慢病毒载体平台, 用于将表观基因编辑工具高效地传递到人类诱导的多能干细胞衍生疾病模型中

伦蒂病毒向量平台比最流行的向量平台有一个主要优势，特别是由于伦蒂病毒载体能够容纳更大的基因插入。因此，扁病毒载体似乎是应用的首选平台，涉及CRISPR/Cas工具的交付。该技术模仿α-核素表达的自然调节机制，当受损时与疾病相关。

它允许微调表达水平与基因表达的强健变化。我强烈建议使用多个指南 RNA 进行筛选验证此或类似方法。导向RNA效力存在很大变异性。

确定它的唯一方法就是有强大而全面的筛选和验证。开发系统可以很容易地适应其他模型系统，如动物模型，包括啮齿动物和非人类灵长类动物。这些后续实验可以作为未来临床研究的概念证明。

演示该程序将是叶卡捷琳娜·伊利希博士，一个高级工作人员在我的实验室，专注于执行分子克隆程序，以创建与该项目相关的伦蒂病毒向量质粒。她还将演示伦蒂病毒向量生产中涉及的关键步骤。演示该程序还将是Lidia Tagliafierro博士，一个博士后从我的实验室专注于人类 iPS 细胞分化到病理相关细胞。

她将演示建立测定的关键步骤，以评估合成素内创的甲基化特征1。阿希拉·斯里坎达，我实验室的工作人员，专注于人类 iPS 细胞衍生神经祖细胞的培养。首先，通过放大载体的DNMT3A部分，从d-Cas9-DNMT3A-GFP开发DNMT3A催化域。

使用 BamH1 限制性酶消化 DNMT3A 片段后。将其放入带 d-Cas9 的经过修改的 PBK-301 载体的 BamH1 站点，通过直接桑格测序进行验证，用 FSC 1 替换纯美森报告基因和生成的质粒，以 GFP 消化 d-Cas9-DNMT3A-P2A 纯美森和质粒。使用凝胶纯化方法净化载体片段。

使用 FSC-1 消化 PBK-201 来准备刀片。将 FSC 1 片段克隆到矢量中以创建 d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP。涂15厘米板与0.2%明胶的转染，并等待10分钟。

然后吸气明胶，加入22.5毫升的高葡萄糖介质和2.5毫升以前培养的 HEK-293T 细胞悬浮液。在37摄氏度下用5%CO2孵育板，直到达到70至80%的汇合。要准备足够 115 厘米板的质粒混合，请使用手稿中描述的四个质粒。

将 312.5 微升的一摩尔氯化钙加入与质粒相同的 15 毫升管中，并使用无菌双蒸馏水将最终体积达到 1.25 毫升。轻轻添加 1.25 毫升的两个 X BBM 溶液下降到管明智， 而漩涡。在室温下孵育30分钟。

从细胞中吸出该介质，加入22.5毫升新鲜准备好的高葡萄糖DMEM，无需血清。在每个板中加入2.5毫升的转染混合物。在37摄氏度下用5%CO2孵育，孵育后两到三个小时，每板加入2.5毫升血清，在37摄氏度下达到10%稀释，在5%CO2下孵育。

要收获病毒，从所有转染的细胞中收集上流液，并在50毫升锥形管中拉取。在室温下以 400 至 450 g 的离心机 10 分钟，然后通过 0.45 微米真空过滤器单元过滤上清液。接下来，通过制备锥形超离心管创建蔗糖梯度。

小心地将过滤的上清液添加到梯度中，将病毒上清液在每个超离心管中均匀分布，每个管的填充至少四分之三。在17摄氏度下以70000克离心样品两小时。轻轻地将 30% 至 60% 蔗糖馏分收集到干净的管中，加入冷 1X PBS 至总体积 100 毫升，并多次混合移液器。

