Name: 患者衍生的人类泌尿细胞癌和结肠直肠癌肿瘤生长和自发转移的正交异种移植模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 了解患者源性正位异种移植模型在泌尿细胞癌和结肠直肠癌研究中的应用。该方法利用NOD/SCID小鼠观察肿瘤生长和自发转移，为癌症转移机制和新型疗法测试提供临床相关平台。

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作者感谢 Brian Reuter、Danielle Bertoni、Peter Miller 和 Shannon McChesney 为启动这些研究提供的出色技术支持。作者还感谢 Heather Green Matrana、Margaret Variano、Sunil Talwar 和 Maria Latsis 在患者知情同意及提供肿瘤标本方面给予的协助。

本研究所描述的所有动物实验方法均在奥希纳健康系统机构动物护理和使用委员会批准的指南下进行，并遵循动物研究指南。本研究中所有患者的肿瘤样本均按照奥希纳健康系统研究审查委员会以及机构人类实验伦理委员会的伦理标准，从签署知情同意书并接受癌症切除手术的患者中收集。奥希纳健康系统的委员会认证病理学家根据肿瘤细胞的显微特征、组织学类型及分级水平，确定患者标本的病理诊断。
注意：以下方案描述了两种独立的异种移植模型的操作步骤，一种是通过电灼膀胱壁以接种尿路上皮癌细胞（UCC）的UCC模型，另一种是通过直肠内注射结直肠癌细胞（CRC）用于CRC模型研究。两种模型在实验准备与监测的所有步骤均相同，而第7节和第8节则分别具体描述了UCC接种和CRC注射的操作流程。
1. 细胞系培养
<ol>
	<li>在完全 RPMI-1640 培养基中培养 HK 细胞，培养基需添加 10% 胎牛血清、2 nM 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素 G 和 100 mg/mL 链霉素，在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中培养。 
	注：HK 细胞为正常人滤泡树突状细胞，可在体外培养并传代扩增，传代次数不超过 15 代16。</li>
	<li>实验前进行细胞消化。
	<ol>
		<li>吸除培养基，向细胞中加入 2 mL 含 1% 胰蛋白酶的汉克平衡盐溶液（HBSS），将细胞放回 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育 4 分钟。</li>
		<li>使用带 10 mL 血清移液管的手持移液器将细胞从培养皿中收集至 15 mL 离心管中，加入 8 mL 完全 RPMI-1640 培养基。</li>
		<li>取 40 µL 细胞悬液与 40 µL 台盼蓝混合，加入 96 孔板的一个孔中。取 10 µL 混合液滴加至血细胞计数板，计数活细胞。将 100 万细胞接种于 25 mL 完全 RPMI-1640 培养基中，置于 150 mm 无菌组织培养处理皿中继续培养。 
		注：本步骤制备的 HK 细胞悬液必须在 1 小时内使用，用于与肿瘤细胞混合后注射。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 患者样本采集
<ol>
	<li>在切除手术中采集已签署知情同意书的患者15号（BlCaPt15，pT3b N1 M0）和患者37号（BlCaPt37，pT3b pN0 M0）的UCC肿瘤组织。</li>
	<li>在切除手术中采集已签署知情同意书的患者155号（CoCaPt155，T1 N0 M0）和患者302号（CoCaPt302，T1 N0 M0）的CRC肿瘤组织。</li>
</ol>
3. 患者肿瘤的扩增
<ol>
	<li>手术中将肿瘤组织收集于含青霉素G（500 U/mL）和链霉素（500 mg/mL）的冷无菌McCoy’s培养基中。</li>
	<li>将肿瘤直接植入6−8周龄雌性NOD/SCID小鼠的左右侧 flank。
	<ol>
		<li>使用小型手术剪将组织机械剪切成小块（约1 mm3）。</li>
		<li>使用13 G骨髓穿刺活检针将组织皮下植入左右侧 flank。 
		注：植入的总体积为8 mm3，平均分配至两侧 flank。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 荧光素酶标记肿瘤的标记与富集
<ol>
	<li>使用数字卡尺每两周测量一次肿瘤生长情况。</li>
	<li>当肿瘤直径达到 1 cm 时，进行肿瘤转导。使用 1 cc 注射器和 27 G 针头，将 Luc/红色荧光蛋白（RFP）-慢病毒（50 µL/肿瘤，用高滴度浓缩慢病毒原液稀释 1:30）以单次剂量直接注射入肿瘤中。 
