用于体内神经结构研究的工程化神经前体细胞脑室内移植

该技术的总体目标是评估基因表达操控对活体大脑皮层神经元结构的影响。与基于中性电穿孔的技术相比，本方法的首个关键优势在于能够精确控制基因表达水平。具体而言，这一整合流程可实现对微小基因表达变化所导致的神经元细胞结构调控缺陷进行活体评估。

此外，移植实验的配对结构可大幅减少获得统计学显著结果所需使用的动物数量。该技术利用来自Tau EGFP转基因胚胎的前体细胞池。该细胞池被分为两个亚池，分别用两种慢病毒混合物进行感染。

获得绿色的实验组细胞池和黄色的对照组细胞池用于共注射。体外扩增两天后，将形成的神经球解离，按1:1比例混合，并通过毛细管注射至小鼠脑室腔内。十天后，对冠状切片进行免疫荧光染色，以比较实验组与对照组神经元之间的差异。

最后，对免疫染色的切片进行成像和骨架化处理，以最终评估形态计量学参数。在进行体内移植之前，需制备前体绿色细胞池。将来自之前与Tau EGFP创始人小鼠交配的孕鼠体内获取的E12.5胚胎，分别置于多孔板的各个孔中，并浸入PBS溶液。

在蓝光灯下通过肉眼快速进行基因型鉴定。将解剖得到的绿色皮层组织解离为单个细胞。用增殖培养基重悬细胞，并将其均分为两个等量的亚组。

使用专用的慢病毒混合物感染每个亚文库。每种混合物包含带红色标签的病毒或黑色对照病毒，以及分别用于Tet-Off驱动的转基因或对照表达的病毒。

每种慢病毒的感染复数必须为8。将感染后的细胞接种于含有2微克/毫升多西环素的增殖培养基中。将细胞放入37摄氏度的培养箱中培养2天。

培养2天后，两个亚群应呈现为含有小型神经球的悬浮液，均匀表达红色荧光蛋白或不表达。在完成前体细胞的遗传改造后，为将细胞移植至出生第0天的白色实验幼鼠体内，需设置相应的评估方案。

使用外径和内径分别为1.5毫米和1.12毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管。用P1000拉制仪拉制毛细管。首先，输入拉制程序。

第二，将毛细管放入夹持器中并拧紧。第三，启动程序，取出两根拉制好的微毛细管，在体视显微镜下用手术刀手动切割毛细管尖端，使其尖端外径达到200–250微米。

最后，将毛细管置于密闭培养皿中的黏土支架上，并转移至通风橱内。对光纤进行消毒，并将其放置在通风橱中。混合 EGTA 和快绿母液以配制细胞示踪剂溶液，并再次将其置于通风橱内。

剪取少量实验室封口膜，用于细胞悬液点样。最后，准备1毫克/毫升的无菌多西环素溶液，并置于0.3毫升注射器中。注射管由两段乳胶管制备而成。

将一个硬塑料吹嘴固定在一根乳胶管的一端，然后将毛细管架固定在另一根乳胶管的一端。将两根乳胶管的自由端连接至一个0.45微米的无菌滤器，以作为防止操作者微生物污染的屏障。

将制备好的吸管管组件置于黏土支架上，在通风橱内存放。分别在不同的试管中收集、检测和控制神经球。离心神经球悬浮液，并用 PBS 替换上清液。

重复此步骤两次。离心神经球悬浮液，用胰蛋白酶溶液替换上清液，将细胞沉淀吹打重悬4到5次。将细胞置于培养箱中孵育5分钟，以获得单细胞悬液。

用胰蛋白酶抑制剂溶液阻断胰蛋白酶。离心细胞，并将其重悬于新鲜增殖培养基中。计数两个细胞池的细胞，并用增殖培养基将细胞浓度调整至每微升100,000个细胞。

然后，将实验组和对照组细胞按1:1混合，并在荧光显微镜下观察混合后的结果。最后，将混合物置于冰上，在通风橱内冷却。将母鼠及其幼崽安置于笼中，并放置在远离手术操作区域的桌面上。

将恢复笼放置于推车上，在其底部铺上取自母鼠笼子的锯末混合物，并将恢复笼置于灯下。另准备一个用铝箔覆盖的冰盒，用于P0代幼鼠的麻醉。

移植前，将1至10体积的细胞示踪剂溶液加入1体积的细胞悬液中，取3微升混合液滴加到一片实验室封口膜上。将幼鼠置于冷却的铝箔上一分钟，检查其是否完全麻醉。同时，将3微升注射混合液吸入玻璃毛细管中。

