Name: 重组呼吸道合胞病毒的生成、扩增和滴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学习利用BSR-T7/5细胞转染和空斑实验技术生成、扩增重组呼吸道合胞病毒并进行滴定的方法。该技术可用于实时分析病毒包涵体动态，为疫苗研发提供重要工具。

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作者感谢阿斯利康（AstraZeneca）的秦宇博士&amp;感谢美国马萨诸塞州波士顿市的 #38;D 公司提供 AZD4316 药物。作者感谢 Cymages 平台提供 ScanR Olympus 显微镜的使用权限，该设备获得了法兰西岛大区（DIM ONE HEALTH）资助项目的经费支持。作者同时感谢法国国家健康与医学研究院（INSERM）和凡尔赛-圣康坦大学的支持。

1. 材料准备
<ol>
	<li>购买细胞培养基（减血清培养基、最低必需培养基 [MEM]、10x MEM 以及 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 [DMEM]）、转染试剂和微晶纤维素（参见材料表）。</li>
	<li>获取用于反向遗传学的以下载体：基因组载体和编码 N 蛋白及聚合酶复合物蛋白的表达载体。基因组载体包含位于噬菌体 T7 RNA 聚合酶（T7 pol）启动子下游的 RSV-GFP（p-RSV-GFP）和 RSV-M2-1GFP（p-RSV-M2-1GFP）的全长 cDNA 基因组。表达载体（命名为 p-N、p-P、p-L 和 p-M2-1）包含 N、P、L 或 M2-1 编码序列，位于 T7 pol 启动子下游（有关质粒构建的详细信息，请参见 Rincheval 等12 和 Rameix-Welti 等21）。</li>
	<li>在无菌环境中配制用于细胞培养、转染和感染的培养基。使用添加了 10% 胎牛血清（FCS）、1,000 单位/mL 青霉素和 1 mg/mL 链霉素（或不含抗生素）的 DMEM，并补充 2 mM L-谷氨酰胺；以及添加了 0%、2% 或 10% FCS、1,000 单位/mL 青霉素和 1 mg/mL 链霉素的 MEM，并补充 2 mM L-谷氨酰胺，后者在后续实验方案中称为“完全培养基”。</li>
	<li>获取 BSRT7/522 细胞，并用含 10% 二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基以每毫升 1 至 2 × 106 个细胞的密度制备细胞冻存液。将细胞冻存于液氮中。获取 HEp-2 细胞。在无菌条件下，于 37 °C 和 5% CO2 环境中，使用完全 DMEM 培养 BSRT7/5 细胞，使用完全 MEM 培养 HEp-2 细胞。</li>
	<li>在无菌环境中配制 10 倍浓度的 RSV 保存液（含 0.5 M HEPES 和 1 M MgSO4 [pH 7.5] 的水溶液）。</li>
	<li>准备一台适用于 GFP 荧光检测的倒置荧光显微镜，若需监测感染过程，则应具备活细胞成像功能。同时准备一台适用于 GFP 荧光检测的微孔板读数仪，用于定量检测 RSV-GFP 的复制水平。</li>
</ol>
2. 重组病毒的拯救与初次传代
注意：所有以下步骤均须在无菌环境中使用II级生物安全柜进行。
<ol>
	<li>转染前一天，将BSRT7/5细胞系以5 × 105 个细胞/mL的浓度悬浮于完全培养基中。每孔加入2 mL细胞悬液至6孔板中。为每种待拯救的病毒准备一孔，并额外设置一孔作为阴性对照。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下培养。次日观察细胞融合度，应达到80%–90%。</li>
	<li>解冻反向遗传学载体（步骤1.2中制备的）p-RSV-GFP和p-RSV-M2-1-GFP，以及p-N、p-P、p-L和p-M2-1。为每种待拯救的病毒，在离心管中混合1 µg p-N和p-P、0.5 µg p-L、0.25 µg p-M2-1，以及1.25 µg p-RSV（GFP或M2-1 GFP）。 
	注意：可使用不同的N、P、L和M2-1表达载体；但各蛋白之间的比例必须保持不变。通过将p-RSV载体替换为空载体来进行阴性对照实验。</li>
	<li>按照转染试剂生产商提供的操作说明进行转染（参见材料表）。
	<ol>
		<li>向混合好的载体中加入250 µL低血清培养基。在另一离心管中，将10 µL转染试剂稀释于250 µL低血清培养基中。轻轻涡旋两管，静置5分钟。将两管内容物混合，室温下孵育20分钟。</li>
		<li>用1 mL低血清培养基冲洗BSRT7/5细胞，每孔加入1.5 mL含10% FCS但不含抗生素的MEM培养基。如有需要，将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中，直至步骤2.3.1中的孵育完成。</li>
		<li>20分钟孵育结束后，将步骤2.3.1中制备的500 µL转染混合物加入一孔细胞中。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养3天。转染期间不更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天一次，在倒置荧光显微镜下使用GFP滤光片、20倍物镜观察GFP荧光（激发波长488 nm，发射波长515–535 nm），以监测病毒拯救效率。</li>
