Name: 大鼠模型中的面部神经外科研究同氧抑制与再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: 了解大鼠模型中面部神经外科手术技术，用于研究神经损伤与再生机制。该方法通过挤压或横断损伤模式，结合荧光成像和组织形态学分析，为评估面神经麻痹的治疗策略提供可重复的实验基础。

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S.A.A. 由美国面部整形与重建外科学会 Leslie Bernstein 基金项目资助。

所有干预均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南进行。实验方案经密歇根大学机构动物护理和使用委员会 &amp;#38; 使用委员会（IACUC）批准后方可实施。实验采用10周龄成年雌性Sprague-Dawley大鼠。
1. 手术日前的准备
<ol>
	<li>手术日前，请确保备有充足的已灭菌外科器械、镇痛药物、麻醉药物和氧气。完整清单请参见材料表。</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
	<li>确保有足够的工作空间，包括至少容纳两名人员（外科医生和助手）的空间。 
	注意：需要配备专用手术台、麻醉机设备的放置空间，以及用于存放已灭菌物品和备用耗材的充足存储空间。</li>
	<li>校准手术显微镜以供操作过程中使用。确保外科医生能够在显微镜手柄和变焦/对焦按钮上覆盖无菌保护套后，仍可正常调节手柄和按钮。 
	注意：我们在手柄和按钮上使用了无菌铝箔作为覆盖物。</li>
</ol>
3. 麻醉与准备
<ol>
	<li>将动物放入麻醉室，通过1.8%异氟烷和0.9 L/min氧气诱导全身麻醉。
	<ol>
		<li>通过评估自主呼吸以及通过脚趾夹捏测试动物的面部痛苦反应来评估意识水平，以确认麻醉深度足够。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双侧眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止角膜刺激或干燥。</li>
	<li>使用剃刀或电动剪毛器剃除手术部位的毛发。
	<ol>
		<li>此时建立大鼠识别方法，可通过耳标或尾部标签/标记实现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>沿动物背部皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡，用于预防术后疼痛。</li>
</ol>
4. 手术入路与损伤模式
<ol>
	<li>将动物转移至手术台，并通过鼻罩继续供气。确保在动物身下放置加热垫，并置于无菌区域下方，以维持其体温。</li>
	<li>使用灭菌纱布（卷起并用胶带固定）作为大鼠的颈部垫枕；这有助于更好地暴露手术区域。请注意，动物的正确体位对于高效识别和分离神经至关重要。</li>
	<li>为动物面部皮肤进行术前准备。使用氯己定或含碘溶液对术区进行3次擦洗，每次交替使用70%乙醇，以确保充分消毒。</li>
	<li>如需要，可预先规划并标记手术切口。前后移动同侧耳部，以确定耳后皮肤的自然褶皱方向。</li>
	<li>使用锐利的虹膜剪或15号刀片，在耳后皱襞处做一4–5 mm的切口。该切口可在后续操作中根据需要扩大。</li>
	<li>钝性分离皮下浅筋膜层，并放置微型Weitlaner牵开器以增强术野暴露。注意此区域可能存在小口径血管；最好通过Weitlaner牵开器向上或向下牵拉以避开这些血管。</li>
	<li>识别前腹侧二腹肌，该肌自下向上走行，止于颅底。
	<ol>
