Name: 成人希马神经前体细胞的乳化电路特定调节 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解化学遗传学技术调控特定神经环路对成年神经干细胞增殖的影响。本方法结合组织切片、免疫荧光染色和显微成像，可精确量化神经发生过程，为研究脑环路如何调节成体神经发生提供可靠方案。

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L.J.Q. 获得了美国国立卫生研究院国家精神卫生研究所的资助，资助项目包括多元化补充基金 R01MH111773 以及 T32 培训基金 T32NS007431-20。本项目获得了 NIH（MH111773、AG058160 和 NS104530）授予 J.S. 的基金资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验方案的目的是通过一系列免疫组织化学技术，在体内评估操控特定神经环路对成年海马神经发生的调控作用。检测由特定神经环路介导的、依赖于神经活动的成年神经发生调控是一种极具价值的技术，且具有广泛的可修改性，可用于研究多种不同的神经环路。此类实验的成功依赖于多个因素，包括准确的病毒递送、针对所需操控选择合适的病毒类型、正确给予胸腺嘧啶类似物、动物年龄、免疫染色效率、成功的经心灌注以及对图像的无偏定量分析。例如，病毒递送不准确可能导致脱靶效应，从而产生与目标环路无关的表型。此外，低质量的免疫荧光技术可能掩盖实际存在的细胞数量，进而产生无生物学意义的表型。另一个需要严格控制的重要因素是实验小鼠的年龄，因为成年神经发生具有年龄依赖性22。最后，必须对每一部分进行无偏评分。为减少偏差，应采用系统化的方法，并确保评分人员能够熟练地利用形态学信息识别成年神经干细胞（NSC）发育的各个阶段。此外，应对对照组和处理组实行盲法评分，并在完成图像定量后再揭示其分组信息。为进一步减少偏差，可由两名独立的研究人员分别对同一数据集进行定量分析，以验证观察结果的可靠性。
<p class="jove_conten...

成年神经发生是指在成年个体中产生新神经元并将其整合到现有神经网络中的生物学过程1。在人类中，这一过程发生在海马体的齿状回（DG）区域，每天约有1,400个新细胞在此生成2。这些细胞位于DG的内层区域，该区域包含一个被称为颗粒下区（SGZ）的神经发生微环境。在此区域，海马体成年神经干细胞（NSCs）经历复杂的发育过程，最终转变为功能完整的神经元，参与调控特定的大脑功能，包括学习与记忆、情绪调节以及应激反应3,4,5,6。为了影响行为，成年NSCs受到多种外部刺激的高度调控，其调控方式具有活动依赖性，能够响应来自局部和远端的多种化学信号。这些化学信号包括神经递质和神经调质，它们以回路特异性的方式来自不同脑区。重要的是，这些化学信号在NSCs上的全回路汇聚，使得干细胞的激活、分化及命运决定得以实现独特而精确的调控。
在体内研究成体神经干细胞（NSCs）的环路调控，最有效的方法之一是将免疫荧光分析与全环路水平的干预手段相结合。免疫荧光分析是研究成体神经干细胞的常用技术，通过使用针对特定分子标志物的抗体，来指示成体神经干细胞所处的发育阶段。这些标志物包括：nestin，作为放射状胶质细胞和早期神经前体细胞的标志物；Tbr2，作为中间前体细胞的标志物；以及dcx，作为成神经细胞和未成熟神经元的标志物7。此外，通过给予胸腺嘧啶类似物（如BrdU、CldU、IdU和EdU），可以对处于S期的细胞群体进行单独标记和可视化观察8,9,10。结合这两种方法，可探讨一系列科学问题，从特定发育阶段中增殖过程的调控机制，到不同信号如何影响神经干细胞的分化及神经发生过程。
目前有多种方法可用于有效调控神经环路，包括电刺激、光遗传学和化学遗传学，每种方法都有其各自的优缺点。电刺激需要进行复杂的手术，将电极植入特定脑区，随后通过电极传递电信号以调控目标脑区。然而，该方法缺乏细胞和环路水平的特异性。光遗传学涉及递送编码光敏受体的病毒颗粒，并通过植入的光纤传递激光来激活该受体，但该技术需要大量操作，成本高昂，且手术复杂11。化学遗传学则涉及递送编码仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）的病毒颗粒，随后通过一种特定且生物学惰性的配体——氯氮平-N-氧化物（clozapine N-oxide, CNO）进行激活12。利用DREADDs调控调控成年神经干细胞（NSCs）的局部神经环路的优势在于CNO给药方式简便且途径多样，这使得实验操作更省时，减少对动物的干预，且易于适用于长期研究以调控神经环路。
本方案所述方法是一套综合性的实验流程，用于成功探究成年海马神经发生的环路调控机制，结合了免疫荧光技术与利用化学遗传学进行的神经环路操控。以下方案适用于在体内同时刺激或抑制一个或多个神经环路，以确定其对成年神经发生的调控功能。若研究问题不需要高时间分辨率，则该方法尤为适用。对于需要在特定频率下精确控制刺激/抑制时间的研究问题，光遗传学方法更为合适13,14。本文所述方法易于应用于长期研究，且对动物干预较少，尤其适用于应激因素为主要关注点的实验条件。