	注意：患者来源的肿瘤通常在 1−2 个月内达到 1 cm 直径。然而，其生长速率差异极大，受多种因素影响，包括肿瘤分级和类型。</li>
	<li>通过活体动物生物发光成像（BLI）每周监测肿瘤。
	<ol>
		<li>称量小鼠体重。对清醒小鼠以 150 mg/kg 剂量腹腔注射荧光素，并等待 5 分钟使底物在小鼠体内循环分布。</li>
		<li>在诱导室中使用 100% 氧气（流速 1 L/min）含 2.5% 异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>将小鼠俯卧置于带有持续异氟烷供应的 BLI 成像仪中进行成像。采集连续图像以确认 Luc/RFP 阳性肿瘤区域的存在（伪彩生物发光图像）。成像完成后将小鼠放回笼中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 选择适合酶消化的肿瘤组织部分
<ol>
	<li>在进行UCC或CRC实验的当天，按照步骤4.3.1−4.3.3对携带荧光素酶标记肿瘤的小鼠进行成像。 
	注意：皮下肿瘤的生长时间取决于肿瘤生长速度以及实验中计划接种的动物数量。</li>
	<li>从小鼠侧 flank 处收获肿瘤并进行成像。
	<ol>
		<li>成像后通过吸入 CO2 处死小鼠。将小鼠放入 CO2 室，以 1.4 L/min 的流速通入气体直至呼吸停止，并持续通气 3 分钟，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>用 70% 乙醇清洁皮肤。在肿瘤正上方挑起皮肤，使用手术剪做一小切口，再用剪刀将皮肤与肿瘤分离。</li>
		<li>取出肿瘤并置于无菌培养皿中。将整个培养皿放入成像仪中进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌剪刀或手术刀将肿瘤中荧光素酶阴性部分与阳性部分分离，并重新成像。</li>
	<li>重复上述步骤，直至仅剩最强阳性信号的肿瘤组织块。</li>
</ol>
6. 肿瘤的酶消化
<ol>
	<li>在超净台内，使用无菌手术剪将表达荧光素酶的肿瘤组织块（步骤 5.4）剪切成尽可能小的碎片，并放入无菌的 50 mL 锥形离心管中。 
	注意：将肿瘤组织剪切得越细，获得的单个细胞数量越多。</li>
	<li>通过向 40 mL 的 HBSS 中加入 10 mL 胶原酶 IV（1.5 mg/mL）、80 µL 透明质酸酶（20 mg/mL）和 160 µL 脱氧核糖核酸酶 I（0.1 mg/mL）来配制消化液。通过轻柔颠倒混匀溶液。</li>
	<li>将 35−40 mL 消化液加入剪碎的肿瘤组织中。在 37 °C 条件下以持续旋转方式孵育 2 小时。 
	注意：孵育过程中需定期用力振荡离心管，以防止肿瘤组织结块。</li>
	<li>将全部消化液依次通过无菌的 100 µm 细胞滤筛和 40 µm 细胞滤筛过滤，以去除碎片。收集滤过液，弃去残渣。</li>
	<li>加入 20 mL HBSS 洗涤游离细胞，于 329 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 30 mL HBSS 中。</li>
	<li>在 96 孔板的一个孔中混合 10 µL 细胞悬液与 90 µL 台盼蓝溶液。使用血细胞计数板计数活细胞。</li>
	<li>将每只小鼠所需的 1 x 104 至 1 x 106 个肿瘤细胞转移至无菌的 15 mL 锥形离心管中。向同一管中加入步骤 1.2.3 中制备的每只小鼠所需的 3 x 105 个 HK 细胞。 
	注意：若总体积超过 15 mL，应使用无菌的 50 mL 锥形离心管。每次实验应额外多准备若干剂量，以补偿注射器使用过程中的液体损耗。例如，若某组包含 5 只小鼠，则应制备 6 或 7 只小鼠所需的细胞量。</li>
	<li>于 329 x g 离心 5 分钟。通过吸除或移液方式弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 UCC 模型每只小鼠 50 µL 或 CRC 模型每只小鼠 10 µL 的完全 RPMI 培养基中。细胞悬液在使用前需置于冰上保存。</li>
</ol>
7. UCC 小鼠模型
<ol>
	<li>小鼠手术前准备
	<ol>
		<li>取6至8周龄雌性NOD/SCID小鼠。使用脱毛膏去除小鼠背部下部的毛发。将小鼠置于异氟烷诱导麻醉舱中进行麻醉（2.5%异氟烷，100%氧气，流速1 L/min）。</li>
		<li>麻醉后，将小鼠仰卧放置，使其鼻部置于异氟烷鼻罩中，裸露的背部牢固地接触分散电极。 
