Name: 慢病毒载体平台, 用于将表观基因编辑工具高效地传递到人类诱导的多能干细胞衍生疾病模型中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 了解慢病毒载体平台用于CRISPR-dCas9-DNMT3A表观基因组编辑的方法，该技术可在人类诱导多能干细胞衍生神经元中实现基因表达的精细调控，为神经退行性疾病研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分由Kahn神经技术发展奖（授予O.C.）和美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）（R01 NS085011，授予O.C.）资助。

<ol><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+the+epigenome%3A+technologies+for+programmable+transcription+and+epigenetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation.</a> Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Horlbeck, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosomes+impede+Cas9+access+to+DNA+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li>
<li>Holtzman, L., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+the+Epigenome%3A+Reshaping+the+Genomic+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+and+tunable+human+gene+activation+by+combinations+of+synthetic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>McDonald, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogrammable+CRISPR%2FCas9-based+system+for+inducing+site-specific+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation.</a> Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+epigenome+editing+using+CRISPR-Cas+SunTag-directed+DNMT3A%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A.</a> Genome Biology. 18 (1), 176(2017).</li>
<li>Vojta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+the+CRISPR-Cas9+system+for+targeted+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).</li>
<li>Razin, A., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+epigenetic+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in epigenetic control of gene expression.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).</li>
<li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+SNCA+Expression+by+Targeted+Editing+of+DNA+Methylation%3A+A+Potential+Strategy+for+Precision+Therapy+in+PD%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD.</a> Molecular Therapy. , (2018).</li>
<li>Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+regulates+alpha-synuclein+expression+and+is+decreased+in+Parkinson%27s+disease+patients%27+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+methyltransferase+inhibitor%2C+5-aza-2%27-deoxycytidine%2C+exacerbates+neurotoxicity+and+upregulates+Parkinson%27s+disease-related+genes+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).</li>
<li>Matsumoto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+demethylation+enhances+alpha-synuclein+expression+and+affects+the+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> PLOS One. 5 (11), e15522(2010).</li>
<li>Desplats, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+sequesters+Dnmt1+from+the+nucleus%3A+a+novel+mechanism+for+epigenetic+alterations+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).</li>
<li>Ai, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomethylation+of+SNCA+in+blood+of+patients+with+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease.</a> Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).</li>
<li>Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+SNCA+gene+expression%3A+implications+to+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies.</a> Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).</li>
<li>Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).</li>
<li>Tagliafierro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+alpha-synuclein+3%27+untranslated+region+and+its+corresponding+microRNAs+in+relation+to+Parkinson%27s+disease+compared+to+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies.</a> Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).</li>
<li>Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+the+SNCA+locus+exacerbates+neuronal+nuclear+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging.</a> Human Molecular Genetics. , (2018).</li>
<li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+involving+CNS+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical applications involving CNS gene transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li>
<li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).</li>
<li>Vijayraghavan, S., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Production+of+Integrase-deficient+Lentiviral+Vectors+for+CRISPR%2FCas9-mediated+Gene+Knockout+in+Dividing+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56915(2017).</li>
<li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li>
<li>Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bisulfite pyrosequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).</li>
<li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9.</a> Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li>
<li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li>
<li>Goffin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+in+the+pol+gene+intragenic+regulatory+region+of+HIV-1+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted%2C+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).</li>
</ol>

杜克大学已就本研究提交了临时专利申请。

慢病毒载体（LVs）已逐渐成为表观基因组编辑的首选载体，尤其是在遗传性疾病领域，这主要归因于其具备以下两个优势：（i）能够容纳较大的DNA载荷；（ii）可高效转导多种分裂和非分裂细胞。LVs较高的包装效率在包装CRISPR/dCas9系统时尤为有利，因为这些系统体积较大。从这一角度来看，LVs是递送一体化CRISPR/Cas9系统的理想平台。事实上，常用于临床前和临床基因治疗的腺相关病毒（AAV）平台，难以完全容纳dCas9-效应蛋白系统的较大包装尺寸。实际上，AAV载体严格的包装容量限制阻碍了其在递送CRISPR/dCas9组件中的应用。为提高AAV的包装能力，已开发出多种新型基于AAV的平台。例如，最近构建了一种分裂型内含肽（split-intein）策略，将Cas9系统拆分为两个AAV载体38。该策略提高了整体包装容量，但需要同时生产和共转导两个AAV载体38。源自Staphylococcus aureus的SaCas9的发现，推动了SaCas9/向导RNA系统的开发39...