		<li>沿其止点轻柔地分开肌肉腹侧部分，以显露前腹侧二腹肌的肌腱。请注意，该肌腱呈薄膜状白色结构，从肌肉发出并牢固附着于颅底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在确认前腹侧二腹肌及其肌腱后，调整Weitlaner牵开器，进一步牵拉肌肉腹侧部分。请注意，随后暴露的区域即为面神经主干所在的三维空间。 
	注：该区域上方及内侧由颅底界定，外侧为前腹侧二腹肌，后内侧为耳道，下方则由颈部结构（包括颞浅动脉）构成边界。</li>
	<li>充分暴露后，识别面神经主干，该神经自颅底茎乳孔穿出后，从二腹肌肌腱下方斜向下行。请注意，该神经呈珍珠白色条索状，包埋于动物腮腺-咬肌筋膜内。在进一步暴露神经时应格外谨慎，原因如下：
	<ol>
		<li>避免剧烈解剖操作或垂直方向的撑开，以防造成牵拉介导的神经失用性损伤。</li>
		<li>避免向后内侧方向过度解剖，以防破坏覆盖耳道的薄层组织，从而导致中耳菌群进入手术区域。</li>
		<li>避免因广泛向内下方解剖而损伤颞浅动脉。请注意，若发生损伤，将表现为快速、搏动性出血。
		<ol>
			<li>若动脉受损，应立即使用镊子夹持棉签或无菌纱布施加压迫止血。可局部应用止血剂或液体纤维蛋白胶。需注意，动物可能需要皮下注射0.9%无菌生理盐水以维持液体平衡。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从茎乳孔出口远端开始，沿神经向下（远端）方向解剖，追踪面神经主干。
	<ol>
		<li>延长原始切口，以便完全暴露神经及其分支。操作时应注意避免破坏腮腺，以防术后发生涎腺囊肿（sialocele）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下方法诱导所需的损伤模式：
	<ol>
		<li>对于压榨伤，使用表面光滑的钟表匠镊子牢固夹住神经并进行压迫9。持续施加稳定且可重复的压力达30秒，以确保形成适当的压榨损伤。</li>
		<li>对于单纯横断伤，用细齿镊夹住覆盖神经的筋膜或邻近的外膜（epineurium），使用锐利的显微剪在目标位置单次剪断神经，确保切口整齐。操作时注意避免镊子对神经施加过度牵拉。</li>
		<li>对于神经缺损模型，采用与单纯横断伤类似的方法制造所需神经缺损。术中可使用已灭菌的棉签杆（根据所需神经缺损长度预先截断）作为间隔物，以确保各实验动物间损伤模式的一致性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 伤口闭合
<ol>
	<li>用无菌生理盐水冲洗伤口，并用无菌纱布擦干。</li>
	<li>使用可吸收缝线以简单的皮下缝合方式对合皮肤边缘，或使用皮肤粘合剂或伤口夹闭合伤口，这些方法同样可接受。缝合时先从一侧皮肤边缘深部到浅部进针，再从对侧皮肤边缘浅部到深部进针，完成一针埋入式缝合。</li>
</ol>
6. 术后恢复
<ol>
	<li>皮下注射非甾体类抗炎镇痛药（例如&#160;0.05 mg/kg 布托啡诺和 0.5 mg/kg 卡洛芬）以进行术后镇痛。将注射部位选在动物背部。</li>
	<li>停止麻醉剂的给药，让动物额外吸入氧气 1 分钟。</li>
	<li>将动物置于通过加热灯保温、无菌且不含垫料的笼子中，以避免意外摄入垫料。注意动物通常在 1–2 分钟内出现恢复迹象，可能表现为定向障碍，并伴有后肢功能延迟恢复。</li>
	<li>将动物送回相应饲养区域的笼子中，并在术后第 1 天给予术后镇痛药，以持续预防疼痛。</li>
	<li>每天监测动物两次，评估是否存在营养不良、角膜刺激或手术部位感染的迹象，并维护适当的手术记录。
	<ol>
		<li>若动物出现明显体重下降，以皮下方式注射 0.9% 无菌生理盐水。</li>
		<li>每日涂抹润滑性眼膏，直至动物眨眼反射恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