<table><tbody><tr><td>24 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Denville Scientific</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (Edu)</td><td>Carbosynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 叠氮化物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>抗鸡 Nestin 抗体</td><td>Aves</td><td>NES; RRID: AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>抗山羊 DCX 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Tbr2 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-4875-82; RRID: AB_11042577</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液 (Betadine 溶液)</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸储备液 [0.1 M]（21 g/L 柠檬酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>氯氮平-N-氧化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦软件 (Zen Black)</td><td>Zeiss Microscopy</td><td>Zen 2.3 SP1 FP1 (black)</td><td></td></tr><tr><td>五水合硫酸铜(II)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC197722500</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Denville Scientific</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>精密擦拭纸 (Kimwipes)</td><td>Kimtech Science</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 2 英寸针头</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 5 &amp;mu;L 型号 75 RN 注射器</td><td>Hamilton Company</td><td>Ref: 87931</td><td></td></tr><tr><td>高速钻机</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>输注泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>注射用生理盐水溶液</td><td>Mountainside Health Care</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD Ultra-Fine 胰岛素注射器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>小型动物立体定位仪</td><td>KOPF Instruments</td><td>Model 942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 切片机</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nair（脱毛产品）</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>带正电荷载玻片</td><td>Denville Scientific</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 软膏</td><td>Puralube</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 片式载玻片架</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>载玻片架支架</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>小型动物加热垫</td><td>K&amp;H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP 笔（4 mm 笔尖）</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液 (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>三钠柠檬酸储备液 [0.1 M]（29.4 g/L 三钠柠檬酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vet Bond 组织粘合剂</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

检测成年海马神经前体细胞的环路特异性调控

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

成年神经发生是一个动态过程，指齿状回（DG）颗粒下区（SGZ）中 newly activated 的神经干细胞（NSCs）生成新的神经元，这些新生神经元整合到已有的神经回路中，并参与特定的海马功能。重要的是，成年神经发生极易受到环境刺激的影响，从而实现对多种认知功能的活动依赖性调控。大量来自不同脑区的神经回路共同协调这些复杂的认知功能。因此，理解特定神经回路如何调控成年神经发生具有重要意义。本文介绍了一种利用仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）技术来操控神经回路活动的实验方案，该技术可用于调控啮齿类动物中的神经干细胞及其新生子代细胞。该综合性方案包括立体定位注射病毒颗粒、化学遗传学激活特定神经回路、胸腺嘧啶类似物给药、组织处理、免疫荧光标记、共聚焦成像以及对各阶段神经前体细胞的成像分析。本方案详细说明了用于可视化神经干细胞及其子代细胞的抗原修复技术，并描述了一种简单而有效的方法，即通过饮用含氯氮平-N-氧化物（CNO）的水或直接注射CNO，结合表达DREADDs的病毒，来调控脑内神经回路。该方案的优势在于其可适应性，可用于研究多种影响源自神经干细胞的成年神经发生的神经回路。

