Name: 工程神经前体宫内移植,用于Vivo神经结构研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 了解利用慢病毒工程神经前体细胞宫内移植技术，在小鼠体内研究基因表达对皮层神经元结构的影响。该方法通过配对移植减少动物使用，实现基因表达水平的精细调控。

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感谢 Mihn Duc Do 在本实验方案早期建立过程中所做的贡献。

本文所述所有方法和操作程序均已获得SISSA动物福利委员会（SISSA IACUC）的批准。
1. 工程化细胞的制备 &#34;绿色&#34; 前体细胞池
<ol>
	<li>制备 &#34;绿色&#34; 池
	<ol>
		<li>将野生型CD1雌鼠与 MtaptEGFP/+&#160;奠基者16. 通过颈椎脱位法处死妊娠母鼠，处死时间为交配后12.5天（以阴道栓检查确定第0天），收集胚胎发育第12.5天（E12.5）的胚胎。将胚胎置于24孔板的各个孔中，每孔加入冷PBS溶液。</li>
		<li>在蓝光灯下通过肉眼观察快速对胚胎进行基因型鉴定，检查其脑部是否发出绿色荧光。</li>
		<li>放置 &#34;绿色&#34; 将胚胎转移至含有冷的含0.6%葡萄糖的1×PBS的10 cm直径培养皿中，并置于体视显微镜下。</li>
		<li>使用标准剪刀剪下胚胎头部，并用 #3 和 #5 镊子从中分离出端脑。</li>
		<li>分离两个端脑泡，并用镊子解剖出新皮层；务必去除海马和基底神经节17.</li>
		<li>使用P1000移液器将新皮质转移至置于冰上的1.5 mL离心管中收集。</li>
		<li>让解剖出的新皮层沉降到管底。</li>
		<li>尽可能吸除上清液。</li>
		<li>将新皮质组织重悬于400 µL新鲜增殖培养基中[DMEM-F12、1× Glutamax、1× N2、1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、0.6%葡萄糖、2 µg/mL肝素、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）、1×青霉素-链霉素和10 pg/mL两性霉素B]。</li>
		<li>用P1000、P200和P20枪头依次上下轻柔吹打新皮质组织，每种枪头各吹打4次，直至获得浑浊的细胞悬液。 
		注意：E12.5 新皮质组织非常柔软，完全无需酶消化即可解离为单细胞，反复吹打即可。</li>
		<li>让脑膜和残留的新皮质团块静置2分钟。</li>
		<li>将150 µL细胞悬液上层液体（主要含有单细胞）转移至新的1.5 mL无菌离心管中。</li>
		<li>加入150 µL新鲜增殖培养基，重复步骤1.1.10-1.1.12，直至无明显组织团块为止。操作过程中省略步骤1.1.10中的P1000移液步骤。 
		注意：通常重复步骤 1.1.10–1.1.12 三次即可实现完全的组织解离。</li>
		<li>计数细胞（&#34;绿色&#34; 使用Bürker计数板通过台盼蓝排斥法进行细胞计数17 并加入新鲜增殖培养基，将浓度调整至103 细胞/µL 
		注意：步骤 1.1.7–1.1.14 必须在经 70% 乙醇消毒并持续通风至少 20 分钟的无菌超净工作台内进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>工程化 &#34;绿色&#34; 亚组
	<ol>
		<li>细分 &#34;绿色&#34; 分别将样品等分为两份，置于两个独立的1.5 mL离心管中，用于慢病毒感染。</li>
		<li>分别使用两种专用的慢病毒混合物感染亚组细胞池。每种混合物包含 &#34;红色标签&#34; 病毒（Pgk1_mCherry）或 &#34;黑色&#34; 病毒（pCAG_lacZ）作为对照，以及用于tetOFF系统驱动的转基因表达（Pgk1p_tTA 和 TRE_transgene）或对照（Pgk1p_tTA 和 TRE_PLAP）的病毒。 
		警告：操作慢病毒时，必须在符合相关法规和法律规定的生物安全二级（BLS-2）环境中进行，并采取所有规定的防护措施。 
		注意：每种慢病毒必须以8的感染复数（MOI）进行施用，这一点（如先前所示14）足以在该实验条件下转导绝大多数神经细胞（图1）。可利用不同的神经元特异性启动子驱动tTA/rtTA表达（如pTα1、pSyn、pCaMKII、pGAD1等）来构建携带tet转录激活因子的慢病毒（图2). MOI 是指接种的感染性病毒颗粒数量（a）与其靶细胞数量（b）之间的比值。此处，前者（a）根据其他文献所述常规方法进行计算。14后者（b）仅使用Bürker计数板进行评估。</li>
		<li>每孔加入600 µL增殖培养基，其中含2 µg/mL多西环素，将每个感染亚群的600,000个细胞接种于12孔板的每孔中。 
		注意：此处的孔板未用多聚赖氨酸预处理，以防止神经细胞附着于孔底。</li>
		<li>将细胞转移至含5% CO₂的培养箱中2 在 37 °C。</li>
		<li>2天后，使用常规荧光显微镜观察细胞，以评估感染效率及基因工程细胞亚群的差异标记情况。两个亚群应呈现为悬浮的小神经球，均匀表达红色荧光蛋白（&#34;对照&#34; 样本）或否（&#34;测试&#34; 样本）。在这些神经球内， MtaptEGFP 转基因仅在少数细胞（有丝分裂后神经元）中具有活性，而在大多数细胞（增殖性前体细胞）中处于沉默状态（图3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术器械和手术区域的准备
<ol>
	<li>制备硼硅酸盐玻璃针
	<ol>
		<li>使用外径和内径分别为 1.5 mm 和 1.12 mm 的硼硅酸盐玻璃毛细管。</li>