	<li>转染后第二天，为拯救的病毒进行首次传代接种细胞。将HEp-2细胞以5 × 105 个细胞/mL的浓度悬浮于完全培养基中。每孔加入2 mL细胞悬液至6孔板中（每种待拯救病毒对应一孔，另设一阴性对照孔）。</li>
	<li>转染第三天，使用不同的细胞刮匙分别刮取转染后的BSRT7/5细胞6孔板中各孔的细胞。将每孔的内容物（细胞和上清液）转移至无菌的2 mL微量离心管中。剧烈涡旋每管至少30秒，以释放细胞膜上的拯救病毒。 
	注意：此步骤对应拯救病毒的第0代（P0）（图1）。</li>
	<li>使用新鲜制备的P0病毒悬液对拯救病毒进行首次扩增。
	<ol>
		<li>移除前一天接种的HEp-2细胞6孔板中的培养基，迅速向每孔加入500 µL P0病毒悬液（来自步骤2.6）。将HEp-2细胞板置于37 °C摇床上轻柔振荡2小时。</li>
		<li>移除并弃去500 µL接种液，每孔加入2 mL含2% FCS的MEM培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下培养3天。此过程将获得拯救病毒的第一代（P1）（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向剩余的P0病毒悬液（来自步骤2.6）中加入其体积1/10的10倍浓缩RSV保存液（0.5 M HEPES和1 M MgSO4，pH 7.5）。剧烈涡旋微量离心管5秒，将溶液分装至带有耐酒精标签的冻存管中。将冻存管浸入预冷至-80 °C的酒精中至少1小时，随后于-80 °C保存。</li>
	<li>对每种拯救病毒的P0代病毒储备液（见步骤2.6）进行滴度测定（参见第4节关于微晶纤维素滴定法）。</li>
	<li>每天一次，在倒置荧光显微镜下使用20倍物镜观察经P0病毒悬液感染的HEp-2细胞的GFP荧光（激发波长488 nm，发射波长515–535 nm），以监测感染情况。同时在明场显微镜下观察小合胞体形成及细胞脱落现象，这些是呼吸道合胞病毒（RSV）致细胞病变效应（CPE）的表现（参见图2）。</li>
	<li>若在2–3天后仍未观察到荧光信号或细胞病变效应，则表明病毒拯救失败。</li>
	<li>在第3或第4天按照步骤2.6所述方法收集第一代病毒（P1）。简要步骤为：刮取细胞，收集细胞与上清液，涡旋混匀，按步骤2.8所述加入保存液，分装样品并冷冻保存。</li>
	<li>对第一代病毒（P1）进行滴度测定（参见第4节滴定实验）和扩增（参见第3节扩增方法）。</li>
</ol>
3. 重组病毒的扩增
注意：以下方案描述了在75 cm2培养瓶中扩增拯救病毒的步骤。请根据所需体积和感染复数（MOI）调整培养瓶的规格。表1列出了不同规格培养瓶对应的体积。所有步骤均须在II级生物安全柜内的无菌环境中进行。
<ol>
	<li>在扩增前一天，将 HEp-2 细胞用完全培养基配制成浓度为 5 × 105 个细胞/mL 的细胞悬液。每只 75 cm2 培养瓶中加入 15 mL 细胞悬液，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。每种待扩增病毒准备一瓶。</li>
	<li>培养开始后的第二天，检查细胞融合度是否达到 80%–100%。</li>
	<li>将步骤 2.12 中的病毒悬液用不含 FCS 的 MEM 稀释，配制成 3 mL、浓度为 50,000 PFU/mL 的病毒悬液（相当于 MOI 为 0.01 PFU/细胞）。</li>
	<li>吸去培养基，迅速加入 3 mL 病毒悬液。将培养瓶置于 37 °C 摇床（往复式）上轻柔振荡 2 小时。</li>
	<li>移除并弃去接种液，加入 15 mL 含 2% FCS 的 MEM。于 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 2–4 天。</li>
	<li>在倒置荧光显微镜下以 20 倍物镜观察细胞形态及 GFP 荧光（激发波长 488 nm，发射波长 515–535 nm），以判断最佳收获病毒时间。通常在感染后 48 至 72 小时（p.i.），由于 RSV 引起的细胞病变效应（CPE），HEp-2 细胞层中有 50%–80% 细胞脱落时即为适宜时机（见 图 3）。</li>
	<li>用细胞刮刮下所有细胞，收集细胞与上清液一并转移至 50 mL 离心管中。</li>
	<li>加入相当于总体积 1/10 的 10× RSV 保存液（0.5 M HEPES 和 1 M MgSO4，pH 7.5）。剧烈涡旋振荡 5 秒，然后在 200 × g 条件下离心 5 分钟以澄清悬液。</li>
	<li>将上清液转移至另一 50 mL 离心管中，短暂涡旋混匀后分装至带有耐酒精标签的冻存管中。将冻存管浸入预冷至 -80 °C 的酒精中至少 1 小时，随后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>取其中一份样品解冻，用于测定病毒悬液滴度（见第 4 节）。</li>
</ol>
4. 空斑滴定实验
<ol>