		注意：若小鼠对脚趾夹捏无反应，则表明其已完全镇静。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血管套管将第6.9步制备的UCC细胞灌注至膀胱图1Aa，Ab).
	<ol>
		<li>设置单极电凝仪，功率调至4 W。用润滑胶润滑一根24 G无菌血管套管针，经雌性小鼠尿道插入。 
		注意：可能会感到轻微阻力。应轻轻向前推进或撤出套管针并重试。切勿强行推进。&#160;若导管插入时发生弯曲，可将无菌导丝（见7.2.2）插入导管至一半深度，以提供支撑。</li>
		<li>完全插入&#160;0.025英寸固定芯直导丝伸出套管针末端1毫米。 
		注意：在操作前需用胶带标记导丝，以指示1 mm的停止点，确保操作一致性。</li>
		<li>将单极针电极接触导丝1秒，以实现对膀胱黏膜的电刺激。</li>
		<li>将新的无菌套管针连接至1 ml鲁尔锁型注射器，从步骤6.9中抽取200 µL收集的细胞。 
		注意：从套管针到注射器至少会损失 100 µL。计算所需细胞悬液体积时，需补偿损失的体积。</li>
		<li>取出小鼠尿道内的导丝和套管针。将连接有细胞悬液注射器的套管针插入尿道。 
		注意：推进操作应比之前更容易。</li>
		<li>向小鼠膀胱内灌注50 µL细胞悬液。拔出套管针前等待数秒，以使细胞附着于膀胱壁。 
		注意：细胞保留在膀胱内并发展为原发性肿瘤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠从异氟烷鼻罩和接地垫上移开。操作后观察小鼠1小时，注意是否有痛苦迹象，如弓背、呼吸困难等。</li>
</ol>
8. 结直肠癌小鼠模型
<ol>
	<li>在诱导室中使用异氟烷（2.5% 溶于100% 氧气，流速1 L/min）麻醉6至8周龄雄性NOD/SCID小鼠。通过脚趾夹捏确认麻醉效果。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧置于解剖显微镜下，确保其鼻部固定于异氟烷鼻罩，并用胶带固定前肢以保持稳定。 
	注意：可使用放大镜代替解剖显微镜。可在尾部基底下方放置一个小物体以改善视野和操作角度，从而抬高肛门。通常将纱布卷成直径约1英寸的圆柱形使用。</li>
	<li>使用弯曲、润滑且钝头的镊子扩张肛管，以暴露远端肛门及直肠黏膜。清除粪便。</li>
	<li>使用连接50 μL玻璃注射器的无菌30 G可拆卸针头，将10 μL肿瘤细胞与HK细胞（来自步骤6.9）注射至肛管上方1至2 mm处的远端后侧直肠黏膜下层。进针时针尖斜面应被黏膜覆盖。注意避免穿入盆腔。</li>
	<li>将小鼠从异氟烷鼻罩取下。术后观察1小时，注意是否有痛苦迹象，如弓背、呼吸困难等。</li>
</ol>
9. 生物发光成像
<ol>
	<li>使用生物发光成像系统每周监测原发肿瘤、肝脏和肺部转移负荷，检测荧光素酶活性。
	<ol>
		<li>从UCC或CRC实验中取出小鼠并称重。按150 mg/kg剂量腹腔注射荧光素，等待5分钟使底物在小鼠体内循环。</li>
		<li>在诱导室中使用2.5%异氟烷（溶于100%氧气，流速1 L/min）对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>将小鼠放入生物发光成像仪中，鼻部固定于鼻罩内。拍摄图像时，确保感兴趣区域正对相机。对于UCC和CRC注射模型，每次成像时均应使小鼠腹侧朝向相机，以仰卧位进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 器官与肿瘤的收获
<ol>
	<li>当原发肿瘤的生物发光辐射度达到 1 × 1011 光子数，或小鼠出现痛苦迹象（如体重减轻、弓背、呼吸急促或费力等）时，在注射荧光素后进行全身成像，随后通过吸入 CO2 处死小鼠（同步骤 5.2.1）。</li>
	<li>取出肝脏和肺脏，置于培养皿中成像以检测是否存在转移灶。切除肿瘤，称重并成像。将器官和肿瘤置于 10% 中性缓冲福尔马林溶液中，室温固定 48 小时。 
	注意：每次处理不同器官前后需清洁/擦拭剪刀和镊子，以避免组织交叉污染。</li>
</ol>
11. 组织学评估
<ol>
	<li>将福尔马林固定的组织包埋于石蜡中，并使用切片机将组织切成5 µm厚度，用于苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色及免疫组织化学（IHC）染色。 
	注意：所有石蜡切片的H&amp;#38;E染色均在Ochsner医疗系统的病理科实验室完成；本文中所有IHC染色均在Ochsner医疗系统的一个研究实验室中进行，在高温抗原修复后，使用Ki67和细胞角蛋白20抗体，随后按照制造商说明书加入生物素标记的二抗及亲和素-生物素-过氧化物酶复合物进行染色13,17。</li>
</ol>