		<li>使用 P 1000 拉针仪拉制毛细管。</li>
		<li>设置拉针程序。典型参数为：加热值 = 614；拉速 = 60；时间 = 1；气压 = 600。需根据所用拉针仪型号及加热电阻进行调整。</li>
		<li>将毛细管放入拉针仪的夹持器中并拧紧固定。</li>
		<li>启动程序，获取两根拉制好的微毛细管。</li>
		<li>在体视显微镜下，用手术刀手动切割毛细管尖端，使其外径约为 200–250 µm。</li>
		<li>将毛细管置于封闭培养皿内的塑型黏土（例如油灰）支架上，并转移至超净台内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备超净台并配制细胞示踪液
	<ol>
		<li>仔细清洁水平层流超净台，并使用 70% 乙醇进行消毒。</li>
		<li>使用 70% 乙醇对光纤进行消毒，并将其放置于超净台内。</li>
		<li>将 10 µL 的 125 mM EGTA 溶液与 10 µL 快绿（Fast Green）混合，配制&#34;细胞示踪液&#34;，并置于超净台内。</li>
		<li>裁剪若干小片实验室封膜（尺寸约为 4 cm × 2 cm），用于细胞悬液点样。</li>
		<li>配制 1 mg/mL 的无菌多西环素溶液，并将其吸入 0.3 mL 注射器中。</li>
		<li>开启超净台，操作前保持层流运行 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装注射管路
	<ol>
		<li>从校准型微毛细移液管用吸管套件中取出一个硬塑料吹嘴、两根乳胶管（每根长约 30 cm）和一个毛细管夹持器。</li>
		<li>将硬塑料吹嘴固定在一根乳胶管的一端。</li>
		<li>将毛细管夹持器固定在另一根乳胶管的一端。</li>
		<li>用一个 0.45 µm 的无菌滤器连接两根乳胶管的自由端，作为防止操作者微生物污染的屏障。</li>
		<li>将组装好的吸管装置置于塑型黏土支架上，并放置于超净台内备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞混合与脑室内移植
<ol>
	<li>混合&#34;实验组&#34;与&#34;对照组&#34;绿色细胞亚群
	<ol>
		<li>分别在两个1.5 mL离心管中收集&#34;实验组&#34;和&#34;对照组&#34;神经球（参见步骤1.2.5）。</li>
		<li>在200 g条件下离心神经球悬液5分钟。</li>
		<li>收集并弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
		<li>用500 µL的1x PBS轻柔重悬神经球。</li>
		<li>在200 g条件下离心1分钟。</li>
		<li>移除上清液。</li>
		<li>重复步骤3.1.4至3.1.6共两次。</li>
		<li>用200 µL的2x胰蛋白酶溶液（2x胰蛋白酶，1x PBS）轻柔重悬神经球，并上下吹打4–5次。 
		注意：注意避免产生气泡。</li>
		<li>将细胞置于37 °C培养箱中孵育5分钟，以获得单细胞悬液。</li>
		<li>加入200 µL胰蛋白酶抑制剂溶液（DMEM-F12，10 µg/mL DNA酶I，0.28 mg/mL胰蛋白酶抑制剂），上下吹打4–5次以终止胰蛋白酶作用。</li>
		<li>在200 x g条件下离心5分钟，然后将细胞重悬于1 mL新鲜增殖培养基中（DMEM-F12，1x Glutamax，1x N2，1 mg/mL BSA，0.6%葡萄糖，2 µg/mL肝素，20 ng/mL bFGF，20 ng/mL EGF，1x青霉素-链霉素，10 pg/mL两性霉素B）。</li>
		<li>使用台盼蓝排斥法在Bürker计数板中对两组细胞进行计数。</li>
		<li>用增殖培养基将细胞浓度调整至100,000个细胞/µL。</li>
		<li>将&#34;实验组&#34;细胞与&#34;对照组&#34;细胞按1:1比例混合。</li>
		<li>在荧光显微镜下（物镜放大倍数：10x）检查所得混合液，确保为两组细胞的单细胞悬液（图3C）。</li>
		<li>将混合液置于冰上，在超净台内保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑室内移植
	<ol>
		<li>将母鼠及其P0幼鼠的笼子放置在远离手术区域的桌面上。</li>
		<li>在靠近超净台的推车上准备一个恢复笼。</li>
		<li>取母鼠笼中的锯末混合物铺在恢复笼底部，并将恢复笼置于灯下。</li>
		<li>另准备一个用铝箔包裹的冰盒，用于麻醉P0幼鼠。</li>
		<li>在移植前，向1体积的细胞悬液（来自步骤3.1.16）中加入1/10体积的细胞示踪剂溶液（来自步骤2.2.3），并将3 µL所得的&#34;注射混合液&#34;滴加在实验室封口膜上。</li>
		<li>将幼鼠置于冷的铝箔上1分钟，检查其是否完全麻醉。 
		注意：为确认麻醉状态，可轻捏幼鼠足爪，观察其是否无运动反应但仍保持呼吸。</li>
		<li>同时，用玻璃毛细管吸取3 µL注射混合液（来自步骤3.2.5）。</li>
		<li>用70%乙醇轻柔擦拭麻醉后幼鼠的头部。</li>
		<li>将幼鼠下颌置于光纤尖端，以清晰识别大脑半球。 
		注意：在P0–P1阶段，幼鼠头皮肤非常薄，可直接观察到眼球上方及嗅球后方的大脑半球。</li>
		<li>将已装液的毛细管（如步骤3.2.7所述）置于两个中旁矢状面之一（左侧或右侧），位于嗅球上方，穿刺前额皮肤与眼球中心所在冠状面的交点处。注意避免损伤血管。将毛细管插入额叶皮层，进入脑室腔（图4A）。</li>