	<li>在进行滴定实验的前一天准备12孔板（每管病毒滴定需要六个孔）。在完全培养基中，每孔接种1 mL HEp-2细胞，细胞密度为5 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>次日，在无菌条件下制备微晶纤维素悬浮液（2.4% [w/v] 水溶液）（参见材料表）。
	<ol>
		<li>使用标准磁力搅拌器将2.4 g微晶纤维素粉末分散于100 mL蒸馏水中，持续搅拌至粉末完全溶解（通常需4–12小时）。将悬浮液在121 °C下高压灭菌20分钟，使用前于室温保存。 
		注意：在此条件下，悬浮液可稳定保存1年。</li>
		<li>溶液在无菌环境中开启后，应于4 °C保存6个月。每次使用前务必充分混匀悬浮液（手动振荡或涡旋），以确保其均匀性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌条件下制备2倍浓度的MEM培养基。将商品化的10倍浓缩MEM用无菌水稀释，并加入L-谷氨酰胺、1,000单位/mL青霉素和1 mg/mL链霉素。剧烈振荡混匀后，于4 °C保存。 
	注意：步骤4.4–4.10应在II级生物安全柜中无菌操作进行。</li>
	<li>为每种待滴定的病毒准备六支试管，每管加入900 µL不含FCS的MEM培养基（滴定管）。将病毒分装样品解冻，剧烈涡旋5秒，取100 µL加入第一支滴定管中。</li>
	<li>进行6次十倍系列稀释，操作如下：在第一管中加入100 μL病毒液至900 μL培养基中，盖上管盖，涡旋数秒混匀。更换移液器吸头，取100 µL第一管稀释液加入第二管900 μL培养基中，盖上管盖并涡旋混匀。重复此操作至第六管。 
	注意：每次稀释必须更换吸头。</li>
	<li>在HEp-2 12孔板上标记病毒名称及稀释倍数。在板与盖上做对应标记，以防染色过程中（步骤4.9）盖子错配。吸除孔内培养基，每孔加入400 µL一种稀释液。将板置于37 °C孵育2小时，使病毒吸附。 
	注意：每次接种之间应更换移液器吸头，或使用同一吸头从最低浓度向最高浓度依次接种。同时接种的板数应控制在1至2块，以避免细胞干燥。</li>
	<li>在病毒吸附期间现配微晶纤维素覆盖层。为获得100 mL覆盖液，混合10 mL 2.4%微晶纤维素悬浮液、10 mL 2倍浓度MEM和80 mL含2% FCS的MEM。
	<ol>
		<li>根据颜色指示，用7.5%无菌碳酸氢钠溶液将2倍浓度MEM的pH调节至约7.2。加入微晶纤维素悬浮液和MEM，剧烈混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2小时孵育结束后，无需去除接种液，直接向12孔板每孔加入2至3 mL覆盖液。操作时需小心，避免高病毒滴度的接种液污染邻近孔。将板置于37 °C、5% CO2条件下孵育6天。孵育期间不得移动培养板或培养箱。</li>
	<li>使用结晶紫染色液（8%结晶紫 [v/v]、2%甲醛 [v/v] 和20%乙醇 [v/v] 溶于水）对细胞进行染色。
	<ol>
		<li>在生物安全柜工作台面铺上防护垫（结晶紫会强烈染色台面）。</li>
		<li>轻轻振荡板子以去除微晶纤维素覆盖层。吸除上清液，用1倍磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。每次处理一块板，避免细胞干燥。每孔加入1–2 mL结晶紫染色液，静置10–15分钟。吸除染色液，该溶液可重复用于后续板的染色。</li>
		<li>将板和盖浸入新鲜漂白液中数秒，然后用自来水彻底冲洗。注意：漂白液可对板和盖进行去污处理。</li>
		<li>将板和盖置于纸巾上晾干。自来水冲洗后于室温下干燥，并在室温保存。长期储存（数月）时，应避光保存以保护染色颜色。注意：若细胞染色褪色，可再次用结晶紫染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算病毒滴度。在干燥的板上直接肉眼计数各孔中的空斑数。检查不同稀释度下的空斑数是否符合预期（每级稀释间相差约10倍）。选择空斑最易计数的孔，根据接种体积和稀释倍数计算病毒滴度。 
	注意：如图4所示示例，在10-5稀释度下计数到21个空斑。对应的病毒滴度为 
	<img alt="病毒滴度计算公式；方程；空斑数除以稀释倍数乘以接种体积。" src="/files/ftp_upload/59218/59218eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程"> 
	<img alt="病毒学实验中PFU/mL计算方程，展示病毒滴度测定方法。" src="/files/ftp_upload/59218/59218eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程"></li>
</ol>
5. 利用HRSV-GFP重组病毒监测经小干扰RNA或抗病毒药物处理细胞中的病毒复制
注意：除步骤 5.1 和 5.2.5 外，所有步骤均须在 II 级生物安全柜内的无菌环境中进行。
<ol>
	<li>监测细胞基因沉默对呼吸道合胞病毒增殖的影响 
	注意：转染方案取决于所用试剂（参见材料表）。
	<ol>
