大鼠模型中的面神经手术用于研究轴突抑制与再生
2020年5月5日
本方案描述了一种在大鼠模型中可重复的面神经外科手术方法，包括各种可诱导性损伤模式的描述。
该方案可帮助科学家研究面神经损伤后的结果以及改善再生的各种方法。该技术的主要优势在于，大鼠的解剖结构便于对面神经进行操作，且其较大的尺寸使我们能够研究所有相关的损伤模式。该技术的应用可拓展至面神经损伤患者的康复治疗领域。
由于大鼠具有再生潜力，可提供一种可重复且简明的实验模型。该方法有助于深入了解面神经麻痹或瘫痪的外科和药物治疗策略，并可推广应用于其他头颈部模型或其他周围神经的研究。
使用双手在显微镜下操作可能具有挑战性。我建议在尝试面神经分离之前，先在显微镜下练习使用双目镜。确认大鼠对脚趾夹捏无反应后，将眼膏涂抹于大鼠眼睛，并剃除手术区域的毛发。
建立大鼠识别方法，并在颈部下方放置一卷纱布。使用氯己定和70%乙醇交替擦拭三次，对暴露的皮肤进行消毒，然后将大鼠置于体视显微镜下。前后方向移动同侧耳部，以确定耳后皮肤的自然折叠方向。
使用15号刀片在耳后皱襞处做一个2至3毫米的切口。切口的设计与定位是确保可靠识别面神经同时最小化伤口大小的最关键步骤。钝性分离皮下浅筋膜，并放置微型Weitlaner拉钩以充分暴露组织。
辨认位于下颌骨下方、沿颅底方向由下向上走行的前腹二腹肌。沿该肌肉的肌腹插入点轻轻分离，以暴露前腹二腹肌的肌腱。该肌腱呈薄膜状白色结构，从肌肉发出并牢固地附着于颅底。
在辨认出前腹二腹肌及其肌腱后，调整韦特兰纳拉钩以进一步牵开肌腹。暴露的区域即为面神经主干所在的三维空间。从茎乳孔出口远端开始，沿神经向下方进行解剖分离。
为诱导挤压损伤模型，使用表面光滑的珠宝镊牢固夹住神经，并施加恒定且可重复的压力，持续挤压30秒，以确保产生适当的挤压损伤。对于简单的横断损伤，用细齿镊子夹住覆盖在神经表面的神经外膜，然后使用锋利的显微剪在目标位置单次剪切，干净利落地横断神经。对于神经缺损模型，使用可调式卡尺设定所需的神经缺损长度，以确保动物间损伤模式的一致性，并按照前述方法横断神经。
在施加实验性损伤后，用无菌生理盐水冲洗伤口，并用无菌纱布擦干组织，然后根据机构指南关闭皮肤切口。此处展示了在成年转基因 Thy1-GFP 大鼠中，对第一 PES 分支点远端约两到三毫米处的面神经主干施加挤压伤后的活体成像。
在转基因动物中，可通过检测损伤后一、二、三和四周时荧光信号的逐步恢复情况，作为监测神经再生的指标。组织形态计量学分析可用于获取下颌缘支的横截面图像，从而对轴突直径、碎片数量、神经纤维、神经所占百分比及密度等参数进行定量分析。在识别面神经时，应根据需要频繁调整拉钩的位置，以确保相关解剖神经清晰可见。
通过该操作，可获取相关神经和肌肉组织用于免疫组织化学分析，以评估其相对于其他实验组的再生程度。该技术建立后，为研究人员探索面神经损伤后的功能恢复结果铺平了道路，特别是如何影响联带运动现象的研究。
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概述
本实验方案详细描述了一种在大鼠模型中进行面神经手术的可重复方法，重点研究面神经损伤模式及再生效果。该方法有助于探索面神经损伤修复的外科技术与药物治疗手段。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 再生医学
- 动物模型
背景
- 大鼠模型可方便地暴露面神经。
- 该手术技术有助于评估神经损伤及再生方法。
- 大鼠的解剖学特征使其能够对不同损伤模式进行详细研究。
研究目的
- 评估面神经麻痹或面神经瘫痪的治疗方法。
- 增进对面神经损伤后再生过程的理解。
- 建立一种可在不同研究间重复的精细手术技术。
使用的方法
- 本研究采用大鼠模型进行面神经外科干预。
- 主要操作包括压榨损伤和横断，具体外科步骤经过明确描述以确保可重复性。
- 采用活体成像和组织形态计量学分析来监测神经再生结果。
- 强调在显微镜下进行系统解剖，要求操作者具备熟练技术和充分准备。