		<li>为防止意外损伤纹状体隆起，将针头向外侧旋转30度，使其尖端指向尾侧-内侧方向（图4B）。</li>
		<li>轻柔地将细胞注入脑室腔，并通过快绿染料观察其扩散情况（图4C）。</li>
		<li>等待5–10秒。</li>
		<li>小心拔出玻璃针头，避免吸入细胞悬液，并将其丢弃至合适的废弃物容器中。</li>
		<li>在幼鼠从麻醉中恢复前，腹腔注射150 µL多西环素溶液，以确保移植后转基因表达仍处于关闭状态。</li>
		<li>注射后立即将幼鼠置于灯下进行恢复。</li>
		<li>让幼鼠在灯下停留5–10分钟，待其完全清醒后放回母鼠笼中。</li>
		<li>观察手术后的幼鼠2–3小时，确保母鼠接受它们。</li>
		<li>向饮水瓶中提供含0.5 mg/mL多西环素和50 g/L蔗糖的饮用水，以维持转基因表达的关闭状态。</li>
		<li>移植后第4天，将含多西环素的饮水更换为不含多西环素的饮水，从而在终末分化神经元中激活转基因。维持小鼠无多西环素饮食6天，于P10时通过二氧化碳吸入法处死，随后进行断头处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 移植脑组织的分析
<ol>
	<li>组织学与免疫荧光
	<ol>
		<li>在细胞移植后第10天，通过吸入二氧化碳并随后断头的方式处死移植幼鼠。将处死幼鼠的脑组织在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜。 
		注意：PFA具有高度毒性；务必小心操作，严格遵循制造商说明，在化学通风橱中进行；PFA废液应弃置于贴有标签的专用废液容器中。</li>
		<li>移除PFA溶液，并替换为30%蔗糖溶液。</li>
		<li>将脑组织置于4 °C环境中，直至其沉降至管底。</li>
		<li>将脑组织转移至一次性包埋模具中，模具内预先加入约一半体积的冷冻包埋介质。</li>
		<li>将包埋好的脑组织在-80 °C下冷冻。</li>
		<li>使用冷冻切片机切割60 µm厚的冠状切片。 
		注意：避免使用更薄的切片，否则可能导致单个神经元整体结构信息的不可接受丢失。</li>
		<li>进行免疫荧光染色18,19，使用抗GFP抗体 [1:400] 和抗RFP（mCherry）抗体 [1:500]。用1 mg/mL DAPI溶液 [1:200] 对细胞核进行复染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>形态计量学
	<ol>
		<li>设定共聚焦显微镜的工作参数如下：z轴堆叠高度 = 40 µm；步长 = 2 µm。</li>
		<li>采集免疫染色切片的图像，选择GFP阳性神经元密集的视野，且在采集过程中对RFP信号分布情况保持盲法。</li>
		<li>将图像导出为.nd2格式文件。</li>
		<li>生成最大Z投影图像，并保存为.tiff格式文件（图5A）。</li>
		<li>为实现对细胞基因型盲法的后续神经元骨架化分析，需隐藏红色信号。具体操作为：使用合适的软件打开每个.tiff文件，并添加一个调整图层。选择&#34;色阶&#34;，&#34;红色&#34;，然后将&#34;输出&#34;设为零。以原格式保存文件。 
		注意：后续的骨架化分析由未接触过原始红色通道文件的新操作者完成。</li>
		<li>对每个隐藏红色通道的文件，在原始图像上添加一个绘图图层，并选择铅笔工具（白色）。根据GFP信号描记细胞体，然后描记神经突起。 
		注意：铅笔工具的大小可设为40像素用于描记细胞体，3像素用于描记神经突起。</li>
		<li>保存包含神经元轮廓的多图层文件（图5B）。 
		注意：后续的神经元骨架分析可由任意操作者进行。</li>
		<li>为每个神经元创建一个新的1024 x 1024、16位灰度、黑色背景的图像文件。</li>
		<li>将单个神经元轮廓从原始图像复制并粘贴至新的灰度图像中。返回多图层文件，关闭调整图层以显示神经元基因型。保存该16位灰度图像，并标注对应的神经元基因型。</li>
		<li>将灰度图像逐个导入ImageJ软件，并使用ImageJ的NeurphologyJ插件进行骨架分析20（图5C）。</li>
		<li>复制NeurphologyJ输出的原始数据（neurite_length、attachment_points 和 endpoints；对每项取&#34;Total Area&#34;值），粘贴至电子表格中，并用于计算二级形态计量参数（average neurite length、branching index）（图5D）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该操作流程中的某些特定方面或步骤至关重要，需特别注意。首先，(a) 操作人员必须经过充分的培训，能够在符合 BSL-2 标准的实验室环境中安全操作慢病毒。其次，(b) 在混合&#34;实验组&#34;和&#34;对照组&#34;神经组织样本之前，必须按照所述方法仔细洗涤相应的神经球悬浮液，以防止因慢病毒意外残留导致两组样本之间发生延迟性交叉感染。第三，(c) 在细胞移植过程中，需谨慎定位脑室腔；在此过程中，细胞悬液中加入的快绿示踪剂具有重要作用。此外，(d) 为防止母鼠吞食幼崽，移植后的幼鼠必须在完全从麻醉中恢复后（通常 10 分钟已足够）方可重新放回母鼠身边。(e) 移植组织的冷冻切片厚度应设定为 60 µm；该厚度可同时实现抗体在组织中的充分渗透，并最大限度减少因人为神经元断裂造成的信号丢失。最后，(f) 为避免数据分析中产生无意偏倚，我们强调神经元骨架化分析必须由对红色荧光通道信息设盲的操作人员完成。
本文所述方案涉及GOF基因操作。或者，可通过编码RNAi效应分子的慢病毒对&#34;实验&#34;神经元进行基因功能下调改造。接下来，我们通常使用mCherry标记&#34;对...