		<li>为GFP检测准备96孔板。在实验开始前两天，针对特定的小干扰RNA（siRNA），配制含100 nM siRNA和1/500稀释度siRNA转染试剂的低血清培养基溶液。室温孵育该溶液30分钟。</li>
		<li>将25 µL上述溶液加入步骤5.1.1中准备好的96孔板的各孔中（每组设三个复孔）。每孔接种75 µL完全培养基（不含抗生素）中浓度为4 × 105 个细胞/mL的A549细胞悬液，使最终细胞浓度达到3 × 105 个细胞/mL。37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。 
		注意：siRNA的最终浓度为25 nM，转染试剂的最终体积为0.5 µL/孔。</li>
		<li>按如下步骤感染细胞：吸除各孔中的培养基，加入100 µL浓度为50,000 PFU/mL的RSV-GFP病毒悬液，37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。移除病毒悬液后，每孔加入100 µL不含酚红的含2% FCS的DMEM培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下继续孵育。</li>
		<li>感染后24小时和48小时，使用激发波长488 nm、发射波长520 nm的荧光分光光度计测定荧光强度（荧光值以相对荧光单位表示）。以未感染的A549细胞作为荧光和背景水平的对照标准。 
		注意：在无盖板条件下检测前，需用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用RSV-GFP评估药物抑制效果
	<ol>
		<li>为GFP检测准备96孔板。在实验前一天，每孔加入100 µL不含酚红的完全培养基中浓度为5 × 105 个细胞/mL的HEp-2细胞悬液。</li>
		<li>在补充有2% FCS和抗生素的MEM培养基中对测试药物（本例为AZ4316）进行系列稀释（每孔50 µL）。同时，在不含基质血管组分（SVF）且不含酚红的MEM培养基中配制浓度为10,000 PFU/mL的病毒悬液（每孔50 µL）。</li>
		<li>吸除96孔板中的HEp-2细胞培养基，每孔加入50 µL药物稀释液和50 µL病毒悬液（每组设三个复孔）。同时平行设置模拟感染对照组。 
		注意：药物稀释液与病毒悬液可在加入细胞前预先混合，也可依次加入。</li>
		<li>37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
		<li>按照步骤5.1.4所述方法，使用荧光分光光度计测定荧光强度。以模拟感染的HEp-2细胞作为荧光背景水平的对照标准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 利用 RSV-M2-1-GFP 重组病毒对 M2-1 蛋白在体内的定位进行表征
注意：请在无菌环境中使用II级生物安全柜进行步骤6.1和6.2操作。
<ol>
	<li>用完全培养基制备浓度为 5 × 105 个细胞/mL 的 HEp-2 细胞悬液。取 1.5 mL 细胞悬液接种于适合 CO2 透过且适用于活细胞成像的 35 mm 培养皿中。</li>
	<li>接种后次日，按步骤 3.3–3.5 所述方法，以 MOI 为 1 的 RSV-M2-1-GFP 病毒进行感染（吸除培养基，加入 500 µL 至 1 mL 接种物，于 37 °C 轻柔振荡孵育 2 h；随后吸除接种物，加入 1.5 mL 含 2% FCS 的 MEM 培养基）。将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育至所需时间（感染后约 10 h 可见包涵体形成）。</li>
	<li>在将含有感染细胞的培养皿置于载物台前，预先将配备 40x 至 100x 物镜的倒置显微镜的培养腔加热至 37 °C。打开 CO2 供气，等待焦点稳定。</li>
	<li>使用与 GFP 兼容的滤光片，在低激发强度和低成像频率（每分钟 1 至 0.1 帧）下进行成像，以最大限度减少光毒性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用五个质粒拯救重组呼吸道合胞病毒（RSV）并进行扩增的方法。对病毒基因组进行操控的能力已彻底改变了病毒学研究，使得研究人员能够检测突变、表达额外基因或带有标签的病毒蛋白。本文描述并用作示例的RSV是一种表达报告基因的病毒，即RSV-GFP（未发表），其表达的M2-1蛋白与GFP标签融合12。RSV的拯救具有挑战性，需要反复实践。转染效率至关重要，取决于转染试剂的合理选择以及转染方案的预先优化。必须使用表达噬菌体T7 RNA聚合酶（T7 pol）的细胞，因为在大多数反向遗传学载体中，病毒cDNA位于T7 pol启动子的下游。另一种方法是通过痘苗病毒辅助病毒来表达T7 pol。然而，使用稳定表达T7 pol的细胞可避免分离两种病毒的需要，并防止痘苗病毒对RSV拯救过程可能产生的干扰。在进行反向遗传学操作的首次传代（P0至P1）时，应避免冻存接种物，以确保最高的拯救效率。这意味着感染复数（MOI）无法精确控制。但在该阶段，病毒滴度仍然非常低，因此首次传代的实际MOI较低。为了获得高感染性滴度（106–107 PFU/mL）的RSV储备液...