近年来已开发出多种表观基因组编辑平台，可用于靶向调控基因表达区域中的任意DNA序列1，2。所构建的表观基因组编辑工具旨在实现以下功能：（i）调控转录，（ii）改变组蛋白翻译后修饰，（iii）修饰DNA甲基化，以及（iv）调节调控元件间的相互作用。将转录/染色质修饰因子锚定于失活的Cas9（dead Cas9, dCas9）的方法，源于此前开发的表观基因组编辑平台，例如锌指蛋白（ZFPs）和转录激活因子样效应物（TALEs），这些平台包含一个强效的转录效应结构域（ED），并与设计的DNA结合结构域（DBD）融合3。期望获得的表型结果（如激活或抑制）由锚定在内源位点的效应分子决定（图1）。为构建可编程的转录激活子，dCas9/gRNA模块被连接至VP164，5，6（图1A），这是一种病毒激活结构域，可招募RNA聚合酶II及通用转录机器。对该系统的改进包括使用VP64（VP16结构域的四聚体），可实现更强的激活效率5，6。该系统已成功用于通过靶向启动子和调控元件来激活编码区和非编码区。重要的是，尽管VP64分子并不直接改变靶区域的染色质结构，但它能招募染色质修饰因子，导致活性染色质（常染色质）标志的沉积，包括H3/H4乙酰化以及H3-K4二/三甲基化5，6。除VP64外，人源NF-κB复合物的p65亚基也被连接至dCas9/gRNA模块7。有趣的是，将这些效应分子锚定在转录起始位点（TSS）上游区域及启动子内部时，可引发强烈的基因诱导。然而，VP64和p65效应分子即使连接在TSS下游区域或远端增强子上，也能发挥激活作用7，8。为了引发更强的转录响应，需要将多个dCas9-VP64或dCas9-p65融合蛋白招募至单一靶位点9，10。因此，新一代激活子的开发——例如SunTag系统，可通过单个dCas9-gRNA复合物招募多个效应结构域——相比dCas9-VP64融合蛋白表现出更强的激活能力11，12。通过将VP64、p65和来自γ-疱疹病毒的转录激活结构域Rta（VPR）融合至dCas9的C末端，进一步提升了转录激活效率13（图1A）。类似地，已开发出用于靶向特异性抑制的CRISPR/dCas9系统（图1B）。
通过多种机制，可利用工程化的阻遏蛋白融合体实现内源基因的抑制（图1B）。已有研究表明，CRISPR/dCas9系统与阻遏蛋白DNA结合域（DBD）相连后（即使不含效应结构域），当其锚定于启动子或转录起始位点（TSS）的上游/下游区域时，能够有效沉默基因表达3,6,14。这种对转录的抑制作用源于其对转录因子结合及RNA聚合酶进程的空间位阻效应。然而，仅依赖空间位阻的基因抑制往往不足以实现强效沉默，因此需要更全面的策略。近年来，基于CRISPR/dCas9系统并携带转录阻遏结构域（TRDs）、组蛋白修饰酶（如H3-K9二/三甲基化、H3-K27二/三甲基化、H3-K36二/三甲基化、H3/H4去乙酰化）以及DNA（CpG）甲基化酶的新一代抑制系统相继被开发，由此构建出的表观遗传工具可实现更强效的基因沉默效果4,5,15,16,17,18,19,20。已有研究证实，将这些表观遗传修饰因子招募至特定DNA区域可促进形成更为紧密和凝缩的染色质结构，通常由此产生更强的基因沉默效应21,22。目前与DBD最常联合使用的抑制结构域是Krüppel相关盒（KRAB）4,5。已有研究显示，该因子的招募与染色质状态改变相关；然而，这些修饰的具体作用机制仍有待阐明16,17,18。最近研究发现，KRAB在DNA上的定位可促进组蛋白甲基转移酶SETDB1以及组蛋白去乙酰化（HDAC）NuRD复合物的组装，提示这些相互作用可能介导了染色质凝缩和转录沉默的形成3,13。作为另一种策略，可将效应结构域与DBD融合，从而构建定制化的表观遗传沉默蛋白。该系统可直接催化产生抑制性DNA标记或组蛋白修饰。
近期，研究人员重新利用了与DNMT3A酶连接的合成CRISPR/dCas9系统，用于转录抑制。DNMT3A催化DNA甲基化，通过在内源性基因启动子及其他调控区域形成异染色质，从而实现转录抑制（图1B）18,20。McDonald等18和Vojta等20首次报道了DNA甲基化可用于表观基因组层面的基因沉默或抑制，证明质粒递送的dCas9-DNMT3A融合系统可显著增强转录起始位点（TSS）周围的胞嘧啶甲基化18,20。McDonald及其同事表明，采用该策略可能导致抑癌基因CDKN2A的mRNA水平显著降低（约40%）18。类似地，靶向BACH或IL6ST基因的非甲基化启动子区域，可观察到CpG甲基化水平升高，并与基因表达量下降两倍相关20。我们实验室最近将DNA甲基化技术重新用于缓解SNCA基因过表达引起的病理后果（图2）23。该策略基于选择性增强SNCA基因第一内含子区域的DNA甲基化，因为此前已有研究报道该区域在帕金森病（PD）及路易体痴呆（DLB）患者脑组织中呈现低甲基化状态24,25,26。这种低甲基化状态与SNCA基因过表达相关，因此成为极具吸引力的治疗干预靶点24,27,28。我们近期在源自携带SNCA基因三倍体帕金森病患者的hiPSC分化而来的多巴胺能神经前体细胞（NPCs）中，观察到SNCA第一内含子区域的DNA甲基化水平较低23。该实验模型的优势在于，NPCs可在体外稳定扩增，或进一步分化为成熟神经元，从而高效筛选介导细胞表型（包括氧化应激和细胞凋亡）的遗传因素29。此外，该模型系统使科研人员能够重现患者症状出现前的发育过程。同时，hiPSC来源的NPCs也是研究基因表达相关细胞与分子通路的有力工具。尤为重要的是，结合前沿的CRISPR/Cas9-表观基因组技术，hiPSC来源的NPCs可极大推动多种神经退行性疾病“下一代药物”的研发。
为了降低 SNCA 的病理性表达水平，我们近期开发了一种基于慢病毒的系统，该系统携带 dCas9-DNMT3A 融合蛋白和 gRNA，可特异性靶向 SNCA 内含子 1 区域内的 CpG 甲基化（图 2A）23。本实验方案将详细描述慢病毒载体（LV）的设计与制备过程。慢病毒载体在递送 CRISPR/dCas9 组分方面具有多种优势，因而是一种高效的方法，主要包括：（i）能够携带较大的 DNA 插入片段，（ii）对多种细胞类型（包括分裂和非分裂细胞）具有高效的转导效率30，以及（iii）诱导的细胞毒性和免疫原性反应极小。近期，我们将该慢病毒系统应用于携带 SNCA 基因座三倍重复的帕金森病（PD）患者来源的 hiPSC 分化多巴胺能神经元，并证实了慢病毒载体在递送表观基因组编辑甲基化工具方面的治疗潜力23（图 2B）。事实上，LV-gRNA/dCas9-DNMT3A 系统可显著增加 SNCA 内含子 1 区域的 DNA 甲基化水平，这一变化伴随着 SNCA mRNA 和蛋白表达水平的降低23。此外，SNCA 表达下调可挽救由 SNCA 三倍重复的 hiPSC 分化多巴胺能神经元所表现出的帕金森病相关表型（例如线粒体活性氧产生和细胞活力）23。重要的是，我们已证实，通过 LV-gRNA-dCas9-DNMT3A 系统降低 SNCA 表达，能够逆转携带 SNCA 三倍重复的帕金森病患者来源的 hiPSC 分化多巴胺能神经元的特征性表型，如线粒体活性氧产生和细胞活力异常23。本实验方案的目标是：1）概述一种优化的慢病毒平台的制备与浓缩方案，以生成高滴度的病毒制剂；2）描述将 hiPSCs 分化为具有特定模式的神经前体细胞（NPCs），并进一步诱导其成熟为多巴胺能神经元31,32，以及对 SNCA 内含子 1 靶向区域甲基化水平的检测与分析。