本文介绍了一种我们开发的简单方法，用于解析体内基因对神经元细胞结构的调控机制。该方法基于体外工程化改造神经前体细胞，将其移植至新生小鼠脑内，并对&#34;实验&#34;和&#34;对照&#34;细胞进行成对形态计量分析，从而以快速且经济的方式揭示目的基因在精细调控神经元形态中的功能意义。为研究体内&#160;基因对神经元结构的调控作用，必须解决三个关键技术问题：（1）实现目的基因（GOI）的适当模式化表达，并对其进行精确的定量控制；（2）获得清晰分隔的不同神经元轮廓的可视化图像；（3）在使用较少动物数量的前提下，确保结果具有统计学显著性。
在条件允许的情况下，携带四环素（tet）调控型转基因的小鼠突变品系可能是解决第一个问题的最佳工具1。或者，也可采用体细胞转基因技术。在这些情况下，转基因可通过电穿孔2或病毒转导3的方式递送。随后，转基因可作为附加体保留（例如，在常规电穿孔后4），或整合到基因组中（通过逆转录病毒整合酶随机整合5；或通过CRISPR介导的同源重组定点整合（SLENDR）6）。
其次，神经元轮廓的可视化可通过以下两种方式实现：（a）稀疏均匀标记或（b）密集差异标记。对于稀疏标记，可采用先进的类高尔基方法7，也可通过生物胞素填充选定的少量神经元8，或利用低表达水平的转基因实现“盐和胡椒”式标记。此类转基因可表现为嵌合性转录（如 Thy-EGFP）9，或通过随机重组被激活（如 MORF）10。对于（b）密集差异标记，目前最先进的策略包括：在多重floxed荧光蛋白转基因阵列中由Cre介导的随机重组（Brainbow）11，以及通过体细胞转基因递送后，由piggyBac转座酶驱动的荧光蛋白基因组整合（CLoNE）12。
至于第三个问题，形态计量学结果通常受到较大随机变异性的影响，这种变异性源于个体动物之间的差异以及细胞注射过程中的偶然因素。因此，通常需要使用较大量的动物，以获得足够的统计效能来评估目的基因的形态计量学活性。
先前描述的方法通常依赖于高超的技术技能，并需要显著的经济资源，这可能会限制其在科学界内的推广。为克服这些问题，我们设计了一种简单直接的流程，以快速且经济的方式在体内解析基因对神经结构的调控。该方法借鉴了此前为快速评估抗癌转基因活性而开发的类似共移植设计13。
具体而言，人们认为将体外工程化的&#34;绿色&#34;神经前体细胞（&#34;实验&#34;与&#34;对照&#34;细胞）共移植到&#34;黑色&#34;受体新生小鼠脑中，可同时解决上述三个关键问题。事实上，在体外通过慢病毒对前体细胞进行工程化改造，并在严格控制的条件下操作，能够将神经元中外源基因表达的变异性维持在最低水平，远低于以往体内体细胞操作（此前已报道14,15及本研究未发表结果）通常带来的变异性。由此实现的基因表达精确控制水平，可与四环素调控的转基因模型相媲美。然而，该方法的成本远低于维持转基因小鼠品系所需费用。此外，手工细胞注射操作简便，仅需 minimal 培训即可掌握。同时，可轻松调节每只脑内注射的标记前体细胞数量，以获得足够数量且稀疏分布的前体细胞，同时将移植动物总数保持在最低水平。最后但同样重要的是，通过共注射带有不同荧光标记的&#34;实验&#34;与&#34;对照&#34;前体细胞，并对结果进行成对统计分析，可有效抵消个体间实验变异的影响，即使在分析少量个体时也能达到统计学显著性13。
需要强调的是，尽管该方法快速且成本低廉，但仍存在两个主要局限性。首先，该方法旨在研究细胞自主性基因对神经元结构的调控，不适用于研究环境因素的调控作用。其次，由于移植的神经前体细胞以异时性时间表到达其最终位置，因此该方法更适合用于模拟在细胞迁移完成后发生的神经结构调控过程。