人呼吸道合胞病毒（RSV）是全球婴幼儿因急性呼吸道感染而住院的首要原因1。此外，RSV在成人中引起的疾病负担与流感相当，其中大部分住院和死亡病例集中在老年人群2。目前尚无针对RSV的疫苗或特异性抗病毒药物，但已有多种前景良好的新药正在研发中3,4。尽管当前已投入大量努力，但RSV增殖定量技术的复杂性和高操作难度仍严重阻碍了抗病毒药物和疫苗的开发。体外定量RSV增殖通常依赖于耗时、费力且昂贵的方法，主要包括显微镜下观察细胞病变效应、免疫染色、空斑减少实验、定量逆转录（qRT）-聚合酶链式反应（PCR）以及酶联免疫吸附测定。携带经修饰基因组并表达报告基因（如编码绿色荧光蛋白GFP的基因）的病毒更适用于此类筛选。结合自动化酶标仪的使用，携带报告基因的重组病毒可使这些检测方法更易于标准化，并适用于高通量筛选。
呼吸道合胞病毒（RSV）是一种有包膜的、非分段的负链RNA病毒，属于Mononegavirales目下的Pneumoviridae科Orthopneumovirus属5。RSV基因组为约15 kb的单链负义RNA，其3'和5'末端分别含有称为Leader和Trailer的非编码区，并包含10个转录单元，编码11种蛋白质。这些基因的排列顺序如下：3'-NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2（编码M2-1和M2-2蛋白）和L-5'。基因组RNA被核蛋白N紧密包裹。以该包裹后的基因组RNA为模板，病毒依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）负责病毒RNA的转录与复制。病毒RdRp由大蛋白L（具有核苷酸聚合酶活性）、其必需的辅因子磷酸化蛋白P以及作为病毒转录因子发挥作用的M2-1蛋白共同组成6。在感染细胞中，RSV可诱导形成称为包涵体（inclusion bodies, IBs）的胞质内包涵结构。Mononegavirales目中多种病毒也被观察到形态相似的胞质内包涵结构7,8,9,10。近期对狂犬病病毒、水疱性口炎病毒（VSV）、埃博拉病毒和RSV的研究表明，病毒RNA的合成发生在包涵体内，因此包涵体可被视为病毒工厂8,9,11,12。这些病毒工厂集中了病毒RNA合成所需的RNA和病毒蛋白，同时也包含多种宿主细胞蛋白13,14,15,16,17。包涵体内存在一种功能性的亚结构，称为包涵体相关颗粒（IB-associated granules, IBAGs），其内富集了新合成的病毒mRNA以及M2-1蛋白，而基因组RNA及L、P和N蛋白则不在IBAGs中被检测到。IBAGs是位于包涵体内部的小型动态球状结构，具有液态细胞器的特性12。尽管包涵体在病毒增殖过程中发挥核心作用，但目前对其本质、内部结构、形成机制及功能运作仍知之甚少。
1981年，通过cDNA表达脊髓灰质炎病毒基因组，实现了首个具有感染性病毒克隆的构建18。对于单股负链RNA病毒，直到1994年才首次实现将质粒转染入细胞后产生狂犬病病毒19。基于质粒的呼吸道合胞病毒（RSV）反向遗传学系统的首次报道发表于1995年20。反向遗传学技术推动了病毒学领域的重大进展。通过对病毒基因组引入特定修饰，研究人员得以深入理解RNA病毒的复制机制和致病过程。该技术还通过靶向性的系列修饰实现病毒的特异性减毒，从而极大促进了疫苗的研发。此外，通过基因组改造实现病毒增殖的快速定量，显著提升了抗病毒药物的筛选效率及其作用机制的研究水平。
尽管此前已有描述，获得基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）仍然十分困难。本文详细阐述了一种用于构建两种表达 RSV-GFP 或 RSV-M2-1-GFP 的重组人呼吸道合胞病毒（HRSV）的实验方案。本方案中，我们描述了拯救新型重组病毒所需的转染条件，以及扩增病毒以获得高滴度病毒储备液的方法，适用于可重复的实验研究。反向遗传学载体本身的构建未在本文中介绍。我们详细说明了病毒储备液的最佳收获与冷冻保存方法。目前最准确的病毒感染性颗粒定量方法仍是空斑实验。将细胞接种于待测悬液的系列稀释液中，并覆盖一层阻止上清液中游离病毒颗粒扩散的覆盖物。在此条件下，病毒仅能感染邻近细胞，每个初始感染性颗粒形成一个&#34;空斑&#34;。在传统的 RSV 滴定实验中，空斑通过免疫染色显色，并在显微镜下计数。该方法成本高且耗时。本文介绍了一种使用微晶纤维素覆盖层的极为简便的 RSV 空斑实验方案，可使形成的空斑肉眼可见。我们展示了如何利用 RSV-GFP 检测 RSV 的复制过程，从而量化抗病毒药物的作用效果。结合反向遗传学与活细胞成像技术，我们证明了 RSV-M2-1-GFP 可使科研人员在活细胞中可视化 M2-1 蛋白，并追踪细胞内病毒结构（如包涵体 IBs）的动态变化。