大鼠面神经损伤模型因其手术可及性、分支模式及生理学意义，已成为评估神经营养因子最通用的系统27,29,33,34,35,36。视频演示与转基因动物数据的应用相结合，为神经再生现象的科学研究开辟了新的可能性。该模型可对神经对创伤的反应、神经营养因子的影响、免疫调节作用以及其他微环境因素进行系统而详细的表征。尽管临床面神经研究的主要目标是运动神经元功能的恢复，但该模型还可用于深入理解神经肌肉接头处的事件、轴突运输的细微机制以及轴突-胶质细胞相互作用的复杂性27,36,37</s...

头颈部区域的颅神经损伤可能继发于先天性、感染性、特发性、医源性、创伤性、神经性、肿瘤性或系统性病因1。其中，第Ⅶ对颅神经（即面神经）最常受累。面神经功能障碍的发生率较高，每年每10万人中有20至30人发病2。面神经的主要运动分支包括颞支、颧支、颊支、下颌缘支和颈支；根据受累分支的不同，可能出现口唇闭合不全或流涎、角膜干燥、因眼睑下垂导致的视野遮挡、构音障碍或面部不对称等后果2,3。长期并发症包括联带运动现象，即在试图主动收缩某一面部肌群时，引发另一面部肌群的不自主运动。眼-口联带运动是最常见的异常再生表现，为面神经损伤的后遗症之一，可导致功能障碍、尴尬感、自尊心下降以及生活质量降低3。不同分支的损伤决定了特定功能的选择性受损。
面神经损伤的临床治疗尚无统一标准，需要进一步研究以改善治疗效果。类固醇可减轻急性期面神经的肿胀，而肉毒杆菌毒素（Botox）可用于暂时控制联带运动；但临床医生主要的重建治疗手段仍依赖于通过神经修复、替代或功能重建等外科手术干预3,4,5,6。根据面神经损伤类型的不同，面神经外科医生可选择多种治疗方案。对于简单的横断性损伤，神经再吻合术较为适用，而对于存在神经缺损的情况，则更适合采用电缆式神经移植修复；在恢复功能方面，外科医生可选择静态或动态的面部功能重建手术。然而，在许多面神经损伤及其修复病例中，即使由经验丰富的面神经外科医生操作，最佳治疗效果仍可能遗留持续性面部不对称和功能障碍7。
这些不理想的结果推动了面神经再生领域的广泛研究。研究的主要方向包括完善和创新神经修复技术、确定各种神经再生因子的作用，以及评估特定神经抑制剂在改善联带运动这一长期后遗症方面的潜力8,9,10,11。尽管体外模型可用于评估促生长或抑制性因子的某些特性，但该领域真正的转化研究仍需依赖可转化的动物模型来实现。
选择何种动物模型往往具有挑战性，因为研究人员已同时使用大型动物（如绵羊）和小型动物模型（如小鼠）12,13。尽管大型动物模型可提供理想的解剖可视化条件，但其使用需要专门的设备和人员，而这些资源并不容易获得。此外，为研究提供足够的统计效能以证明干预效果可能成本极高，甚至超出了许多科研中心的实际可行范围。因此，小型动物模型使用最为广泛。小鼠模型可用于评估多种与面神经手术相关的结局指标；然而，由于神经长度有限，可能限制研究人员模拟某些特定损伤模式的能力，例如大段缺损损伤14。
因此，大鼠作为小鼠的原型动物模型，已成为科学家开展创新性外科手术或应用抑制性及促生长因子，并在多种结局参数中评估其效果的主要实验模型。大鼠的面神经解剖结构具有可预测性和易接近性，能够以可重复的方式进行操作。与小鼠模型相比，大鼠体型更大，可模拟多种外科缺损情况，从简单的横断损伤到5 mm的缺损间隙均可实现15,16。这进一步允许在缺损部位实施复杂的干预措施，包括局部施加因子、神经内注射因子，以及同基因移植段或桥接物的植入17,18,19,20,21,22,23。
大鼠性情温顺、解剖结构稳定，且具有较强的神经再生能力，因此可针对上述手术损伤模式收集多种结局指标24。通过大鼠模型，面神经研究者能够评估损伤后的电生理反应，利用免疫组织化学技术分析神经和肌肉的组织学结果，通过追踪胡须垫运动和评估眼睑闭合功能来判断功能恢复情况，并借助荧光显微镜或共聚焦显微镜观察微观和宏观变化等11,22,23,25,26,27,28,29。因此，以下方案将概述一种大鼠面神经的手术入路及可诱导的损伤模式。

<table><tbody><tr><td>1.8% 异氟烷</td><td>VetOne</td><td>13985-030-40</td><td></td></tr><tr><td>11-0 尼龙显微缝合线</td><td>AROSuture</td><td>TK-117038</td><td></td></tr><tr><td>4-0 单乔缝合线</td><td>VWR</td><td>75982-084</td><td></td></tr><tr><td>缓释布托啡诺</td><td>ZooPharm</td><td>MIF 900-006</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MFCD00079028</td><td></td></tr><tr><td>氯己定</td><td>VWR</td><td>IC19135805</td><td></td></tr><tr><td>珠宝镊</td><td>VWR</td><td>21909-458</td><td></td></tr><tr><td>微型韦特兰牵开器</td><td>VWR</td><td>82030-146</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>VWR</td><td>100492-348</td><td></td></tr><tr><td>微型肌腱切断剪刀</td><td>VWR</td><td>89023-522</td><td></td></tr><tr><td>15 号手术刀片</td><td>VWR</td><td>102097-834</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凡士林眼用凝胶</td><td>Pharmaderm</td><td>B002LUWBEK</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td>VWR</td><td>89125-834</td><td></td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>Vetbond, 3M</td><td>NC9259532</td><td></td></tr><tr><td>导水垫</td><td>Aqua Relief System</td><td>ARS2000B</td><td></td></tr><tr><td>布比卡因</td><td></td><td></td><td>用作局部镇痛药</td></tr></tbody></table>

