证据表明，PKR可在无感染的情况下被激活，例如在细胞周期过程中或多种应激条件下。然而，由于缺乏标准化的实验方法来捕获和分析与PKR相互作用的dsRNA，我们对PKR的RNA激活物仍知之甚少。本文中，我们提供了一种利用HeLa细胞特异性富集和分析细胞周期中PKR结合RNA的实验方案。我们利用甲醛高效的交联活性固定PKR-RNA复合物，并通过免疫沉淀法将其分离。随后可对PKR共免疫沉淀的RNA进行进一步处理，构建高通量测序文库。与PKR相互作用的一类主要细胞内dsRNA是线粒体RNA（mtRNA），其可通过重链RNA与轻链RNA之间的互补配对形成分子间dsRNA。为了研究这些双链mtRNA的链特异性，我们还提供了一种链特异性qRT-PCR的实验方案。本方案针对PKR结合RNA的分析进行了优化，但也可轻松修改用于研究其他细胞内dsRNA或其它dsRNA结合蛋白的RNA互作分子。

在图1中展示了将HeLa细胞阻滞在细胞周期S期或M期的流程示意图。对于处于M期阻滞的样本，我们可在显微镜下清晰观察到呈圆形的细胞（图2A）。为了检测细胞周期阻滞的效率，可通过FACS分析细胞的核内DNA含量（图2B）。图3展示了免疫沉淀效率检测的代表性数据，其中D7F7抗体在免疫沉淀PKR方面表现出更优的能力。这种免疫沉淀效率的差异可能反映在使用两种不同PKR抗体构建的高通量测序文库在类别分布上的差异（图4）。D7F7抗体的特异性进一步通过PKR免疫沉淀物的全膜Western印迹分析（图5A）以及全细胞裂解液的分析（图5B）得到验证。图6显示了在高通量测序文库构建过程中去除rRNA前后放射性同位素信号的变化。图7显示了与PKR共免疫沉淀的RNA中mtRNA的富集情况，而在...

我们介绍了利用HeLa细胞研究哺乳动物细胞周期中双链RNA结合蛋白激酶RNA激活型（PKR）的RNA相互作用分子的实验方法。该方法利用甲醛交联RNA-PKR复合物，并通过免疫沉淀富集与PKR结合的RNA。这些RNA可进一步通过高通量测序或定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行分析。