<table><tbody><tr><td>35 mm &amp;micro; 用于活细胞成像的培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Avicel RC-591</td><td>FMC BioPolymer</td><td>Avicel RC-591</td><td>Avicel 的技术及其他相关信息请访问 http://www.fmcbiopolymer.com。于室温下保存。步骤 4 中的方案已针对此试剂优化。</td></tr><tr><td>BSRT7/5</td><td></td><td>非商业供应</td><td>参见参考文献 &lt;sup&gt;22&lt;/sup&gt;. Buchholz 等，1999</td></tr><tr><td>结晶紫溶液</td><td>Sigma</td><td>HT90132</td><td></td></tr><tr><td>用于观察的荧光显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>IX73 Olympus 显微镜</td><td></td></tr><tr><td>用于视频显微成像的荧光显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>ScanR 奥林巴斯显微镜</td><td></td></tr><tr><td>HEp-2</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-23</td><td></td></tr><tr><td>HEPES &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIPOFECTAMINE 2000 试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11668019</td><td>第2.3步中的方案已针对该试剂进行了优化。</td></tr><tr><td>MEM（10倍浓度），不含谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>MEM，GlutaMAX 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>41090-028</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 ReagentPlus, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>32% 甲醛水溶液，电子显微镜级</td><td>电子显微镜科学</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>质粒</td><td></td><td>非商业供应</td><td>参见参考文献 &lt;sup&gt;21&lt;/sup&gt;. Rameix-Welti 等，2014</td></tr><tr><td>见锯式摇床</td><td>VWR</td><td>444-0341</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>ON-TARGETplus siRNA&lt;br/&gt; D-001810-10-05</td><td>Dharmacon 设计的 SMARTpool 及 4 种中的 3 种单独 siRNA</td></tr><tr><td>siRNA IMPDH2</td><td>Dharmacon</td><td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 池-人类&lt;br/&gt; L-004330-00-0005</td><td>Dharmacon 设计的 4 种独立 siRNA 的 SMARTpool&lt;br/&gt; 独立参考文献与序列&lt;br/&gt; J-004330-06：GGAAAGUUGCCCAUUGUAA&lt;br/&gt; J-004330-07：GCACGGCGCUUUGGUGUUC；&lt;br/&gt; J-004330-08：AAGGGUCAAUCCACAAAUU&lt;br/&gt; J-004330-09：GGUAUGGGUUCUCUCGAUG；</td></tr><tr><td>siRNA RSV N</td><td>Dharmacon</td><td>ON-TARGETplus 定制化 siRNA</td><td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU 和 UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td></tr><tr><td>siRNA NT</td><td>Dharmacon</td><td>ON-TARGETplus 非靶向对照池</td><td></td></tr><tr><td>siRNA 转染试剂</td><td>Dharmacon</td><td>DharmaFECT 1 货号：T-2001-03</td><td>第5.1步和5.1.2步中的方案已针对该试剂进行了优化。</td></tr><tr><td>7.5% 碳酸氢钠溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Tecan</td><td>Tecan infinite M200PRO</td><td></td></tr></tbody></table>