<table><tbody><tr><td>0.3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>320840</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m 无菌滤器</td><td>Millex-HV</td><td>SLHU033RS</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>抗 EGFP 抗体，鸡多克隆，RRID:AB_371416</td><td>Tebubio</td><td>GTX13970</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>抗 RFP 抗体，大鼠单克隆，RRID:AB_10795839</td><td>Antibodies Online</td><td>ABIN334653</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>抗 Tubb3 抗体，小鼠单克隆，RRID:AB_2313773</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>校准微毛细移液管用吸管组件套件</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>蓝光灯</td><td>Nightsea</td><td>BLS2</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>Kwik-Fil</td><td>TW150-4</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker 计数板</td><td>Sigma</td><td>BR719520</td><td>0.0025 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 0.100 mm</td></tr><tr><td>冷冻包埋介质（Killik）</td><td>Bio-Optica</td><td>05-9801</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>一次性包埋模具</td><td>Bio-Optica</td><td>07MP7070</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>+4 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>强力霉素</td><td>Sigma</td><td>D1822</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #3c</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0261</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>精细剪刀 - 锐利型</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>两性霉素 B（Fungizone）</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>山羊抗鸡 Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>肝素溶液</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07980</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>光纤</td><td>Leica</td><td>CLS150X</td><td></td></tr><tr><td>P1000 拉针仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 model</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>质粒 #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]</td><td>实验室构建 &lt;em&gt;in house&lt;/em&gt;</td><td></td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>质粒 #386 [LV_pTa1_mCherry]</td><td>实验室构建 &lt;em&gt;in house&lt;/em&gt;</td><td></td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>质粒 #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)]</td><td>实验室构建&lt;em&gt; in house&lt;/em&gt;</td><td></td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>质粒 #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)]</td><td>实验室构建 &lt;em&gt;in house&lt;/em&gt;</td><td></td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>质粒 #484 [LV_lacZ]</td><td>Addgene</td><td>12108</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>质粒 #529 [LV_Pgk1p_mCherry]</td><td>实验室构建 &lt;em&gt;in house&lt;/em&gt;</td><td></td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>质粒 #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)]</td><td>实验室构建 &lt;em&gt;in house&lt;/em&gt;</td><td></td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Braun</td><td>BB515</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>–20 &amp;#176;C 保存</td></tr></tbody></table>