大鼠模型中的面神经手术用于研究轴突抑制与再生

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

本方案描述了在大鼠面神经损伤模型中研究轴突再生与抑制作用的一致且可重复的方法。面神经可沿其全长进行操作，从颅内段至颅外段均可触及。实验研究再生特性的神经损伤主要有三种类型：神经压伤、横断伤和神经缺损伤。可能的干预手段范围广泛，包括对神经的外科操作、神经活性试剂或细胞的递送，以及中枢或终末器官的操作。该模型在研究神经再生方面的优势包括操作简便、可重复性高、跨物种一致性好、大鼠存活率可靠，以及相对于小鼠模型具有更大的解剖尺寸。其局限性在于与小鼠模型相比基因操作手段较为有限，且大鼠本身具有极强的再生能力，因此面神经研究者必须谨慎选择恢复的时间点，并审慎评估将结果外推至更高等动物及人类研究的可行性。大鼠面神经损伤模型可用于功能学、电生理学以及组织形态计量学参数的分析与比较，从而在深入理解人类患者面神经损伤的严重后果及其治疗策略方面具有巨大潜力。

初次手术后，主要有两种类型的结果评估指标：活体动物的系列测量和需要处死动物才能进行的测量。系列测量的例子包括电生理检测，如复合肌肉动作电位测量30，通过激光辅助或视频记录手段对面部肌肉运动的评估9，以及在荧光转基因动物中对面神经再生过程进行重复的活体成像31,32。图1展示了在成年转基因Thy1-GFP大鼠中对面神经主干进行的活体成像。在下颌缘支约距第一分支点远端2-3 mm处实施了压榨损伤。利用MetaMorph成像软件，我们能够量化面神经走行中任意位置的荧光强度。特别是，可以分别量化损伤部位近端和远端的荧光信号，从而通过荧光信号的恢复情况作为神经再生的标志物进行连续评估。图2展示了在Thy1-GFP大鼠中...

本方案描述了一种在大鼠模型中可重复的面神经外科手术方法，包括各种可诱导性损伤模式的描述。

本方案描述了在大鼠面神经损伤模型中研究轴突再生与抑制作用的一致且可重复的方法。面神经……

该方案可帮助科学家研究面神经损伤后的结果以及改善再生的各种方法。该技术的主要优势在于，大鼠的解剖结构便于对面神经进行操作，且其较大的尺寸使我们能够研究所有相关的损伤模式。该技术的应用可拓展至面神经损伤患者的康复治疗领域。由于大鼠具有再生潜力，可提供一种可重复且简明的实验模型。该方法有助于深入了解面神经麻痹或瘫痪的外科和药物治疗策略，并可推广应用于其他头颈部模型或其他周围神经的研究。使用双手在显微镜下操作可能具有挑战性。我建议在尝试面神经分离之前，先在显微镜下练习使用双目镜。确认大鼠对脚趾夹捏无反应后，将眼膏涂抹于大鼠眼睛，并剃除手术区域的毛发。建立大鼠识别方法，并在颈部下方放置一卷纱布。使用氯己定和70%乙醇交替擦拭三次，对暴露的皮肤进行消毒，然后将大鼠置于体视显微镜下。前后方向移动同侧耳部，以确定耳后皮肤的自然折叠方向。使用15号刀片在耳后皱襞处做一个2至3毫米的切口。切口的设计与定位是确保可靠识别面神经同时最小化伤口大小的最关键步骤。钝性分离皮下浅筋膜，并放置微型Weitlaner拉钩以充分暴露组织。辨认位于下颌骨下方、沿颅底方向由下向上走行的前腹二腹肌。沿该肌肉的肌腹插入点轻轻分离，以暴露前腹二腹肌的肌腱。该肌腱呈薄膜状白色结构，从肌肉发出并牢固地附着于颅底。在辨认出前腹二腹肌及其肌腱后，调整韦特兰纳拉钩以进一步牵开肌腹。暴露的区域即为面神经主干所在的三维空间。从茎乳孔出口远端开始，沿神经向下方进行解剖分离。为诱导挤压损伤模型，使用表面光滑的珠宝镊牢固夹住神经，并施加恒定且可重复的压力，持续挤压30秒，以确保产生适当的挤压损伤。对于简单的横断损伤，用细齿镊子夹住覆盖在神经表面的神经外膜，然后使用锋利的显微剪在目标位置单次剪切，干净利落地横断神经。对于神经缺损模型，使用可调式卡尺设定所需的神经缺损长度，以确保动物间损伤模式的一致性，并按照前述方法横断神经。在施加实验性损伤后，用无菌生理盐水冲洗伤口，并用无菌纱布擦干组织，然后根据机构指南关闭皮肤切口。此处展示了在成年转基因 Thy1-GFP 大鼠中，对第一 PES 分支点远端约两到三毫米处的面神经主干施加挤压伤后的活体成像。在转基因动物中，可通过检测损伤后一、二、三和四周时荧光信号的逐步恢复情况，作为监测神经再生的指标。组织形态计量学分析可用于获取下颌缘支的横截面图像，从而对轴突直径、碎片数量、神经纤维、神经所占百分比及密度等参数进行定量分析。在识别面神经时，应根据需要频繁调整拉钩的位置，以确保相关解剖神经清晰可见。通过该操作，可获取相关神经和肌肉组织用于免疫组织化学分析，以评估其相对于其他实验组的再生程度。该技术建立后，为研究人员探索面神经损伤后的功能恢复结果铺平了道路，特别是如何影响联带运动现象的研究。