重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

重组病毒的使用在基础或应用病毒学研究中已变得至关重要。反向遗传学已被证明是一种极为强大的技术，既可用于解析病毒复制机制，也可用于抗病毒药物研究或疫苗开发平台的构建。然而，针对呼吸道合胞病毒（RSV）等负链RNA病毒构建和操作反向遗传系统仍然较为复杂，需要特殊的技术经验。RSV基因组为单链负义RNA，长度约为15 kb，可作为病毒RNA复制和转录的模板。我们的反向遗传系统采用人呼吸道合胞病毒长株（HRSV）基因组的cDNA拷贝。该cDNA以及编码聚合酶复合物病毒蛋白（L、P、N和M2-1）的cDNA均被插入独立的表达载体中，并置于T7聚合酶调控序列的控制之下。将这些元件转染至稳定表达T7聚合酶的BSR-T7/5细胞中，可实现重组RSV在细胞质内的复制和转录，从而产生基因修饰的病毒颗粒。新生成的RSV存在于BSR-T7/5细胞表面及其培养上清液中，收集后用于感染人HEp-2细胞以进行病毒扩增。通常需要经过两到三轮扩增，才能获得滴度为1 × 106 至 1 × 107 空斑形成单位（PFU）/mL的病毒储备液。本文详细描述了病毒储备液的最佳收获、冷冻保存及滴定方法。我们通过构建两种分别表达游离绿色荧光蛋白（GFP）（RSV-GFP）或GFP融合病毒M2-1蛋白（RSV-M2-1-GFP）的重组病毒，来演示本方案的应用。我们展示了如何利用RSV-GFP定量检测RSV的复制水平，以及如何通过视频显微技术利用RSV-M2-1-GFP在活细胞中可视化病毒结构和病毒蛋白的动态行为。

本研究中，我们描述了一种产生表达荧光蛋白的重组呼吸道合胞病毒（RSV）的详细方案（图2）。在pRSV-GFP载体中，GFP基因被插入P基因与M基因之间，其位置与先前发表的研究中Cherry基因的插入方式一致21。在pRSV-M2-1-GFP载体中，M2基因保持不变，而额外的编码M2-1-GFP的基因被插入SH基因与G基因之间12。第一步为在BSRT7/5细胞中拯救病毒，如图2A所示。转染后72小时，在对应于RSV-GFP和RSV-M2-1-GFP拯救的孔中可见少量绿色荧光细胞簇。在RSV-GFP感染的细胞中，荧光信号可同时出现在细胞质和细胞核中，反映了游离GFP的表达。相比之下，在RSV-M2-1-GFP拯救中，仅可见细胞质内微小的荧光点状结构，对应于M2-1-GFP在包涵体（IBs）中的聚集。通常在此阶段未观察到明显的细胞病变效应（CPE，如合胞体或脱落细胞...

我们介绍了一种用于产生和扩增基因修饰的呼吸道合胞病毒（RSV）的方法，以及一种优化的RSV蚀斑检测法。我们通过构建两种重组病毒来演示该方案，这两种病毒分别可用于定量检测RSV的复制以及活体分析RSV包涵体及其相关颗粒的动态过程。

重组病毒的使用在基础或应用病毒学中已变得至关重要。反向遗传学已被证明是一种极为强大的技术，……

利用重组病毒是一种强大的技术，既可用于解析病毒复制机制，也可为疫苗开发提供平台。同样，制备高质量的病毒储备液对于从基础研究到应用研究的每一项病毒学研究都至关重要。重组病毒的拯救、最佳收获、冷冻以及呼吸道合胞病毒（RSV）储备液的滴定，是所有病毒学研究中的关键方法。这些方法虽被视为传统技术，但仍较为精细，需要特定的专业技能。 转染前一天，将 BSR-T7/5 细胞悬浮于完全培养基中，浓度为每毫升 0.5 × 10⁶ 个细胞。在六孔板中每孔加入 2 毫升细胞悬液。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，直至次日细胞融合度达到 80–90%。为拯救每种病毒，首先在离心管中混合解冻的反向遗传学载体，然后按照转染试剂生产商的说明书进行转染。接着向混合后的载体中加入 250 µL 低血清培养基。在另一管中，将10微升转染试剂加入250微升低血清培养基中稀释。轻轻涡旋振荡两管，室温静置5分钟。混合两管中的内容物，室温下静置20分钟。同时，用一毫升低血清培养基冲洗 BSR-T7/5 细胞，并在每孔中加入 1.5 毫升添加了 10% 胎牛血清的无抗生素最低必需培养基。如有需要，置于 37°C、5% 二氧化碳环境中孵育。20 分钟孵育后，向每孔中加入 500 微升转染混合物。将细胞在 37°C、5% 二氧化碳环境中孵育三天。为监测拯救效率，每天在倒置荧光显微镜下以 20 倍放大观察 GFP 荧光。 转染后的第三天，在转染的BSR-T7/5六孔板的每个孔中划痕细胞。将每个孔的细胞和上清液转移至无菌的2毫升微量离心管中。