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</ol>

本研究部分得到了2014年Ochsner转化医学研究计划资助。作者声明无利益冲突。

转移性疾病是导致大多数癌症患者死亡的主要原因。在临床前治疗试验中，建立能够最接近模拟人类肿瘤生长并自发发生远处器官转移的鼠类模型至关重要。利用植入患者来源肿瘤细胞的鼠类模型（异种移植）有助于更好地理解肿瘤生物学特性、预测性生物标志物，以及评估和预测新型疗法的抗肿瘤效果18。在小鼠实验中，已有多种模型用于展示尿路上皮癌（UCC）和结直肠癌（CRC）的转移，例如通过尾静脉注射以诱导肺部病变19，或在 flank 区皮下植入肿瘤细胞或肿瘤组织片段以实现局部肿瘤生长20,21。既往有实验室报道通过盐酸处理建立膀胱癌小鼠模型，成功促进肿瘤细胞的植入22。尽管这些方法可实现稳定的局部生长，并可能观察到一定程度的转移活性，但它们并不能特异性地模拟人类癌症的自然发展过程，也未利用患者体内实际存在的转移机制18,<sup cla...

研究表明，淋巴结（LN）转移是多种实体器官恶性肿瘤预后不良的指标，包括膀胱高级别尿路上皮细胞癌（UCC）和结直肠癌（CRC）1,2。尽管接受了根治性治疗，超过一半的肌层浸润性UCC（MIUCC）患者在临床局限性疾病情况下仍会发展为转移，并在5年内死亡。转移性CRC是美国癌症相关死亡的主要原因之一。
据估计，2018年美国将有约81,190例膀胱尿路上皮细胞癌（UCC）新发患者，并导致17,240例癌症相关死亡3,4。尽管大多数患者（70%）初诊时表现为非肌层浸润性疾病，但仍有30%的患者为肌层浸润性尿路上皮细胞癌（MIUCC）5。即使对临床局限性病变采取根治性治疗（根治性膀胱切除术[RC]联合或不联合全身化疗），约半数肌层浸润性膀胱尿路上皮细胞癌患者仍会在5年内出现转移并死亡3。在接受根治性膀胱切除术的患者中，约20%−25%存在淋巴结受累6,7,8。即使接受根治性膀胱切除术，淋巴结阳性患者的5年生存率仍低于35%，提示淋巴结受累是尿路上皮细胞癌患者预后的关键负性预测因子。
结直肠癌是美国男性和女性中第三大常见癌症。患者的预后在很大程度上取决于肿瘤特征及肿瘤微环境，例如浸润深度、淋巴结受累情况以及远处器官转移。尽管由于筛查和有效手术的推广，过去十年中结直肠癌的死亡率有所下降，但据估计，近50%的结直肠癌患者将发生转移或疾病复发9。
小型动物模型为研究肿瘤进展和不同转移模式提供了一个快速、可重复且可调控的平台。目前尚无能够稳定模拟结直肠癌（CRC）和尿路上皮癌（UCC）患者中所见转移特征的异种移植模型。癌症发生远处转移的主要途径是通过淋巴系统扩散。最新研究表明，淋巴结&#160;为肿瘤提供了独特的微环境，其作用不仅限于作为癌细胞短暂经过的静态靶点，还在转移过程中通过与癌细胞相互作用发挥关键作用。事实上，我们的研究发现，除了促进并“教育”肿瘤进展和转移外，淋巴结基质微环境还介导了结直肠癌的耐药性10,11。本实验室近期利用患者来源的原位异种移植（PDOX）小鼠模型，进一步证实了淋巴结基质细胞（LNSCs）对结直肠癌和尿路上皮癌的促瘤作用12,13。

建立PDOX模型为转化癌症研究提供了重要的平台14,15通过保持主要的组织学特征&#160;及其供体肿瘤的遗传特征，PDOX模型&#160;在传代过程中保持稳定，是转化癌症研究的良好平台12,15PDOX 模型目前正被用于临床前药物评估、生物标志物鉴定以及个体化医学策略的临床前评价，从而实现对临床疗效的预测。迄今为止，尚无已报道的异种移植模型能够充分考虑淋巴结（LN）受累的重要性，且稳定再现结直肠癌（CRC）和尿路上皮细胞癌（UCC）的原发肿瘤及远处器官转移。本研究描述了在 NOD/SCID 小鼠中建立 PDOX 模型的过程，成功再现了伴有淋巴结转移（LNSC）的转移性 CRC 和 UCC 疾病进展。&#160;

<table><tbody><tr><td>亲和素-生物素-过氧化物酶</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的二抗</td><td>Vector Labs Inc</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV（1.5 mg/mL）</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I（0.1 mg/mL）</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素（150 mg/kg）</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td></td></tr><tr><td>甲醛（10% 中性缓冲液）</td><td>Leica</td><td>46129</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺（2 nM）</td><td>Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>教堂 &amp;amp; Dwight Co., Inc</td><td>1 (800) 248-8820</td><td></td></tr><tr><td>Hanks平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30016.02</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶（20 mg/mL）</td><td>Sigma</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>108333</td><td></td></tr><tr><td>Luc/RFP-慢病毒</td><td>来自我们的合作者。参见参考文献13：Gills, J. et al. 一种可实现人源性膀胱高分级尿路上皮细胞癌肿瘤植入、生长、血管生成及转移的患者来源正位异种移植模型。Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018)。