facial-nerve-surgery-rat-model-to-study-axonal-inhibition

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

大鼠模型中的面部神经外科研究同氧抑制与再生

本视频演示了在大鼠模型上进行的外科手术方案，详细介绍了从麻醉准备到面神经损伤诱导的各个步骤。该方案在医学研究中对于研究神经再生和外科技术具有重要意义。...

在大鼠模型中诱导面神经损伤

本视频展示了通过结扎眶下神经在大鼠模型中诱导口面部神经病理性疼痛的方法。该操作会导致神经损伤和炎症，引发异常的疼痛信号传导，模拟慢性疼痛状态，可用于研究口面部疼痛检测模型。...

通过眶下神经结扎在大鼠模型中诱导口面部神经性疼痛

来源：Deseure, K., 等. 通过大鼠眶下神经慢性缩窄性损伤（IoN-CCI）研究三叉神经病理性疼痛。J. Vis. Exp.

通过眶下神经缩窄术在大鼠模型中诱导神经病理性疼痛

来源：Olmstead, D. N., 等，小鼠面神经轴突切断模型：研究运动神经元对损伤反应的方法。J. Vis. Exp. (2015)。本视频演示了小鼠面神经 crush...

在小鼠模型中进行面神经压榨性轴切术

利用背根神经节注射与背根挤压损伤在大鼠中建立感觉轴突再生模型

嗅鞘细胞（OECs）是神经嵴细胞，能够支持初级嗅觉神经元的生长。这一特殊特性可用于细胞移植。本文介绍了一种基于在喉神经损伤模型中使用OECs的细胞移植模型。...

移植嗅鞘细胞以评估外周神经损伤后的功能恢复

本文介绍了一种在小鼠面神经上进行切断或压榨性轴突切断术的手术方案。面神经轴突切断术可用于研究神经损伤后的生理反应，并测试治疗技术。...

小鼠面神经切断术：研究运动神经元损伤反应的模型

本方案介绍了一种在成年大鼠中通过背根神经节（DRG）注射病毒载体并同时造成背根 crush...

背根神经节注射与背根挤压损伤作为感觉轴突再生的研究模型

在此，我们介绍一种结合了 体内...

颅顶耳长肌体内联合电穿孔与短期再神经支配

本方案展示了如何逆行标记视网膜神经节细胞，以及随后如何制造视神经 crush...

一种用于研究视网膜神经节细胞存活的视神经 crush 损伤小鼠模型

了解大鼠模型中面部神经外科手术技术，用于研究神经损伤与再生机制。该方法通过挤压或横断损伤模式，结合荧光成像和组织形态学分析，为评估面神经麻痹的治疗策略提供可重复的实验基础。

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