研究哺乳动物细胞周期中蛋白激酶RNA激活剂的RNA相互作用分子

蛋白激酶R（PKR）是先天免疫反应蛋白家族的成员，可识别病毒双链二级结构……

本方案提供了一种在全基因组范围内鉴定RNA结合蛋白PKR的RNA互作分子的方法。该方法有助于我们更深入地理解RNA结合蛋白在基因表达转录后调控中的作用。该技术的主要优势在于利用甲醛高效交联，将与RNA结合蛋白结合的RNase固定，并通过免疫沉淀进行富集。在神经退行性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）患者中可观察到活化的PKR。鉴定与PKR相互作用的双链RNA酶将有助于我们更深入理解这些退行性疾病的发病机制。该方法可用于研究任何RNA结合蛋白的RNA相互作用分子。特别是，我们认为该方法适用于研究识别具有结构的RNase的蛋白质，例如双链RNase。在收集细胞之前，应检测周期阻滞样本的均一性。此外，使用现有最佳抗体优化免疫沉淀效率至关重要。首先，分别接种 750,000 或 1,000,000 个 HeLa 细胞用于 S 期或 M 期阻滞样本。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下培养细胞 24 小时。用 2 毫摩尔的胸腺嘧啶处理细胞，并在 37 摄氏度下孵育 18 小时。用 PBS 洗涤细胞两次。然后加入新鲜培养基，在 37°C 下孵育 9 小时。对于 S 期阻滞的细胞，用 2 mM 胸腺嘧啶核苷处理细胞。对于M期阻滞的细胞，用每毫升100纳克的诺考达唑处理细胞，在37摄氏度下孵育15小时。对于S期样品，用细胞刮收集细胞，并转移至15毫升锥形管中。对于M期样品，轻敲细胞培养皿侧面以使处于M期阻滞的细胞脱落，并将其转移至15毫升锥形管中。随后，在室温下以380 g离心3分钟。弃去上清液，并用1毫升预冷的PBS重悬细胞。将细胞转移至1.5毫升微量离心管中，在4°C、10,000 g条件下离心30秒，彻底去除上清液。进行甲醛交联时，首先向细胞中加入750微升0.1%多聚甲醛，在室温下孵育10分钟以固定细胞。然后，加入 250 µL 1 M 甘氨酸，在室温下继续孵育 10 分钟以终止反应。在 4 °C 条件下以 10,000 ×g 离心 30 秒。彻底去除上清液。接下来，用一毫升 PBS 重悬。在 4 °C 条件下以 10,000 g 离心 30 秒，弃去上清液。用 400 微升 fCLIP 裂解缓冲液重悬，缓冲液中需添加 0.2%（体积百分比）蛋白酶抑制剂和 2%（体积百分比）RNase 抑制剂。冰上孵育10分钟，使用超声波破碎仪进行超声处理。接着，加入11微升5摩尔的氯化钠，使氯化钠浓度调整至150毫摩尔，并短暂涡旋混匀。然后，在4摄氏度、21,130 ×g条件下离心15分钟。将上清液转移至预冷的1.5毫升微量离心管中。进行免疫沉淀时，首先向1.5毫升微量离心管中加入20微升蛋白A磁珠，然后用400微升fCLIP裂解缓冲液洗涤磁珠。在4 °C条件下，以1,000 ×g离心珠子1分钟。随后，移除上清液，小心加入400 µL fCLIP裂解缓冲液，并通过倒置3至4次轻轻重悬珠子。重复洗涤步骤三次。最后一次洗涤后，彻底去除上清液。将磁珠重悬于 300 微升 fCLIP 裂解缓冲液中。加入 8.3 微升 5 摩尔氯化钠，以调节氯化钠浓度至 150 毫摩尔。加入10 µL蛋白激酶RNA激活抗体，在4 °C条件下于旋转仪上孵育3小时。接着，在4 °C条件下以1,000 ×g离心1分钟。弃去上清液，加入400 µL fCLIP洗涤缓冲液，通过倒置3至4次轻轻重悬珠子。重复洗涤步骤两次。最后一次洗涤后，彻底去除上清液。接着，加入 300 µL 裂解液，在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 3 小时。然后，在 4 °C 条件下以 1,000 ×g 离心 1 分钟。弃去上清液，加入 400 µL fCLIP 洗涤缓冲液，通过倒置 3 至 4 次轻轻重悬珠子。重复洗涤步骤 3 次。最后一次洗涤后，彻底去除上清液。接着，加入 300 µL fCLIP 洗脱缓冲液。在 ThermoMixer 中于 25 °C 孵育 3 小时，以从磁珠中洗脱蛋白激酶 RNA 激活剂。在室温下以 1,000 g 离心，将上清液转移至洁净的硅化管中。最后加入 300 微升蛋白酶 K，并在 65 摄氏度下孵育过夜。使用流式细胞术（FACS）检测 HeLa 细胞在 S 期或 M 期细胞周期阻滞的效率。D7F7 抗体在免疫沉淀蛋白激酶 RNA 激活剂（protein kinase RNA activated）方面表现出更优的能力。对免疫沉淀的 PKR 或总 HeLa 裂解液进行的 Western 印迹分析仅显示一条与 PKR 分子大小相对应的强条带，表明 D7F7 抗体在识别 PKR 时具有高度特异性。使用不同免疫沉淀效率的 PKR 抗体，会导致测序读段在基因组定位上的类别分布不同。成功去除rRNA后，PKR共免疫沉淀的RNase的放射性同位素信号降低。PKR共免疫沉淀的RNA样本显示，与阴性对照相比，线粒体RNase显著富集。采用链特异性逆转录法，以区分在S期或M期阻滞细胞中与PKR共免疫沉淀的重链和轻链线粒体RNase。制备细胞周期阻滞样品最关键的步骤是：必须用 PBS 洗涤细胞两次，以及必须仅收集均一的细胞，否则样品的均一性将受到影响。对于甲醛交联处理，最关键的步骤是甲醛交联反应本身以及其用量。在此步骤之后，洗脱的 RNA 可通过 Northern 印迹、qRT-PCR 或高通量测序进行分析。这些实验可以鉴定与PKR结合的RNase的类型及相对含量。该技术可用于研究和鉴定RNA结合蛋白的RNA相互作用分子，从而加深我们对RNA结合蛋白介导的基因表达转录后调控的理解。甲醛具有危害性，因此在操作固定液及初始洗涤缓冲液时需谨慎小心。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

哺乳动物细胞周期内蛋白质激酶 rna 激活的 rna 相互作用研究

基于FRET的报告分子正越来越多地用于监测活细胞中激酶和磷酸酶的活性。本文介绍了一种利用基于FRET的报告分子评估细胞周期依赖性靶蛋白磷酸化变化的方法。...

通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

通过本方案，利用流式细胞术可轻松测定细胞群体的细胞周期位置，或了解信号如何影响细胞增殖。我们报告了一种简单的实验方法，用于对细胞进行染色并定量分析其在细胞周期中的位置。...

哺乳动物细胞周期位置分析

本文描述了一种通过特异性寡核苷酸定向富集的方法，用于分离在真核细胞中形成的特定同源核糖核蛋白复合物（RNP）。我们通过分离与逆转录病毒5'非翻译区结合的同源RNP（其组分包含DHX9/RNA解旋酶A）来展示该方法的适用性。...

利用寡核苷酸定向洗脱法从细胞中分离同源RNA-蛋白质复合物

RNA-蛋白质相互作用是许多细胞过程的核心。本文介绍一种在活体（in...

通过RaPID方法分离新型RNA结合蛋白

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。...

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

我们介绍一种用于HeLa细胞的双胸苷同步化方案，随后利用高分辨率共聚焦显微镜进行分析。该方法对于获得大量同步从S期进入有丝分裂期的细胞至关重要，从而能够研究兼具间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。...

结合有丝分裂细胞同步化与高分辨率共聚焦显微镜技术研究多功能细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外...

通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

动力学交联与cDNA分析是一种能够在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用动态过程的方法。本文详细描述了该实验方案，包括酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备等步骤。...

使用&#967;CRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态

本方案描述了一种非放射性检测方法，用于测定多核苷酸激酶（PNKs）在小型DNA和RNA底物上的激酶活性。...

测量小核苷酸底物多核苷酸磷酸化的非放射性检测方法

学习利用甲醛交联和免疫沉淀技术，在全基因组范围内鉴定哺乳动物细胞周期中蛋白质激酶PKR的RNA相互作用分子，深入了解转录后调控机制及其在神经退行性疾病中的潜在作用。

研究哺乳动物细胞周期中蛋白激酶RNA激活剂的RNA相互作用分子

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