慢病毒载体平台相较于目前最常用的腺相关病毒载体（AAVs）具有一个主要优势，即前者能够容纳更大的基因插入片段33,34。尽管AAVs的制备产量显著更高，但其包装容量较低（&#60;4.8 kb），限制了其在递送一体化CRISPR/Cas9系统中的应用。因此，在递送CRISPR/dCas9工具的相关应用中，慢病毒载体（LVs）似乎是首选平台。因此，本文所述的实验方案将为希望有效递送表观基因组编辑组分至细胞和器官的研究人员提供一种有价值的工具。该方案进一步阐述了通过顺式修饰载体表达盒内的元件，以提高载体产量和表达能力的策略30,35。该策略基于本实验室开发和研究的新型系统，并突显其能够产生高达1010病毒单位（VU）/mL的病毒颗粒的能力30,35。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;u&gt;仪器设备&lt;/u&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;M 滤器单元，1 L</td><td>康宁</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>0.45-&amp;mu;m 滤膜装置，500 mL</td><td>康宁</td><td>430773</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养处理培养皿</td><td>康宁</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>康宁</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 细胞培养皿（经TC处理，带20 mm网格）</td><td>康宁</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>康宁</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>康宁</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 800</td><td>StemCell Technologies</td><td>34811</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R 台式离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>圆锥底超速离心管</td><td>Seton Scientific</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>锥形管适配器</td><td>Seton Scientific</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 细胞成像载玻片</td><td>Eppendorf</td><td>30742060</td><td></td></tr><tr><td>高结合力96孔板</td><td>康宁</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>可逆过滤器</td><td>StemCell Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti 转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; 一次性血清移液管，玻璃，无热原</td><td>VWR</td><td>93000-694</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; 真空过滤系统</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>xMark&amp;trade; 微孔板吸光度读板仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;u&gt;细胞培养试剂&lt;/u&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人胚胎肾293T（HEK 293T）细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>抗黏附冲洗液</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>抗FOXA2抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab60721</td><td></td></tr><tr><td>抗Nestin抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab18102</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液，100倍浓缩液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9879 - BES</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分（7.5% 溶液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>StemCell Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-合格基质</td><td>康宁</td><td>08-774-552</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>12-719</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect PCR 对照 DNA 套件</td><td>Qiagen</td><td>596945</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA甲基化试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>温和细胞解离试剂</td><td>干细胞技术</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>人重组bFGF</td><td>StemCell