为使拯救出的病毒从细胞膜上释放，需用力涡旋振荡每根试管至少30秒。对于拯救病毒的首次扩增，首先移除前一天接种的HEp-2细胞培养板中的培养基，然后迅速向每孔加入500微升新鲜的第零代病毒悬液。将HEp-2培养板置于37摄氏度的摇摆摇床中，轻柔振荡孵育2小时。为了获得拯救病毒的第一代病毒液，弃去500微升接种物，加入2毫升含2%胎牛血清的MEM培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育3天。每天在20倍放大倍数的倒置荧光显微镜下观察感染了第0代病毒悬液的HEp-2细胞的绿色荧光蛋白（GFP）荧光，以监测感染情况。在明场显微镜下观察到小型合胞体形成及细胞脱落现象，这反映了呼吸道合胞病毒（RSV）的细胞病变效应。 为了扩增拯救的病毒，首先将无FCS的MEM中的病毒悬液稀释，制备成每毫升含50,000 PFU的三毫升病毒悬液，然后吸去HEp-2培养瓶中的培养基。迅速加入三毫升病毒悬液，并将培养瓶置于37摄氏度的摇床上，轻轻摇动孵育两小时。随后吸去并弃除接种液，加入含2% FCS的15毫升MEM。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育两至四天。为了确定收获病毒的最佳时间，应在20倍放大倍数的倒置荧光显微镜下观察细胞形态和GFP荧光。通常在感染后48至72小时，由于呼吸道合胞病毒（RSV）的细胞病变效应，HEp-2细胞层中有50%至80%的细胞脱落时，即为适宜收获时机。接下来，使用细胞刮刀刮下所有细胞。收集细胞和上清液，并一同转移至50毫升离心管中。加入相当于10倍体积的RSV保存液，体积为原液体积的1/10。剧烈涡旋振荡管子5秒，然后在200 × g离心5分钟，以澄清悬液。将上清液转移至50毫升离心管中。短暂涡旋振荡，并将悬液分装至带有耐酒精标签的冻存管中。将冻存管浸入预冷的-80°C酒精中至少1小时，随后于-80°C保存。进行噬斑滴定实验时，首先通过将商品化的10倍浓缩最低必需培养基（MEM）用无菌水稀释，并添加L-谷氨酰胺、每毫升1000单位的青霉素和每毫升1毫克的链霉素，配制2倍浓缩的最低必需培养基（2X MEM）。充分振荡混匀后，于4摄氏度保存。然后，向六个试管中各加入900微升不含胎牛血清（FCS）的MEM。将病毒分装样品解冻，并剧烈涡旋振荡5秒钟。进行连续稀释时，首先在第一支试管中加入100 µL病毒液和900 µL培养基。盖上管盖，通过涡旋振荡数秒以混匀内容物。然后取100 µL第一管的稀释液加入含有900 µL培养基的第二支试管中。盖上管盖并涡旋振荡。重复此操作直至第六支试管。在HEp-2 12孔板上标注病毒名称及完整的稀释倍数。对培养板及其盖子做匹配标记，因为在染色过程中它们可能会被分开。移除培养板中的培养基，每孔加入400微升的一种稀释液。将培养板在37摄氏度孵育两小时，以进行病毒吸附。在病毒吸附期间，通过7.5%无菌碳酸氢钠溶液根据颜色指示剂将2X MEM的pH值调节至约7.2，从而制备微晶纤维素覆盖层。为制备100毫升覆盖层，加入10毫升2×MEM、10毫升2.4%单晶纤维素悬浮液以及80毫升添加了2%FCS的MEM，并充分混匀。两小时孵育结束后，向12孔板的每孔中加入2至3毫升覆盖层，无需移除接种物。将培养板置于含5%二氧化碳的37摄氏度环境中孵育6天。使用结晶紫溶液染色细胞时，首先轻轻摇动培养板以去除微晶纤维素覆盖层。吸除上清液后，用1× PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后加入1至2毫升结晶紫溶液，静置10至15分钟。吸除染色液（可重复用于后续培养板的染色）。最后，通过干燥培养板中可见蚀斑数量与接种液体积及其稀释倍数的比值计算病毒滴度。 对仅转染N、P、L和M2-1表达质粒的阴性对照进行空斑实验，结果显示在最低稀释度下无空斑形成。若病毒拯救效率高，转染细胞获得的滴度预期应高于每毫升100 PFU。随着传代次数增加，滴度上升，在第一或第二代时达到每毫升100万至1000万 PFU。得益于这些荧光病毒，通过靶向病毒N蛋白或宿主细胞蛋白IMPDH的siRNA抑制RSV表达的效果可被直观观察并定量检测。相比之下，在转染非靶向siRNA的对照细胞或转染靶向宿主细胞蛋白GAPDH的siRNA的细胞中，均观察到强烈的GFP信号，并可进行定量测量。同样，这些病毒使得抗病毒药物化合物对 RSV 增殖的抑制作用易于观察。在 HEp-2 感染细胞中追踪荧光蛋白 M2-1 显示，包涵体（IBs）及与 IBs 相关的颗粒是高度动态的结构。IBs 呈可移动的球形结构，能够发生融合，形成更大的球形包涵体。包涵体相关颗粒经历了持续的组装-去组装循环，形成小的包涵体相关颗粒，这些颗粒逐渐生长、融合成大的包涵体相关颗粒，随后消失。利用微晶纤维素覆盖法进行RSV噬斑滴定的方案可轻松适用于其他细胞和/或其他病毒，但需要调整微晶纤维素的浓度。

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