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>McCoy&amp;rsquo;s medium</td><td>Life Technologies</td><td>110862</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100 mL（100 U/mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>110636</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;气体 &lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 氧气</td><td>Airgas 公司</td><td>OX USP200</td><td></td></tr><tr><td>100% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas 公司</td><td>CD USPE</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;小鼠&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-8周龄NOD/SCID小鼠（雄性）</td><td>杰克逊实验室</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>6-8周龄NOD/SCID小鼠（雌性）</td><td>杰克逊实验室</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;免疫组织化学&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma</td><td>GHS232</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 兔单克隆抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9106-S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;工具&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m细胞滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形管</td><td>Sarstedt</td><td>11799</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 一次性离心管</td><td>Sarstedt</td><td>15762</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 组织培养皿</td><td>USA Scientific Inc</td><td>CC7682-3614</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>USA Scientific Inc</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Symmetry Surgical Inc</td><td>06-0011</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Symmetry Surgical Inc</td><td>02-2011</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;设备&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 加湿培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>生物发光成像（BLI）仪器</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>BLI 成像仪软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Beckman</td><td>366830</td><td></td></tr><tr><td>解卷积显微镜</td><td>智能成像创新</td><td>马里亚纳群岛</td><td></td></tr><tr><td>解卷积显微成像软件</td><td>智能成像创新</td><td>+1 (303) 607-9429 分机 1</td><td></td></tr><tr><td>数字卡尺</td><td>福勒工具与器械</td><td>54-115-330</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Precision Instruments LLC</td><td>(504) 228-0076</td><td></td></tr><tr><td>电外科发生器</td><td>ValleyLab</td><td>FORCE1C20</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷诱导室</td><td>Perkin Elmer</td><td>119038</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>American Optical Corporation</td><td>829</td><td></td></tr><tr><td>移液辅助器</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-681-15E</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr></tbody></table>