Technologies</td><td>78003</td><td></td></tr><tr><td>人源重组&amp;nbsp;EGF</td><td>StemCell Technologies</td><td>78006</td><td></td></tr><tr><td>人重组Shh（C24II）</td><td>StemCell Technologies</td><td>78065</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>StemCell Technologies</td><td>72232</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff&amp;nbsp;神经诱导培养基</td><td>StemCell Technologies</td><td>5835</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 神经前体细胞冻存培养基</td><td>StemCell Technologies</td><td>5838</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 检测 FOXA2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Hs00232764</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 检测 GAPDH</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Hs99999905</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 检测 巢蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Hs04187831</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 检测 OCT4</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Hs04260367</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 检测 PPIA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Hs99999904</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>StemCell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;u&gt;p&lt;sup&gt;24&lt;/sup&gt; ELISA 试剂&lt;/u&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗-p&lt;sup&gt;24&lt;/sup&gt; 抗体</td><td>美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔辣根过氧化物酶IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12-348</td><td>工作浓度 1:1500</td></tr><tr><td>山羊血清，无菌，10 mL</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>工作浓度 1:1000</td></tr><tr><td>HIV-1 标准品</td><td>美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>正常小鼠血清，无菌，500 mL</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>多克隆兔抗-p&lt;sup&gt;24&lt;/sup&gt; 抗体</td><td>美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>TMB 过氧化物酶底物</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>工作浓度 1:10,000</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;u&gt;质粒&lt;/u&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;u&gt;限制性内切酶&lt;/u&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的细胞是研究人类神经退行性疾病的一种重要方法。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，用于将携带α-突触核蛋白基因（SNCA）位点三倍重复的患者来源的hiPSCs，定向分化为与帕金森病（PD）相关的多巴胺能神经元群体。越来越多的证据表明，SNCA 的高水平表达是导致帕金森病发生的原因之一。鉴于目前尚缺乏针对PD的新型治疗方法，尤其是能够调控SNCA表达水平的策略，我们近期开发了一种基于CRISPR/dCas9-DNA甲基化的系统，通过在SNCA第一内含子调控区富集甲基化水平，从而实现对SNCA转录的表观遗传调控。该系统采用慢病毒载体递送，其中包含一种失活的Cas9蛋白（dCas9）与DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）催化结构域的融合蛋白。该系统应用于SNCA位点三倍重复的细胞后，可通过靶向SNCA第一内含子的DNA甲基化，使SNCA-mRNA和蛋白水平降低约30%。这种精细调控的SNCA表达下调能够挽救与疾病相关的细胞表型。在本实验方案中，我们旨在详细描述将hiPSCs分化为神经前体细胞（NPCs）的逐步操作流程，以及建立和验证用于评估SNCA第一内含子甲基化谱的焦磷酸测序分析方法。为进一步阐明本研究中所使用的慢病毒-CRISPR/dCas9系统，本方案还介绍了慢病毒载体的制备、纯化与浓缩方法，并强调其在利用hiPSCs和NPCs进行表观基因组和基因组编辑应用中的适用性。该方案具有良好的可扩展性，可用于制备高滴度慢病毒，适用于体外和体内实验。