用于体内神经结构研究的工程化神经前体细胞脑室内移植

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

神经元细胞结构的基因调控目前正处于深入研究之中。本文介绍了一种用于在活体中研究新皮质投射神经元形态基因调控的简便方法。该方法基于以下三个步骤：（1）在体外利用慢病毒对神经前体细胞进行基因工程改造，以获得“实验”组和“对照”组细胞；（2）将这些细胞共移植到野生型动物脑内；（3）对它们所分化的神经元进行成对的形态计量学分析。具体而言，本方法采用来自泛神经元特异性遗传标记供体的E12.5期大脑皮质前体细胞。这些细胞通过特定启动子与tetON/OFF技术进行工程化改造，并通过手工操作移植至新生动物的侧脑室。随后，在对受体脑组织进行免疫荧光分析后，将移植来源神经元的轮廓图像输入开源软件NeurphologyJ，提取其形态计量参数，并计算平均长度和分支指数。与其他方法相比，该方法具有三个主要优势：能够在较低成本下实现对转基因表达的精细调控，仅需基本的外科操作技能，且在分析少量动物后即可获得具有统计学意义的结果。然而，由于其设计特点，该方法不适用于研究非细胞自主性的神经结构调控。此外，该方法更适用于神经元迁移完成后对神经突形态调控的研究。在当前的实验设计下，该方法特别适用于研究基因对谷氨酸能新皮质神经元结构的调控。若结合在其他特定神经细胞类型中表达EGFP的转基因品系，该方法亦可被重新应用于研究这些细胞类型结构的基因调控。

共有五个主要数据集提供了有关该实验步骤关键方面的有用信息：第一，慢病毒载体对神经前体细胞的转导及共转导效率；第二，用于驱动“测试基因”的启动子关键特性的示例；第三，可用于移植的工程化细胞示例；第四，新生小鼠脑内细胞显微注射关键操作步骤的示意图；第五，整体形态计量分析流程的概要。
关于（1），评估了在不同感染复数（MOI = 2、4、8）下递送的原型慢病毒载体有效转导新皮质前体细胞的能力。在第一项实验中，来源于早期野生型新皮质的神经前体细胞被一种携带mCherry编码序列（cds）的慢病毒报告载体感染，该序列由神经发生谱系特异性的pTα1启动子驱动，感染MOI分别为2、4、8，随后让细胞进行分化。对其子代细胞进行mCherry与泛神经元标志物Tubb3的共免疫分析显示，神经元被有效转导的比例分别为64%、69%和78%（图1A）。在第二项实验中，新皮质前体细胞被两种慢病毒报告载体急性共感染，这两...

基于体外慢病毒工程技术对神经前体细胞进行改造，并将其共移植到野生型大脑中，结合对“实验”和“对照”衍生细胞的配对形态测量学分析，该方法能够以简单且经济的方式精确模拟体内基因对新皮层神经元形态的调控。