源自患者的膀胱上皮细胞癌和结直肠癌原位异种移植模型用于肿瘤生长及自发性转移研究

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

当膀胱高级别尿路上皮细胞癌（HG-UCC）和结直肠癌（CRC）存在淋巴结（LN）受累时，癌症患者的预后较差。尽管接受根治性治疗，超过50%的肌层浸润性尿路上皮细胞癌患者仍会在5年内发生转移并死亡，而转移性结直肠癌是美国癌症相关死亡的主要原因。因此，迫切需要能够稳定模拟患者UCC和CRC转移过程的异种移植模型。本研究旨在建立患者来源的原位异种移植（PDOX）模型，用于模拟在淋巴结基质细胞影响下UCC和CRC原发肿瘤生长及自发转移的过程，以开展药物筛选。分别从接受高级别尿路上皮细胞癌和结直肠腺癌切除术的知情同意患者中获取新鲜的UCC和CRC肿瘤组织。将表达荧光素酶的UCC细胞与淋巴结基质细胞（LNSC）类似物HK细胞共同接种，通过膀胱内（IB）灌注方式接种至雌性非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内；CRC细胞则通过直肠内（IR）注射方式接种至雄性NOD/SCID小鼠体内。采用生物发光成像（BLI）每周监测肿瘤生长和转移情况。处死后，收集小鼠的原发肿瘤和各器官组织，称重后用福尔马林固定，进行苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色分析。在我们独特的PDOX模型中，异种移植肿瘤的形态特征与患者移植前的肿瘤相似。在HK细胞存在条件下，两种模型均表现出较高的肿瘤植入率（通过BLI和肿瘤重量测定），UCC为83.3%，CRC为96.9%，以及较高的远处器官转移率（UCC中33.3%检测到肝或肺转移，CRC中为53.1%）。此外，两种模型在操作过程中均无动物死亡。我们已成功建立了一套独特且可重复的用于人源HG-UCC和CRC的PDOX模型，可用于肿瘤形成、生长及转移的研究。利用这些模型，可高效地以临床拟态方式开展新型治疗药物的测试。

在UCC PDOX模型中，将UCC患者BlCaPt15或BlCaPt37细胞与HK细胞共同经膀胱内（IB）灌注至雌性NOD/SCID小鼠膀胱中（图1A）。30只动物中有25只（83.3%）形成了原位肿瘤，并根据每周生物发光成像（BLI）显示时间依赖性的原位肿瘤生长（图1B、C和表1）。类似地，在CRC PDOX模型中，将患者来源的CoCaPt155或CoCaPt302细胞与HK细胞经直肠内（IR）注射后，32只小鼠中有31只（96.9%）成功长出原位肿瘤（图1D–F和表1）。根据患者来源肿瘤的不同，小鼠肿瘤生长的潜伏期存在差异，反映了患者临床特征的个体差异（图1C、F）...