与原始 GFP 对照相比，LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro 载体生产滴度的验证
我们通过p24gag ELISA比较了LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro与原始GFP/Puro病毒的物理滴度。如图5A所示的代表性结果表明，采用本方案所制备的载体其物理产量相当。这说明优化后的载体骨架结合优化的生产流程，能够实现CRISPR/dCas9载体的高产量滴度。为了评估dCas9-DNMT3A转基因包装进入病毒颗粒的效率，我们将浓缩后的载体转导至HEK-293T细胞中（图5B）。然而，图5A所示结果表明，LV-dCas9-DNMT3A-GFP载体的转导率显著低于原始GFP载体（<strong class=...

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。

利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的细胞是研究人类神经退行性疾病的一种重要方法。本文中，我们描述了一种优化的方案，用于……

慢病毒载体平台相较于最常用的载体平台具有显著优势，特别是因为慢病毒载体能够容纳较大的基因插入片段。因此，在递送CRISPR/Cas工具的应用中，慢病毒载体似乎是首选平台。该技术模拟了α-突触核蛋白表达的天然调控机制，而该机制受损时与疾病相关。它能够在基因表达水平上进行精细调控，而非引起基因表达的剧烈变化。我强烈建议在筛选过程中使用多个向导RNA来验证该方法或类似方法的有效性，因为向导RNA的效率存在很大差异。确定其存在的唯一方法是进行系统、全面的筛选与验证。所开发的系统可轻松适用于其他模型系统，例如包括啮齿类和非人灵长类在内的动物模型。这些后续实验可为未来的临床研究提供概念验证。本次实验操作将由我实验室的高级职员Ekaterina Ilich博士演示，她主要负责本项目相关的慢病毒载体质粒的分子克隆实验步骤。她还将演示慢病毒载体生产中的关键步骤。此外，我实验室专注于将人诱导多能干细胞分化为具有病理相关性细胞的博士后Lidia Tagliafierro博士也将参与实验操作的演示。她将演示建立用于评估α-突触核蛋白内含子1甲基化谱的关键步骤。Ahila Sriskanda 是我实验室的一名工作人员，专注于人源iPS细胞衍生的神经前体细胞的培养。首先，通过扩增载体中的 DNMT3A 片段，从 d-Cas9-DNMT3A-GFP 中获取 DNMT3A 催化结构域。用BamH1限制性内切酶消化DNMT3A片段后，将其连接至携带d-Cas9的修饰型PBK-301载体的BamH1位点，并通过直接Sanger测序验证，以替换纯合的Meissen报告基因，获得含有GFP消化产物的d-Cas9-DNMT3A-P2A纯合Meissen质粒及含有FSC 1的质粒。采用凝胶纯化方法纯化载体片段。通过用 FSC-1 酶切 PBK-201 来制备插入片段。将 FSC-1 片段克隆至载体中，以构建 d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP。用 0.2% 明胶包被 15 厘米培养皿用于转染，并静置 10 分钟。然后吸除明胶，加入22.5毫升高糖培养基和2.5毫升预先培养的HEK-293T细胞悬液。将培养板置于37°C、5%CO₂条件下培养，直至细胞融合度达到70%至80%。为制备适用于115厘米培养皿的质粒混合物，请使用文中所述的四种质粒。向含有质粒的同一支15毫升离心管中加入312.5 µL的一摩尔氯化钙，并用无菌双蒸水将终体积调至1.25 mL。在涡旋振荡的同时，缓慢逐滴加入1.25 mL的2× BBM溶液。室温孵育30分钟。吸去细胞中的培养基，加入 22.5 毫升新鲜配制的无血清高糖 DMEM 培养基。将 2.5 毫升转染混合物逐滴加入每块培养板中。轻轻摇晃培养板，于 37°C、5%CO₂ 条件下孵育 2 至 3 小时；孵育后，每孔加入 2.5 毫升血清，使血清终浓度达到 10%，然后于 37°C、5%CO₂ 条件下过夜孵育。收集病毒时，从所有转染的细胞中收集上清液，并将其合并至50毫升锥形管中。在室温下以400至450 ×g离心10分钟，然后通过0.45微米真空滤器过滤上清液。接下来，通过制备锥形超速离心管来构建蔗糖梯度。将过滤后的上清液小心地加入梯度液中，将病毒上清液等量分配至各超速离心管中，每管填充体积至少达到四分之三。