评估化疗诱导黏膜炎小鼠模型中小肠损伤与适应的重要终点指标和增殖标志物

这种化疗诱导的黏膜炎模型可用于确定小肠损伤及代偿性高增殖的重要终点指标和增殖标志物。该方法省时、经济、易于操作。采用此类标准化方法，可减少变异，更易于比较分析终点指标。

为诱导5-氟尿嘧啶（5FU）所致黏膜炎，使用适当体积的5FU填充一支1毫升注射器，该注射器配备27号19毫米针头。手动固定受体小鼠，在牢固但轻柔地抓握小鼠的同时，将其腹部朝上暴露，将针头插入腹部下方象限之一的腹腔内。随后回抽以确认针头位置正确，然后注射5FU。

在适当的实验终点，进行5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）定量时，称量一只经5-氟尿嘧啶（5FU）损伤的小鼠，并在通风橱内通过腹腔注射给予每千克体重5毫克的BrdU。BrdU注射后150分钟，确认小鼠对脚趾夹捏无反应，记录麻醉状态下小鼠的体重，并将动物置于仰卧位。进行剖腹手术以暴露腹腔，并切开胸腔以造成气胸。

在幽门上方切断，小心地将肠组织从动物体内抽出，直至到达盲肠。使用镊子轻轻夹闭近端肠腔，并用配备25号针头的10毫升注射器以生理盐水冲洗小肠。然后将排空的肠段置于干净的吸水纸上，仔细去除多余的盐溶液。

进行组织采集时，按照上述方法从小鼠体内取出小肠，并记录冲洗后组织的重量。经过组织学处理后，可将组织置于连接相机的光学显微镜下，使用10倍物镜进行成像，以获取所采集组织的组织学图像。为测量BrdU免疫反应性细胞的面积，需在ImageJ中打开目标图像，并同时打开载物台测微尺图像。

使用直线选择工具在微米图像上绘制一条直线，以定义已知距离，然后在“分析”菜单中选择“设置比例尺”。在“已知距离”框中输入数值，并在“长度单位”框中定义长度单位。打开待测图像，用于测量每个隐窝中 BrdU 免疫反应性细胞的面积，并在“图像类型”菜单下将彩色图像设置为 8 位。

增强待处理图像的对比度，并将饱和像素设置为0.4%。对图像应用阈值以分割免疫阳性区域，并选择图像调整。选择阈值和红色通道，移动阈值滑块以选定约10%至20%的阈值。然后选择一个方向良好的隐窝，使用手绘选择工具标记其周围的区域。

为测量阈值面积，打开分析选项卡并选择“分析颗粒”。在“分析颗粒”窗口中，将大小设置为20至无穷大，并勾选像素单位框。将圆形度设置为0到1，并将显示设置为轮廓。

然后单击显示结果、汇总并包含孔洞的复选框。测量结果将在摘要窗口中显示。要测量隐窝深度，请在 Zen Light 中打开图像并连接相机。

使用20倍物镜在相机模式下拍摄图像，然后切换到处理模式以打开快照。切换至测量视图，利用线条工具从一个方向良好的隐窝底部开始画线，至隐窝顶部结束。

然后导出测量数据，并计算隐窝深度和填充高度的平均值。小肠重量从第2天到第4天下降，提示肠上皮细胞质量减少。值得注意的是，在第5天时，处理组动物的小肠重量与第0天相比无显著差异。

通过BrdU掺入法检测到的细胞增殖在第1天和第2天几乎完全被抑制，但在第4天和第5天，其增殖分别增加了约四倍和五倍。通过测量隐窝深度也可观察到这种过度增殖现象。在黏膜炎的再生阶段，BrdU掺入量与隐窝深度之间存在显著相关性，而在急性期则未观察到该相关性，这提示在黏膜炎急性期使用隐窝深度作为终点指标可能是合适的。

与野生型5-FU小鼠相比，L细胞分泌不足的转基因小鼠在恢复期表现出显著的体重减轻以及小肠重量下降。此外，由于隐窝长度明显短于野生型小鼠和健康对照组，转基因小鼠未能表现出代偿性高增殖。在进行该操作时，务必完全排空小肠，并在称重组织前去除多余的生理盐水，以准确获得仅小肠组织的重量。

观看本视频后，您应能够充分理解如何开展、收集并确定小肠损伤的重要终点指标，并有效获得可重复的数据。请务必注意，操作5FU和BrdU等化学化合物可能存在危险，在进行这些实验操作时，应始终采取预防措施，例如穿戴实验服、手套，并在通风橱中操作。