本方案描述了通过将高级别尿路上皮细胞癌细胞经膀胱内灌注，或将结直肠癌细胞经直肠内注射至非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内，建立患者来源的原位异种移植模型，以在淋巴结基质细胞影响下实现原发肿瘤生长及自发性转移，从而模拟人类转移性疾病的进展过程。

当膀胱高级别尿路上皮细胞癌（HG-UCC）等疾病出现淋巴结（LN）受累时，癌症患者的预后较差。

需要建立模型，以通过与淋巴结的相互作用持续模拟癌症转移过程，这在结直肠癌和膀胱尿路上皮细胞癌患者中尤为重要。本文所述的原位异种移植模型有助于回答这些重要的生物学问题，并以高效且具有临床相关性的方式测试新的治疗方法。我们在小鼠体内建立的原位异种移植肿瘤与患者的肿瘤相似。在存在淋巴结基质细胞的情况下，两种模型均表现出更高的肿瘤植入率和远处器官转移率，且转移部位模拟了人类转移模式。此外，两种动物模型均无手术相关死亡率。从安乐死的小鼠体内取出患者来源的肿瘤后，在超净工作台中使用无菌手术剪将表达荧光素酶的肿瘤组织尽可能剪碎于培养皿中。将剪碎的肿瘤组织转移至无菌的50 mL锥形管中。制备消化液时，向40 mL HBSS中加入10 mL IV型胶原酶、80 µL透明质酸酶和160 µL I型脱氧核糖核酸酶，通过倒置混匀。向切碎的肿瘤组织中加入 35–40 mL 消化液，于 37 摄氏度下持续旋转孵育 2 小时，并定期剧烈振荡。消化完成后，为去除碎片，先将消化后的肿瘤组织通过无菌的 100 微米细胞筛过滤，再通过 40 微米细胞筛过滤，每次均收集滤过液至 50 mL 离心管中，弃去残留碎片。为洗涤游离细胞，向滤过液中加入 20 mL HBSS，并在 329 × g 离心 5 分钟。吸去上清液，并将沉淀重悬于 30 mL HBSS 中。取 100,000 个肿瘤细胞转移至无菌的 15 mL 圆锥形离心管中，加入 300,000 个先前制备的新鲜 HK 细胞。以 329 ×g 离心 5 分钟，然后通过抽吸弃去上清液。将细胞重悬于完全RPMI培养基中，置于冰上保存直至使用。为准备小鼠进行UCC细胞注射，使用脱毛膏去除6-8周龄雌性NOD-SCID小鼠背部下部的毛发。向膀胱内接种UCC细胞前，首先将单极电灼仪的功率设置为4瓦。麻醉小鼠后，将其置于仰卧位，鼻部放入异氟烷鼻罩中，裸露的背部牢固地接触分散电极。用润滑胶将24号套管针进行润滑，然后通过小鼠尿道轻柔但稳固地插入套管针。如果导管插入时发生弯曲，可将导丝插入导管约一半长度以提供支撑稳定性。然后，将0.64毫米的固定芯直导丝完全插入，使其超出套管针末端1毫米。将单极针接触导丝持续一秒钟，以实现对膀胱黏膜的电刺激。将一个新的无菌套管针连接至1 mL螺口注射器，抽取先前步骤中制备的UCC细胞悬液，体积达200微升。从尿道中取出导丝和套管针，然后插入连接有细胞注射器的套管针。向小鼠膀胱内注射50 µL细胞悬液，为使细胞黏附于膀胱壁，拔出套管针前需等待数秒。最后，将小鼠移出异氟烷鼻罩和接地垫，并在术后观察1小时，注意有无痛苦迹象。为建立结直肠癌小鼠模型，将一只6-8周龄的雄性NOD-SCID小鼠麻醉后置于解剖显微镜下，呈仰卧位，用胶带固定其鼻部至异氟烷鼻罩，并固定前肢以保持稳定。在尾根部下方放置一个小物体（如一小块纱布），抬高肛门以改善视

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