根据上述实验步骤（图1A、B），我们能够确定刺激齿状回（DG）对侧苔藓细胞投射对海马区神经发生微环境的影响。通过使用Cre依赖的Gq偶联刺激型DREADD病毒，并结合标记苔藓细胞的5-HT2A Cre小鼠品系，我们选择性地激活了苔藓细胞向对侧DG的兴奋性投射，结果表明强烈的苔藓细胞刺激促进了神经干细胞的静息状态（图1C）。在组织分析前，我们验证了病毒注射位置的准确性（图2A、B）。此外，我们通过c-fos免疫组织化学实验验证了苔藓细胞的激活（数据未显示）。若病毒注射位置不当，则应将该动物排除在后续分析之外。注射不当是指未能准确靶向目标坐标、大部分表达区域位于目标区域之外，或病毒递送量极少甚至没有。在本实验中，DG门区的苔藓细胞为预期靶点，若注射位置偏离门区，则予以排除。通过使用胸腺嘧啶类似物EdU，并按照第5.2和5.3节所述进行巢蛋白（nestin）染色的抗原修复，我们成功标记了正在增殖的神...

本实验方案的目的是描述一种用于分析成年神经干细胞/祖细胞在特定局部神经环路化学遗传学操控下行为反应的方法。

成年神经发生是一个动态过程，指齿状回颗粒下区（SGZ）中 newly activated 神经干细胞（NSCs）产生……

本方案可用于探究大脑中不同神经回路如何调控成体神经发生，特别是激活或抑制特定神经回路如何影响成体神经干细胞的增殖。该技术的优势在于能够特异性地靶向目标神经回路，同时减少对实验动物引入的应激反应。该方法有助于揭示不同脑区神经回路对成体神经发生的调控机制，尤其是释放特定神经递质的特定细胞类型如何调控成体神经干细胞的增殖。开始此操作时，将组织切片置于 PBS 中，并按从前往后的顺序，将五到八个切片依次贴附于带正电荷的载玻片上。让组织切片在室温下干燥两到五分钟，使其完全附着于载玻片上。接下来，在容器中配制柠檬酸盐缓冲液。将柠檬酸盐缓冲液放入微波炉中加热五分钟，直至溶液沸腾。在此期间，将贴附有组织切片的玻片放入玻璃玻片架中。五分钟后，小心地将装有切片的玻片架放入移液器盒中。将微波炉功率设置为50%，加热时间设置为七分钟。启动七分钟计时器，并观察溶液。当溶液开始沸腾时，停止微波加热；待沸腾停止后，继续微波加热。计时器结束时立即停止，即使微波炉的加热程序尚未完成。此步骤的目的是使水温保持在接近但低于沸点的水平，避免水过度沸腾。过度沸腾会导致组织切片从载玻片上脱落。然后，将装有柠檬酸盐缓冲液和组织切片的温盒转移至冰桶中冷却。盖上盒子，静置约30分钟，或直至溶液触感冰凉，再进行胸腺嘧啶类似物染色。若要使用胸腺嘧啶类似物对组织切片进行染色，需先将组织切片从柠檬酸盐缓冲液中取出。让组织切片干燥并完全贴附于载玻片上，然后用疏水笔画出边界。接着，用通透缓冲液对切片进行20至30分钟的通透处理。随后用TBS-吐温洗涤切片两次，每次五分钟。然后，配制 Edu 反应溶液。将切片置于 Edu 反应溶液中孵育 30 分钟至 1 小时。随后，用 TBS-吐温溶液洗涤三次，每次 5 分钟。用铝箔覆盖载玻片，或将其置于避光容器中，以在该步骤后避免光照。在此阶段，使用荧光显微镜检查 EdU 反应是否成功。若反应有效，应观察到 EdU 标记的细胞。现在，使用与二抗同种动物来源的封闭缓冲液对贴附的组织切片进行封闭，时间为30分钟至1小时。然后用TBS-吐温溶液洗涤两次，每次5分钟。在封闭期间，将一抗加入封闭缓冲液中，配制一抗溶液。随后，每张切片加入 250 微升一抗溶液，确保组织切片完全浸没，并在室温下孵育过夜。第二天，用 TBS-吐温溶液将组织切片洗涤三次，每次五分钟，以去除多余的一抗。然后，将组织切片在封闭缓冲液中配制的荧光标记二抗溶液中室温孵育两小时。用TBS-Triton溶液将组织切片清洗三次，每次五分钟，以去除多余的二抗。接着，在室温下用PBS稀释1:100的300微摩尔DAPI溶液孵育15分钟。随后，用PBS将组织切片清洗三次，每次五分钟，以去除多余的DAPI，并用棉签擦去组织周围的PAP笔画圈。让切片干燥，然后加入封片剂并盖上盖玻片。使用成像软件，将每个齿状回切片的图像以复合图像形式打开，各