在17°C条件下，以70000 g离心两小时。轻柔收集30%至60%的蔗糖组分至洁净离心管中，加入冷的1×PBS缓冲液，使总体积达到100毫升，并反复吹打混匀。向每支试管中小心加入 4 毫升含 20% 蔗糖的 1×PBS，以进行病毒制剂的密度分层，随后每管用移液器加入约 20 至 25 毫升病毒溶液。小心平衡试管，然后在 17°C 下以 70000 ×g 离心 2 小时。小心吸除残留液体，彻底去除所有液体，留下含有病毒的沉淀，这些沉淀通常仅表现为微小的半透明斑点，几乎不可见。弃去上清液后，将离心管倒置于纸巾上，使残留液体充分沥干。向第一支离心管中加入70 µL 1× PBS，用移液器充分吹打以重悬沉淀。将悬液转移至下一管，重复吹打和转移操作，直至所有沉淀均被重悬。向第一管中再加入 50 µL 1× PBS，混匀以进行洗涤。然后将悬液转移至第二管中进行洗涤，并按照前述方法继续洗涤和转移，最终得到约 120 µL 略带乳光的终末悬液。在 10000 ×g 离心 60 秒，获得澄清悬液后，将上清液转移至新管中，分装成每份 5 µL 的等份，于 -80 °C 保存。取一支含有 MD NPC 的冻存管，置于 37 °C 金属浴中加热 2 分钟，将解冻后的细胞转移至含 10 mL 预热的 DMEM-F12 培养基的 15 mL 圆锥形离心管中。在300 ×g条件下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于2毫升预热的完全N2B2培养基中。向细胞悬液中加入2毫升N2B27，然后将2毫升细胞悬液接种至先前准备好的BMM编码六孔板的每个孔中。将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。当MD NPCs达到70%融合度时，加入两微升慢病毒引导RNA d-Cas9-DNMT3A载体进行转导，并轻轻摇晃培养板。转导后48小时，在相同条件下继续孵育16小时，然后更换N2B27培养基。加入N2B27培养基，并添加5微克/毫升的纯Meissen，以获得稳定的MD NPC细胞系；在N2B27培养基中加入纯Meissen，培养细胞三周，以鉴定SNCA内含子1的甲基化谱型。首先使用DNA提取试剂盒从各稳定转导细胞系中提取DNA，然后取800纳克DNA，利用市售试剂盒进行亚硫酸氢盐转化，再将亚硫酸氢盐转化后的DNA稀释至20纳克/微升。进行焦磷酸测序分析时，在无核酸酶的离心管中配制PCR预混液，将反应板转移至热循环仪，并启动PCR程序。使用30和溴化物染色，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增子进行可视化分析，取两微升PCR产物进行检测。对于焦磷酸测序实验，使用亚硫酸氢盐转化后的非甲基化与甲基化DNA混合物以及焦磷酸测序试剂，具体操作详见论文描述。使用焦磷酸测序软件计算每个CpG位点的甲基化水平。采用本方案生成的Lentivirus d-Cas9-DNMT3A-GFP载体与Naive GFP载体的慢病毒物理产量相当。这表明，优化后的载体骨架与优化的生产方案相结合，可实现较高的产量，且CRISPR-dCas9载体的转导效率更稳定。Lentivirus d-Cas9-DNMT3A-GFP载体的转导效率比Naive GFP载体低四倍，提示CRISPR d-Cas9-RNA的包装效率有所降低。Naive PURO载体的转导效率比d-Cas9-DNMT3A载体高五倍。这些结果通过使用Naive GFP和d-Cas9-DNMT3A-GFP进一步得到验证。本文所述基于EB的方案可实现中脑神经前体细胞（MD NPC）的分化。hiPSCs表达多能性标志物Oct4，而中脑神经前体细胞则同时表达Nestin和FoxA2。针对SNCA内含子1区域的甲基化状态分析，共设计并验证了七种焦磷酸测序检测方法。所有7种检测均经过验证，并显示出线性相关性；利用这些经过验证的检测方法，可以确定 SNCA 内含子1中23个CpG位点的甲基化水平。进行该实验时最重要的是使用生长状态良好且健康的细胞，以确保实验间结果的一致性。本演示中所强调的慢病毒载体的制备方法，可轻松应用于整合缺陷型抗病毒载体的生产，同时也可轻松放大以生成更大量或更高浓度的载体。该技术可为探索基因失调在年龄相关性神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病及相关痴呆症）中的致病影响提供途径。此处开发的慢病毒载体的优点在于其无危害性且不具备感染性，对细胞周期的影响极小，是一种安全可靠的基因治疗递送平台。

