哺乳动物细胞周期内蛋白质激酶 rna 激活的 rna 相互作用研究

该协议提供了一种方法，以全基因组方式识别RNA结合蛋白PKR的RNA相互作用者。它帮助我们更好地了解RNA结合蛋白对基因表达的转录后调控。该技术的主要优点是利用甲醛的高效交联来修复与RNA结合蛋白结合的RNase，并通过免疫沉淀来丰富它们。

在神经退行性疾病（如帕金森氏症和阿尔茨海默病）患者中观察到激活PKR。识别PKR相互作用双链RNase将有助于我们更好地了解这些退行性疾病的发病机制。此方法可用于研究任何RNA结合蛋白的RNA相互作用器。

特别是，我们认为，这种方法是有用的研究蛋白质，识别结构化的RNase，如双链RNase。在收获细胞之前，检查循环收集样本的均匀性。此外，使用最好的抗体优化免疫沉淀效率至关重要。

首先，种子75万或100万个希拉细胞分别用于S-或M相逮捕样本。在37摄氏度和5%的二氧化碳下生长细胞24小时。用两毫摩尔胸腺素治疗细胞，并在37摄氏度下孵育18小时。

用PBS清洗细胞两次。然后，加入新的介质，在37摄氏度下孵育9小时。对于S相逮捕细胞，用两毫摩尔胸腺素治疗细胞。

对于M相逮捕细胞，治疗每毫升诺科达佐尔100毫微克的细胞。在37摄氏度下孵育15小时。对于 S 相样本，使用细胞刮刀收集细胞，然后转移到 15 毫升锥形管中。

对于 M 相样本，点按细胞培养盘的侧面分离 M 相带细胞，然后将它们转移到 15 毫升锥形管中。接下来，在室温下以380g离心3分钟。取出上清液，用一毫升冷PBS重新暂停细胞。

将细胞转移到1.5毫升微离心管中。在4摄氏度下将10，000克的细胞离心30秒，并完全去除超钠。要进行甲醛交联，首先在细胞中加入750微升0.1%的甲状甲醛，并在室温下孵育10分钟以固定细胞。

然后，加入250微升的一摩尔甘氨酸，并在室温下孵育10分钟，以抑制反应。在4摄氏度下将10，000克的细胞离心30秒。完全去除超自然。

接下来，重新使用一毫升的PBS。在4摄氏度下将10，000克的细胞离心30秒，然后取出上一代。重新使用400微升的fCLIP解液缓冲液，辅以0.2体积百分比蛋白酶抑制剂和2个体积百分比RNase抑制剂。

在冰上孵育10分钟，并使用超声波器进行声波化。接下来，加入11微升的五摩尔氯化钠，将氯化钠浓度调整为150毫摩尔，并短暂旋转。然后，在4摄氏度下在21，130g下离心15分钟。

将超自然剂转移到预冷却的 1.5 毫升微离心管中。为了进行免疫沉淀，首先将20微升蛋白质 A 珠加入 1.5 毫升微离心管。然后，用400微升的fCLIP解液缓冲液清洗珠子。

在4摄氏度下将珠子在1000克下离心一分钟。接下来，去除上流液，小心地加入400微升的fCLIP解液缓冲液，然后通过反转三到四次轻轻重新填充珠子。重复洗涤步骤三次。

最后洗涤后，完全取出超自然剂。将珠子重新填充在 300 微升的 fCLIP 解液缓冲液中。加入8.3微升的五摩尔氯化钠，将氯化钠浓度调整为150毫摩尔。

加入10微升蛋白激酶RNA活性抗体，在4摄氏度的旋转器上孵育3小时。接下来，在4摄氏度下将珠子在1000克下离心一分钟。取出上流水线，加入400微升的fCLIP洗涤缓冲液，轻轻倒掉三到四次珠子。

重复洗涤步骤两次。最后洗涤后，完全取出超自然剂。接下来，加入300微升的赖酸盐，并在4摄氏度的旋转器上孵育3小时。

然后，在摄氏4度的1000克下将珠子离心一分钟。取出上流水线，加入400微升的fCLIP洗涤缓冲液，轻轻倒掉三到四次珠子。重复洗涤步骤三次。

最后洗涤后，完全取出上经液。接下来，添加 300 微升的 fCLIP 洗脱缓冲液。在25摄氏度的热混合器中孵育3小时，从珠子中培育蛋白激酶RNA。

在室温下在1000克下离心，将超自然剂转移到清洁的硅化管中。最后，加入300微升的蛋白酶K，在65摄氏度下孵育过夜。使用 FACS 检查了S或M相的 HeLa 细胞的细胞周期逮捕效率。

D7F7抗体表现出对免疫沉淀蛋白激酶RNA激活的优越能力。西方对PKR免疫沉淀或总 HeLa lysate 的印迹分析仅显示一个与 PKR 大小对应的强带，表明 D7F7 抗体在识别 PKR 时具有高度特异性。使用不同的PKR抗体具有不同的免疫沉淀效率，导致不同的分类分布的地图测序读取。

成功去除RRNA后，观察到PKR共免疫沉淀RNase的放射性同位素信号减少。PKR共免疫沉淀的RNA样本，与阴性对等对等相比，表现出线粒体RNase的强富集。斯特兰德特异性逆转录用于区分重链和轻链线粒体RNase，这些线粒体与PKR共同免疫，用于S或M相逮捕细胞。

准备细胞周期逮捕样本最关键的一步是，您必须用 PBS 清洗细胞两次，并且必须只收集细胞柔和的均性或会受损的样本。对于道德流程，最关键的步骤是甲醛交联和数量。此过程之后，可以使用北印迹、qRT PCR 或高通量排序分析洗代的 RNA。

这些实验可以识别绑定到 PKR 的 RNase 的类型和相对量。该技术可用于研究和识别RNA结合蛋白的RNA相互作用器，这将增进我们对RNA结合蛋白的转录后调控的理解。甲醛是危险的，因此需要谨慎处理固定、溶液和初始洗涤缓冲液。