assaying-circuit-specific-regulation-adult-hippocampal-neural

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成人希马神经前体细胞的乳化电路特定调节

神经干细胞取自成年非冬眠期一年生北极地松鼠（AGS）的海马体。这些神经干细胞可通过多次传代进行扩增，并可分化并维持为神经元与胶质细胞比例接近50:50的培养体系。...

成年北极地松鼠海马神经干细胞的生长与分化

本视频演示了利用EdU掺入法对脑组织切片中新生增殖的神经干细胞进行染色，随后通过免疫荧光技术可视化特定蛋白，以增强对细胞动态及增殖过程的理解。...

小鼠脑切片中增殖神经干细胞的免疫荧光染色可视化

在成年海马神经发生过程中，当静息态神经干细胞依次进展并发育为在神经环路中功能整合的神经元时，会表达一组独特的遗传标记。通过热诱导抗原修复技术，可更有效地识别那些原本难以检测的前体细胞类型。...

热诱导抗原修复：一种在成年海马神经发生过程中检测与鉴定前体细胞类型的高效方法

本文详细描述了一种从单只成年小鼠的脑室下区和齿状回同时生成神经前体细胞培养物的实验方案，该培养物可采用贴壁单层培养或神经球培养的形式。...

一只小鼠，两种培养：从单只小鼠的两个神经发生区分离与培养成年神经干细胞

本文介绍了一种用于研究海马发育过程中特定基因调控机制的实验方案。通过采用 子宫外...

Ex Utero 电穿孔与小鼠海马组织的器官型切片培养

本视频文章展示了一种全面的实验方案，可在同一组织切片中检测并定量成年海马神经发生的各个阶段。我们改进了一种方法，以克服在无法获得来自不同宿主物种的合适抗体时，间接多重免疫荧光技术所存在的局限性。...

使用同源物种抗体进行免疫组织化学与多重标记以研究成年海马神经发生

我们报告了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠脑的脑室下区（SVZ）分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞。该方法应用于荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）转基因小鼠时，可实现通过活细胞成像来研究细胞周期进程。...

成年小鼠侧脑室下区神经干细胞与前体细胞的分选及细胞周期动态的活体成像

犬脑是研究成年神经发生的宝贵模型。本文介绍了从原代脑组织中分离和扩增成年犬海马神经前体细胞的实验方案。...

成年犬海马神经前体细胞的分离与扩增

冷冻切片显微切割技术可对小鼠大脑中最大的神经发生微环境进行新鲜冷冻制备，用于深度定量蛋白质组学分析。该方法精确、高效，且对组织扰动极小，因此非常适用于研究该微环境以及其他器官、区域和物种的分子微环境。...

成年小鼠室管膜下区冷冻切片显微解剖用于精确深度定量蛋白质组分析

本文介绍一种对小鼠齿状回中分离的单个细胞核进行测序的方法，该方法通过荧光激活细胞核分选（FAN-分选）排除大多数神经元。该方法可获得高质量的表达谱，有助于研究该微环境中存在的大多数其他细胞类型，包括数量稀少的细胞群体，如神经干细胞。...

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

本文介绍了一种工程化化学重编程干细胞的方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，移植到帕金森病小鼠模型中，并评估其行为学和电生理学结果，以验证移植细胞的成功整合及其功能有效性。...

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

了解化学遗传学技术调控特定神经环路对成年神经干细胞增殖的影响。本方法结合组织切片、免疫荧光染色和显微成像，可精确量化神经发生过程，为研究脑环路如何调节成体神经发生提供可靠方案。

检测成年海马神经前体细胞的环路特异性调控

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