lentiviral-vector-platform-for-efficient-delivery-epigenome-editing

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

慢病毒载体平台, 用于将表观基因编辑工具高效地传递到人类诱导的多能干细胞衍生疾病模型中

来源：Tagliafierro, L.，等．用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台．J. Vis. Exp.

慢病毒转导神经前体细胞以调控α-突触核蛋白表达的表观遗传机制

本文介绍了一种利用附加体型重编程策略及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从外周血中生成人诱导性多能干细胞的实验方案。...

利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

通过TALEN介导的基因编辑技术对安全港AAVS1位点进行操作，可在人诱导多能干细胞（iPSCs）中实现高效的外源基因插入。本实验方案详细描述了为TALEN系统和供体质粒递送而准备iPSCs、转染iPSCs，以及筛选和分离iPSC单克隆细胞系的操作步骤，以实现绿色荧光蛋白（GFP）基因的靶向整合，从而构建报告细胞系。...

人类诱导性多能干细胞中利用TALEN技术将GFP基因靶向AAVS1安全位点的转染、筛选与克隆挑取

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。...

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

人类多能干细胞（hPSCs）的基因组编辑可以快速高效地完成。本文展示了一种可靠的实验方案，以编辑AAVS1安全港位点以表达EGFP并引入抗生素抗性为例，对hPSCs进行基因工程改造。...

基因编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

我们介绍了整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLVs）的制备策略，该载体可用于向细胞递送CRISPR/Cas9系统。IDLVs能够快速高效地介导细胞基因编辑，与具有整合酶活性的载体相比，其作为一种基因递送载体平台具有更高的安全性，且编辑效率相当。...

一种用于在分裂细胞中通过CRISPR/Cas9介导基因敲除的整合酶缺陷型慢病毒载体的制备方案

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

利用低成本的阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI），我们高效地制备了用于在H9人胚胎干细胞（hESCs）中稳定表达shRNA的慢病毒颗粒，并实现了对H9来源的神经前体细胞（NPCs）的高效瞬时转导。...

利用低成本阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）通过慢病毒介导将shRNA递送至人胚胎干细胞和神经前体细胞

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

了解慢病毒载体平台用于CRISPR-dCas9-DNMT3A表观基因组编辑的方法，该技术可在人类诱导多能干细胞衍生神经元中实现基因表达的精细调控，为神经退行性疾病研究提供可靠工具。

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

探索更多视频