重组呼吸道合胞病毒的制备、扩增与滴定

利用重组病毒是一种强大的技术，既可用于解析病毒复制机制，也可为疫苗开发提供平台。同样，制备高质量的病毒储备液对于从基础研究到应用研究的每一项病毒学研究都至关重要。重组病毒的拯救、最佳收获、冷冻以及呼吸道合胞病毒（RSV）储备液的滴定，是所有病毒学研究中的关键方法。这些方法虽被视为传统技术，但仍较为精细，需要特定的专业技能。

转染前一天，将 BSR-T7/5 细胞悬浮于完全培养基中，浓度为每毫升 0.5 × 10⁶ 个细胞。在六孔板中每孔加入 2 毫升细胞悬液。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，直至次日细胞融合度达到 80–90%。为拯救每种病毒，首先在离心管中混合解冻的反向遗传学载体，然后按照转染试剂生产商的说明书进行转染。接着向混合后的载体中加入 250 µL 低血清培养基。

在另一管中，将10微升转染试剂加入250微升低血清培养基中稀释。轻轻涡旋振荡两管，室温静置5分钟。混合两管中的内容物，室温下静置20分钟。

同时，用一毫升低血清培养基冲洗 BSR-T7/5 细胞，并在每孔中加入 1.5 毫升添加了 10% 胎牛血清的无抗生素最低必需培养基。如有需要，置于 37°C、5% 二氧化碳环境中孵育。20 分钟孵育后，向每孔中加入 500 微升转染混合物。将细胞在 37°C、5% 二氧化碳环境中孵育三天。为监测拯救效率，每天在倒置荧光显微镜下以 20 倍放大观察 GFP 荧光。

转染后的第三天，在转染的BSR-T7/5六孔板的每个孔中划痕细胞。

将每个孔的细胞和上清液转移至无菌的2毫升微量离心管中。为使拯救出的病毒从细胞膜上释放，需用力涡旋振荡每根试管至少30秒。对于拯救病毒的首次扩增，首先移除前一天接种的HEp-2细胞培养板中的培养基，然后迅速向每孔加入500微升新鲜的第零代病毒悬液。将HEp-2培养板置于37摄氏度的摇摆摇床中，轻柔振荡孵育2小时。

为了获得拯救病毒的第一代病毒液，弃去500微升接种物，加入2毫升含2%胎牛血清的MEM培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育3天。每天在20倍放大倍数的倒置荧光显微镜下观察感染了第0代病毒悬液的HEp-2细胞的绿色荧光蛋白（GFP）荧光，以监测感染情况。在明场显微镜下观察到小型合胞体形成及细胞脱落现象，这反映了呼吸道合胞病毒（RSV）的细胞病变效应。

为了扩增拯救的病毒，首先将无FCS的MEM中的病毒悬液稀释，制备成每毫升含50,000 PFU的三毫升病毒悬液，然后吸去HEp-2培养瓶中的培养基。迅速加入三毫升病毒悬液，并将培养瓶置于37摄氏度的摇床上，轻轻摇动孵育两小时。随后吸去并弃除接种液，加入含2% FCS的15毫升MEM。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育两至四天。

为了确定收获病毒的最佳时间，应在20倍放大倍数的倒置荧光显微镜下观察细胞形态和GFP荧光。通常在感染后48至72小时，由于呼吸道合胞病毒（RSV）的细胞病变效应，HEp-2细胞层中有50%至80%的细胞脱落时，即为适宜收获时机。

接下来，使用细胞刮刀刮下所有细胞。收集细胞和上清液，并一同转移至50毫升离心管中。加入相当于10倍体积的RSV保存液，体积为原液体积的1/10。剧烈涡旋振荡管子5秒，然后在200 × g离心5分钟，以澄清悬液。

将上清液转移至50毫升离心管中。短暂涡旋振荡，并将悬液分装至带有耐酒精标签的冻存管中。将冻存管浸入预冷的-80°C酒精中至少1小时，随后于-80°C保存。

进行噬斑滴定实验时，首先通过将商品化的10倍浓缩最低必需培养基（MEM）用无菌水稀释，并添加L-谷氨酰胺、每毫升1000单位的青霉素和每毫升1毫克的链霉素，配制2倍浓缩的最低必需培养基（2X MEM）。充分振荡混匀后，于4摄氏度保存。然后，向六个试管中各加入900微升不含胎牛血清（FCS）的MEM。将病毒分装样品解冻，并剧烈涡旋振荡5秒钟。

进行连续稀释时，首先在第一支试管中加入100 µL病毒液和900 µL培养基。盖上管盖，通过涡旋振荡数秒以混匀内容物。然后取100 µL第一管的稀释液加入含有900 µL培养基的第二支试管中。盖上管盖并涡旋振荡。重复此操作直至第六支试管。在HEp-2 12孔板上标注病毒名称及完整的稀释倍数。对培养板及其盖子做匹配标记，因为在染色过程中它们可能会被分开。

移除培养板中的培养基，每孔加入400微升的一种稀释液。将培养板在37摄氏度孵育两小时，以进行病毒吸附。在病毒吸附期间，通过7.5%无菌碳酸氢钠溶液根据颜色指示剂将2X MEM的pH值调节至约7.2，从而制备微晶纤维素覆盖层。

为制备100毫升覆盖层，加入10毫升2×MEM、10毫升2.4%单晶纤维素悬浮液以及80毫升添加了2%FCS的MEM，并充分混匀。两小时孵育结束后，向12孔板的每孔中加入2至3毫升覆盖层，无需移除接种物。将培养板置于含5%二氧化碳的37摄氏度环境中孵育6天。

使用结晶紫溶液染色细胞时，首先轻轻摇动培养板以去除微晶纤维素覆盖层。吸除上清液后，用1× PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后加入1至2毫升结晶紫溶液，静置10至15分钟。吸除染色液（可重复用于后续培养板的染色）。最后，通过干燥培养板中可见蚀斑数量与接种液体积及其稀释倍数的比值计算病毒滴度。

对仅转染N、P、L和M2-1表达质粒的阴性对照进行空斑实验，结果显示在最低稀释度下无空斑形成。若病毒拯救效率高，转染细胞获得的滴度预期应高于每毫升100 PFU。随着传代次数增加，滴度上升，在第一或第二代时达到每毫升100万至1000万 PFU。得益于这些荧光病毒，通过靶向病毒N蛋白或宿主细胞蛋白IMPDH的siRNA抑制RSV表达的效果可被直观观察并定量检测。相比之下，在转染非靶向siRNA的对照细胞或转染靶向宿主细胞蛋白GAPDH的siRNA的细胞中，均观察到强烈的GFP信号，并可进行定量测量。

同样，这些病毒使得抗病毒药物化合物对 RSV 增殖的抑制作用易于观察。在 HEp-2 感染细胞中追踪荧光蛋白 M2-1 显示，包涵体（IBs）及与 IBs 相关的颗粒是高度动态的结构。IBs 呈可移动的球形结构，能够发生融合，形成更大的球形包涵体。

包涵体相关颗粒经历了持续的组装-去组装循环，形成小的包涵体相关颗粒，这些颗粒逐渐生长、融合成大的包涵体相关颗粒，随后消失。利用微晶纤维素覆盖法进行RSV噬斑滴定的方案可轻松适用于其他细胞和/或其他病毒，但需要调整微晶纤维素的浓度。