在每个管中小心地将四毫升 20%蔗糖加入到每个管中，通过每管将大约 20 到 25 毫升的病毒溶液移液，使病毒制剂继续分层。小心平衡管，然后在70000g下离心2小时，温度为17摄氏度。小心吸走剩余的液体，以完全去除所有液体离开含有颗粒的病毒，这些颗粒几乎看不到小半透明斑点。

排空后，上清液倒置纸巾上的管子，让剩余的液体排出。将 70 微升 1X PBS 添加到第一管中，并彻底移液器以重新悬浮颗粒。将悬浮液转移到下一管，并重复移液和转移，直到所有颗粒重新悬浮。

将额外的 50 微升 1X PBS 添加到第一管中，混合洗涤。然后将悬浮液转移到第二管清洗，并继续像以前一样清洗和转移，产生约120微升的微乳最后悬浮液。在10000 g的离心机60秒，以获得一个明确的悬浮将上清液转移到一个新的管，使5微升等分，并储存在负80摄氏度的克里维亚尔与MD NPC到37摄氏度热块两分钟，并转移解冻的细胞到15毫升锥形管与10毫升温暖的DMEM-F12。

在300克下离心5分钟。吸升液，并在预热完整N2B2介质的两毫升中重新悬浮细胞。将两毫升 N2B27 添加到细胞悬浮液中，并在先前准备的 BMM 编码的六井板的每个井中加入两毫升的细胞。

在37摄氏度下孵育细胞，在一夜之间用5%的二氧化碳孵育。当MD NPC处于70%汇合时，通过添加两微升的扁病毒导引RNA d-Cas9-DNMT3A载体来换乘它们，然后轻轻地旋转板。在相同条件下孵育细胞16小时后，在转导后48小时更换N2B27介质。

加入N2B27与5微克每毫升纯美森获得稳定的MDNPC线，生长细胞三个星期在N2B27加上纯美森，以特征SNCA intron 1的甲基化配置文件。首先使用DNA提取试剂盒从每个稳定的传感器细胞系中提取DNA，然后使用800纳米的DNA图使用市售试剂盒进行双硫化物转化，然后用双硫化物将DNA转换为每微升20纳米图。对于热测序分析，准备在无核管中的PCR主混合物将反应板转移到热循环器并启动PCR。

使用两升PCR产品，在阿加罗斯凝胶电泳后用30和溴化物染色来可视化安普利森。对于热测序测定，使用硫化物转化的DNA和热测序试剂的未甲基化和甲基化混合物，如手稿中所述。使用伦蒂病毒 d-Cas9-DMMT3A-GFP 载体的物理产量计算每个 CPG 站点的甲基化值，使用该协议生成的 Naive GFP 载体具有可比性。

这表明，优化的载体骨干网与优化的生产协议相结合，使Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP载体的CRISPR-dCas9载体转导率比天真的GFP载体低四倍，表明CRISPR d-Cas9-RNA的包装效率降低。与d-Cas9-DNMT3A向量相比，NaivePURO矢量的转导率高出五倍。这些结果得到了进一步证实使用天真的GNP和d-Cas9-DNMT3A-GFP。

此处描述的基于 EB 的协议允许 MD NPC. hipscs 表示快乐效力标记 10 月 4 日， 而 MD NPC 同时表示内辛和 FoxA2 。为SNCA intron 1中的甲基化状态的定量设计并验证了七种热测序测定。

所有 7 种检测都经过验证并显示出线性相关性，使用经过验证的检测方法，可以确定 SNCA intron 1 中 23 个 CPG 的甲基化水平，与参加此过程相关的最重要的事情是使用显示适当生长和健康状况的细胞，以确保实验的一致性。本演示中突出显示的扁豆载体的生产可以很容易地用于生产积分缺陷的抗病毒，也可以轻松扩大，以产生更大的数量或更集中的病媒。这项技术可以为探索基因去调控对年龄相关或包括阿尔茨海默病和相关痴呆症在内的生成性疾病的致病影响铺平道路。

扁豆载体在这里发展的优点是，它不是危害或不传染性扁豆载体只有最小的影响细胞周期，他们是安全可靠的传递平台的基因治疗应用。