神经元细胞结构的基因调控目前正处于深入研究之中。本文介绍了一种用于研究……的简便方法。

该技术的总体目标是评估基因表达操控对活体大脑皮层神经元结构的影响。与基于中性电穿孔的技术相比，本方法的首个关键优势在于能够精确控制基因表达水平。具体而言，这一整合流程可实现对微小基因表达变化所导致的神经元细胞结构调控缺陷进行活体评估。此外，移植实验的配对结构可大幅减少获得统计学显著结果所需使用的动物数量。该技术利用来自Tau EGFP转基因胚胎的前体细胞池。该细胞池被分为两个亚池，分别用两种慢病毒混合物进行感染。获得绿色的实验组细胞池和黄色的对照组细胞池用于共注射。体外扩增两天后，将形成的神经球解离，按1:1比例混合，并通过毛细管注射至小鼠脑室腔内。十天后，对冠状切片进行免疫荧光染色，以比较实验组与对照组神经元之间的差异。最后，对免疫染色的切片进行成像和骨架化处理，以最终评估形态计量学参数。在进行体内移植之前，需制备前体绿色细胞池。将来自之前与Tau EGFP创始人小鼠交配的孕鼠体内获取的E12.5胚胎，分别置于多孔板的各个孔中，并浸入PBS溶液。在蓝光灯下通过肉眼快速进行基因型鉴定。将解剖得到的绿色皮层组织解离为单个细胞。用增殖培养基重悬细胞，并将其均分为两个等量的亚组。使用专用的慢病毒混合物感染每个亚文库。每种混合物包含带红色标签的病毒或黑色对照病毒，以及分别用于Tet-Off驱动的转基因或对照表达的病毒。每种慢病毒的感染复数必须为8。将感染后的细胞接种于含有2微克/毫升多西环素的增殖培养基中。将细胞放入37摄氏度的培养箱中培养2天。培养2天后，两个亚群应呈现为含有小型神经球的悬浮液，均匀表达红色荧光蛋白或不表达。在完成前体细胞的遗传改造后，为将细胞移植至出生第0天的白色实验幼鼠体内，需设置相应的评估方案。使用外径和内径分别为1.5毫米和1.12毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管。用P1000拉制仪拉制毛细管。首先，输入拉制程序。第二，将毛细管放入夹持器中并拧紧。第三，启动程序，取出两根拉制好的微毛细管，在体视显微镜下用手术刀手动切割毛细管尖端，使其尖端外径达到200–250微米。最后，将毛细管置于密闭培养皿中的黏土支架上，并转移至通风橱内。对光纤进行消毒，并将其放置在通风橱中。混合 EGTA 和快绿母液以配制细胞示踪剂溶液，并再次将其置于通风橱内。剪取少量实验室封口膜，用于细胞悬液点样。最后，准备1毫克/毫升的无菌多西环素溶液，并置于0.3毫升注射器中。注射管由两段乳胶管制备而成。将一个硬塑料吹嘴固定在一根乳胶管的一端，然后将毛细管架固定在另一根乳胶管的一端。将两根乳胶管的自由端连接至一个0.45微米的无菌滤器，以作为防止操作者微生物污染的屏障。将制备好的吸管管组件置于黏土支架上，在通风橱内存放。分别在不同的试管中收集、检测和控制神经球。离心神经球悬浮液，并用 PBS 替换上清液。重复此步骤两次。离心神经球悬浮液，用胰蛋白酶溶液替换上清液，将细胞沉淀吹打重悬4到5次。将细胞置于培养箱中孵育5分钟，以获得单细胞悬液。用胰蛋白酶抑制剂溶液阻断胰蛋白酶。离心细胞，并将其重悬于新鲜增殖培养基中。计数两个细胞池的细胞，并用增殖培养基将细胞浓度调整至每微升100,000个细胞。然后，将实验组和对照组细胞按1:1混合，并在荧光显微镜下观察混合后的结果。最后，将混合物置于冰上，在通风橱内冷却。将母鼠及其幼崽安置于笼中，并放置在远离手术操作区域的桌面上。将恢复笼放置于推车上，在其底部铺上取自母鼠笼子的锯末混合物，并将恢复笼置于灯下。另准备一个用铝箔覆盖的冰盒，用于P0代幼鼠的麻醉。移植前，将1至10体积的细胞示踪剂溶液加入1体积的细胞悬液中，取3微升混合液滴加到一片实验室封口膜上。将幼鼠置于冷却的铝箔上一分钟，检查其是否完全麻醉。同时，将3微升注射混合液吸入玻璃毛细管中。用70%乙醇轻轻擦拭麻醉后幼鼠的头部。接着，将其置于光纤上，以清晰识别大脑皮层半球。将毛细管插入前方，进入脑室腔。操作时注意不要损伤血管。为防止损伤神经节隆起，将针头向外侧旋转30度。缓慢将细胞注入脑室，并利用快绿染料监测其扩散情况。等待五到十秒。移除玻璃针，注意不要吸入细胞悬液，并将其丢弃至合适的废弃容器中。在幼鼠从麻醉中恢复之前，经腹腔注射150 µL多西环素溶液，以确保移植后转基因表达仍处于关闭状态。注射后，立即将幼崽置于灯下恢复。保持幼崽在灯下5到10分钟，待其完全清醒后，将其放回笼中与母鼠同笼。观察手术后的幼崽2至3小时，以确保母鼠接受它们。提供含有 0.5 mg/mL 多西环素和蔗糖的饮用水，以维持转基因表达处于关闭状态。在移植后第四天，将含多西环素的水更换为不含多西环素的水，从而在终末分化神经元中激活转基因。将小鼠置于无多西环素的环境中饲养六天，并在P10阶段实施安乐死。将安乐死后的幼鼠脑组织置于4%多聚甲醛（PFA）中，4°C下固定过夜。移除PFA溶液，替换为30%蔗糖溶液。将脑组织置于4°C直至沉入小瓶底部。将脑组织转移至一次性包埋模具中，模具内预先加入约一半体积的冷冻包埋介质。将包埋好的脑组织在-80°C下冷冻。使用冷冻切片机切割60微米厚的冠状切片。对切片进行抗GFP、抗RFP免疫荧光处理，并用DAPI溶液复染。根据所示设置共聚焦显微镜的工作参数。采集免疫染色切片的图像，选择富含GFP阳性神经元的视野，且在选择时对RFP信号分布保持盲法。将图像导出为ND2文件，并生成其最大z投影的TIFF文件。为便于后续在对细胞基因型设盲的条件下进行神经元骨架化，需隐藏红色信号。为此，添加一个调整图层。选择“色阶”，选择红色。将输出设置为零。并以此方式保存文件。随后由一位此前未接触过原始纯红色文件的新操作员进行骨架化处理。对于每个隐藏的红色文件，打开该文件，在主图像上添加一个绘图层，然后选择铅笔工具。根据 GFP 信号追踪细胞体，然后追踪神经突，最后保存包含神经元轮廓的多层文件。两位操作者均可进行后续的神经元骨架分析。打开每个多层文件，创建新的空白16位灰度图像文件，背景为黑色，每个神经元对应一个文件。从原始图像中复制单个神经元轮廓，并粘贴到灰度图像文件中。返回多图层文件，关闭调整图层以显示神经元基因型。保存16位灰度图像文件，并标注对应的神经元基因型。在 ImageJ 中逐一导入灰度图像，并使用 NeurphologyJ 插件分析骨架结构。将 NeurphologyJ 选定的原始数据（包括神经突总长度、附着点和末端点的总面积）收集到电子表格中，并用于计算次级形态计量参数。我们提出的工程化方案能够对绝大多数目标神经元实现目的转基因集合的共转导。此外，该方法能够实现在转导细胞群体内转基因表达水平的高度均一性。我们实验方案的一个关键特征是其成对设计：将测试组和对照组前体细胞池分别进行基因改造，然后以1:1比例混合，最终共同移植。这种配对方法将有助于检测与不同基因型特异性相关的结果差异。在此示例中，我们分析了移植幼鼠的冠状切片，该切片取自侧脑室内共注射Foxg1过表达神经前体细胞与对照细胞后第十天。神经元群的图像通过共聚焦显微镜获取。采用Z轴层析图像文件生成最大强度投影图。神经元轮廓通过手动描记获得。其中，绿色和黄色轮廓分别代表Foxg1过表达和对照神经元。最后，利用 NeurphologyJ 分析获得的主要参数来计算次级形态计量学指数，如图所示。该方案简单，可使研究人员评估特定基因的混合表达对体内神经突精细发育调控的影响。该方案的主要优势有两点。在缺乏相应致畸品系的情况下，仍可在体内对参与神经元形态发生的现有基因数量进行功能表征。并且，获得具有显著统计学意义的结果所需的动物数量更少。