主要结果
- 对面神经的成功可视化和操作可实现对再生过程的评估。
- 荧光成像与组织形态计量分析可提供神经恢复的量化指标。
- 该技术揭示了神经损伤后联动现象的重要机制。
结论
- 本研究建立了分析面神经损伤与再生的基础实验方案。
- 该方法使研究人员能够探索神经康复中的功能结果及治疗策略。
- 该方法学在周围神经研究的更广泛应用中具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
大鼠面神经损伤模型为评估轴突再生与抑制提供了可重复的平台，有助于神经再生治疗开发中的靶点验证。该模型具有可扩展性和解剖可及性，能够一致地评估损伤模式和再生反应，从而促进神经营养或抗抑制候选药物的临床前风险评估。该模型通过提供与人类面神经修复策略相关的可量化组织形态学和功能读数，架起了基础研究与转化研究之间的桥梁。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在明确的神经挤压、横断或缺损损伤后，用于研究轴突抑制机制及再生通路。
- 操作价值：支持向目标部位稳定递送神经活性试剂或细胞，以评估靶点结合情况及通路调控效果。
- 预测价值：通过组织形态计量学定量分析轴突直径、纤维密度和碎片清除情况，为靶点有效性及机制验证提供客观评价指标。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪： 可生成标准化的损伤模型，适用于高重复性筛选促再生化合物或抑制性拮抗剂。
- 定量输出： 通过荧光标记轴突的活体成像及组织形态学分析，实现纵向、可量化的再生过程追踪。
- 可扩展性： 大鼠模型可支持从颅内至颞外神经节段的手术操作，适用于多参数评估。
转化与临床前研究
- 转化连续性：有助于评估功能恢复和联带运动的减轻效果，与面神经康复中的临床终点相一致。
- 临床前建模：可在具有疾病相关性的外周神经系统中，评估中枢或效应器官干预措施及细胞治疗的效果。
- 基于风险调整的推进：可靠的存活率和跨物种一致性可为进入高等物种的转化研究前的“继续/终止”决策提供支持。
流程与工作流整合
该模型通过可控的神经损伤实现靶点验证，融入发现研究工作流程，进而推进用于化合物筛选的检测方法开发，并通过功能性和结构性结局指标支持再生疗法的临床前评估。
- 发现生物学：通过标准化的损伤范式，促进对轴突生长抑制剂和促进剂的假设验证。
- 筛选：提供可重复的神经损伤模型，用于评估化合物对再生动力学和保真度的影响。
- 分析：基于组织形态计量学和荧光的检测方法提供可量化的数据，用于剂量-反应和靶点结合分析。
- 转化研究：将轴突再生指标与连带运动等功能性结果相关联，增强临床相关性。
- 企业级复用：建立可重复使用的手术平台，支持在多种治疗模式和时间点上进行迭代测试。
运营与企业影响
- 科学价值：通过可量化、可重复的损伤与再生指标，减少轴突再生研究中的机制模糊性。
- 操作价值：标准化的手术技术和术后评估流程提高了不同实验室之间的一致性与数据可靠性。
- 战略价值：通过阐明靶点生物学特性并降低后期神经再生项目中的失败风险，支持早期“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于在具有临床相关性的外周神经模型中验证的靶点调控效果，实现对神经再生候选分子的风险校正优先排序。
实施注意事项
- 需要具备显微外科技术经验，并熟悉在立体显微镜引导下进行啮齿类动物神经解剖操作。
- 依赖于特殊仪器，包括微型Weitlaner牵开器、珠宝匠镊子、显微剪刀以及可调式卡尺，以实现标准化损伤诱导。
- 需要使用转基因报告基因小鼠品系（例如Thy1-GFP）或免疫组织化学处理，用于轴突的长期追踪及组织形态学分析。
- 要求制定术后护理方案，以确保大鼠存活并减少再生评估中的混杂因素。
- 与小鼠模型相比，其遗传可操作性有限，可能限制通过基因敲除或过表达手段进行机制性研究。