用70%乙醇轻轻擦拭麻醉后幼鼠的头部。接着，将其置于光纤上，以清晰识别大脑皮层半球。将毛细管插入前方，进入脑室腔。

操作时注意不要损伤血管。为防止损伤神经节隆起，将针头向外侧旋转30度。缓慢将细胞注入脑室，并利用快绿染料监测其扩散情况。

等待五到十秒。移除玻璃针，注意不要吸入细胞悬液，并将其丢弃至合适的废弃容器中。在幼鼠从麻醉中恢复之前，经腹腔注射150 µL多西环素溶液，以确保移植后转基因表达仍处于关闭状态。

注射后，立即将幼崽置于灯下恢复。保持幼崽在灯下5到10分钟，待其完全清醒后，将其放回笼中与母鼠同笼。观察手术后的幼崽2至3小时，以确保母鼠接受它们。

提供含有 0.5 mg/mL 多西环素和蔗糖的饮用水，以维持转基因表达处于关闭状态。在移植后第四天，将含多西环素的水更换为不含多西环素的水，从而在终末分化神经元中激活转基因。

将小鼠置于无多西环素的环境中饲养六天，并在P10阶段实施安乐死。将安乐死后的幼鼠脑组织置于4%多聚甲醛（PFA）中，4°C下固定过夜。移除PFA溶液，替换为30%蔗糖溶液。

将脑组织置于4°C直至沉入小瓶底部。将脑组织转移至一次性包埋模具中，模具内预先加入约一半体积的冷冻包埋介质。将包埋好的脑组织在-80°C下冷冻。

使用冷冻切片机切割60微米厚的冠状切片。对切片进行抗GFP、抗RFP免疫荧光处理，并用DAPI溶液复染。根据所示设置共聚焦显微镜的工作参数。

采集免疫染色切片的图像，选择富含GFP阳性神经元的视野，且在选择时对RFP信号分布保持盲法。将图像导出为ND2文件，并生成其最大z投影的TIFF文件。为便于后续在对细胞基因型设盲的条件下进行神经元骨架化，需隐藏红色信号。

为此，添加一个调整图层。选择“色阶”，选择红色。将输出设置为零。

并以此方式保存文件。随后由一位此前未接触过原始纯红色文件的新操作员进行骨架化处理。对于每个隐藏的红色文件，打开该文件，在主图像上添加一个绘图层，然后选择铅笔工具。

根据 GFP 信号追踪细胞体，然后追踪神经突，最后保存包含神经元轮廓的多层文件。

两位操作者均可进行后续的神经元骨架分析。打开每个多层文件，创建新的空白16位灰度图像文件，背景为黑色，每个神经元对应一个文件。

从原始图像中复制单个神经元轮廓，并粘贴到灰度图像文件中。返回多图层文件，关闭调整图层以显示神经元基因型。保存16位灰度图像文件，并标注对应的神经元基因型。

在 ImageJ 中逐一导入灰度图像，并使用 NeurphologyJ 插件分析骨架结构。将 NeurphologyJ 选定的原始数据（包括神经突总长度、附着点和末端点的总面积）收集到电子表格中，并用于计算次级形态计量参数。我们提出的工程化方案能够对绝大多数目标神经元实现目的转基因集合的共转导。

此外，该方法能够实现在转导细胞群体内转基因表达水平的高度均一性。我们实验方案的一个关键特征是其成对设计：将测试组和对照组前体细胞池分别进行基因改造，然后以1:1比例混合，最终共同移植。

这种配对方法将有助于检测与不同基因型特异性相关的结果差异。在此示例中，我们分析了移植幼鼠的冠状切片，该切片取自侧脑室内共注射Foxg1过表达神经前体细胞与对照细胞后第十天。神经元群的图像通过共聚焦显微镜获取。

采用Z轴层析图像文件生成最大强度投影图。神经元轮廓通过手动描记获得。其中，绿色和黄色轮廓分别代表Foxg1过表达和对照神经元。

最后，利用 NeurphologyJ 分析获得的主要参数来计算次级形态计量学指数，如图所示。该方案简单，可使研究人员评估特定基因的混合表达对体内神经突精细发育调控的影响。该方案的主要优势有两点。

在缺乏相应致畸品系的情况下，仍可在体内对参与神经元形态发生的现有基因数量进行功能表征。并且，获得具有显著统计学意义的结果所需的动物数量更少。