intraventricular-transplantation-engineered-neuronal-precursors-for

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

工程神经前体宫内移植,用于Vivo神经结构研究

来源： Weber, R. Z., 等脑内移植与 在体实验 小鼠脑内人神经前体细胞的生物发光示踪 视频实验杂志...

人源神经前体细胞在小鼠脑内的移植

来源： Ibanez-Rios, M.I., 等一种人脑类器官神经细胞移植模型。 J. Vis. Exp.

将荧光标记的神经前体细胞注射至人脑类器官以建立移植模型

来源：Quattrocolo, G., et al. 将中间神经元前体细胞同源移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp.

将中间神经元前体细胞移植到小鼠幼崽脑内

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。...

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

在新的脑区中对年轻神经元进行挑战，可以揭示环境如何塑造神经元命运和成熟过程的重要见解。本方案描述了一种从特定脑区分离中间神经元前体细胞，并将其同位或异位移植到出生后幼鼠脑内的实验方法。...

同龄期中间神经元前体细胞移植至出生后早期小鼠大脑

本方案旨在利用脑内基于腺相关病毒（AAV）的病毒系统以及FLEX构型的突触素驱动型GFP报告基因，在体内直接重编程生成中间神经元，从而实现细胞的鉴定及后续的体内分析。...

通过脑内注射病毒载体将脑内胶质细胞直接重编程为中间神经元

本文介绍了一种实验方案，旨在利用化学遗传学工具调控移植到新生期小鼠大脑皮层中的皮层中间神经元前体细胞的活性。...

化学遗传学改造的皮层中间神经元前体细胞移植至新生小鼠脑内

我们描述了将经携带双报告基因载体（表达荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP））转导的人类神经前体细胞移植至小鼠脑实质内的方法。移植后，利用活体成像系统反复检测荧光素酶信号。 体内 利用荧光显微镜在脑组织切片中鉴定表达生物发光和GFP的移植细胞。...

颅内移植与 体内 小鼠大脑中人神经前体细胞的生物发光示踪

本文介绍了一种将标记的神经细胞移植并追踪其在人脑类器官中分布的实验方案。...

一种人脑类器官神经细胞移植模型

了解利用慢病毒工程神经前体细胞宫内移植技术，在小鼠体内研究基因表达对皮层神经元结构的影响。该方法通过配对移植减少动物使用，实现基因表达水平的精细调控。

用于体内神经结构研究的工程化神经前体细胞脑室内移植

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