Name: 游泳诱导麻痹对线虫多巴胺信号的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学习使用游泳诱导麻痹法评估秀丽隐杆线虫的多巴胺信号传导。该方法可快速识别与多巴胺突触相关的基因，帮助研究人员深入理解神经递质在行为调控中的作用机制。

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作者感谢 Randy Blakely 实验室的 Osama Refai 博士在 SWIP 自动化分析方面的指导。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R01 DA042156 项目资助，资助对象为 LC。

1. 溶液与培养基的制备
<ol>
	<li>通过将 KH2PO4 3.0 g（22.05 mM）、Na2HPO4 6.0 g（42.2 mM）和 NaCl 5.0 g（85.5 mM）溶解于 1 L 去离子灭菌水中来配制 M9 缓冲液。灭菌后加入 1.0 mL 1 M MgSO4（将 12 g 溶于 100 mL 去离子灭菌水中，定容至 100 mL）。取 100 mL 上述 10 倍浓缩 M9 溶液与 900 mL 去离子灭菌水混合，配制成 1 倍工作液。</li>
	<li>配制卵缓冲液：将 6.896 g NaCl（118 mM）、3.578 g KCl（48 mM）、0.294 g CaCl2-2H2O（2 mM）、0.406 g MgCl2-6H2O（2 mM）和 5.958 g HEPES（25 mM）溶解于 1 L 去离子灭菌水中。用 NaOH 调节 pH 至 7.3。</li>
	<li>通过将 1 mL 5–6% 次氯酸钠（漂白剂）和 180 µL 10 N NaOH 加入 3.8 mL 去离子水中，现配新鲜的次氯酸钠/NaOH 溶液。</li>
	<li>称取 60 g 蔗糖，用去离子灭菌水定容至 100 mL，配制成 60% 蔗糖溶液。</li>
	<li>将 0.684 g 蔗糖溶解于 10 mL 去离子灭菌水中，配制成 200 mM 蔗糖溶液。使用渗透压计检测并调节至相同渗透压。分装为每管 1 mL，置于 1.5 mL 微量离心管中，于 -20 °C 冻存。</li>
	<li>称取 0.184 g AMPH（分子量 184.75 g/mol），溶于 10 mL 去离子水中，配制成 100 mM 储存液。取 2 µL 储存液加入 400 µL 水中，配制成 0.5 mM 工作液。</li>
	<li>配制营养生长培养基（NGM）平板
	<ol>
		<li>在 2 L 锥形瓶中加入 3 g NaCl（52.65 mM）、20 g 蛋白胨、25 g 细菌琼脂和 975 mL 去离子水，放入磁力搅拌子，使用液体循环程序在 121 °C、15 PSI 条件下高压灭菌 1 小时。</li>
		<li>将锥形瓶置于加热器上搅拌，冷却并维持温度约 50 °C。加入 0.5 mL 胆固醇（5 mg/mL 溶于乙醇）、1 mL 1 M MgSO4、1 mL 1 M CaCl2 和 25 mL 1 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.4，含 KH2PO4 108.3 g、K2HPO4 35.6 g，用去离子水定容至 1 L）。</li>
		<li>用移液器将培养基分装至 100 mm × 15 mm 培养皿中，每皿 25 mL，静置使其凝固。将平板倒置存放于 4 °C 的密闭盒中，最多可保存 4 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制LB液体培养基（Lysogeny broth）
	<ol>
		<li>在锥形瓶中将 5 g LB 粉末溶于 200 mL 去离子水中，使用液体灭菌程序高压灭菌 30 分钟。待培养基冷却后，室温保存 1–2 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制NA22细菌平板
	<ol>
		<li>使用无菌移液枪头或无菌接种环，从甘油保存菌种中取少量 NA22 E. coli 细菌，在 LB 平板上划线，倒置于 37 °C 培养箱中过夜培养以获得单菌落。挑取单个菌落接种至第 1.8 步配制的 200 mL LB 液体培养基中，在 37 °C 摇床中过夜培养。</li>
		<li>将 200 µL 上述细菌培养物滴加到第 1.7 步制备的 NGM 平板上，用无菌玻璃涂布棒涂布均匀。在通风橱中过夜或更长时间干燥，倒置于密闭盒中，4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为挑取线虫，使用强力胶将一根粗眼睫毛或铂金丝固定于玻璃巴斯德移液管中。用剃刀片将眼睫毛末端斜向剪断。或者，也可使用本生灯加热玻璃移液管末端，使铂金丝周围的玻璃熔化封口。</li>
</ol>
2. C. elegans 培养
注意：在含有 Escherichia coli NA22 的培养板上培养野生型 N2C. elegans 菌株。详细的培养方法如下所述。
<ol>
	<li>线虫培养物的制备
	<ol>
		<li>为制备线虫起始培养物，使用无菌刮铲从含有充分喂养线虫的培养皿上切下一小块琼脂，并将其转移至步骤1.9中制备的NA22大肠杆菌（E. coli）培养皿上。将培养皿在20 °C下培养3-4天。在体视显微镜下观察，确认存在产卵期成虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备同步化线虫群体
	<ol>
		<li>使用喷瓶将灭菌去离子水喷洒至至少2个培养皿的四周，以收集产卵期成虫。轻轻旋转培养皿使线虫脱落，然后用一次性塑料移液管将线虫收集至15 mL聚苯乙烯锥形管中。</li>
		<li>将试管在离心机中以140 × g离心2分钟，使线虫沉淀，随后使用真空泵或实验室内置真空系统吸除上清液。</li>
		<li>向管中加入灭菌去离子水重悬并洗涤线虫，混匀后以140 × g离心2分钟。吸除上清液，并重复此步骤两次以上，直至线虫中无明显细菌残留（线虫与水混合后液体呈透明状）。</li>
		<li>向线虫沉淀中加入5 mL新配制的次氯酸钠/氢氧化钠溶液（步骤1.3），使用涡旋振荡器迅速混匀。将试管置于摇床上孵育约4-8分钟。次氯酸钠/氢氧化钠溶液的孵育时间在4-8分钟之间波动，具体取决于原液次氯酸钠溶液（漂白剂）的质量。</li>
		<li>取一滴（2-50 µL）含线虫的溶液置于玻璃载玻片上，每2分钟在显微镜下检查一次线虫裂解情况。当约70%的线虫发生裂解且卵已释放时，立即向管中加入步骤1.2中配制的卵缓冲液至满，随即以140 × g离心1分钟，使胚胎和线虫残体沉淀。</li>
		<li>吸除上清液，每次用卵缓冲液充满试管，洗涤沉淀共3次。每次以140 × g离心1分钟，并吸除上清液。洗涤结束后，沉淀呈现白色。</li>
		<li>最后一次洗涤后，在30%蔗糖溶液中分离胚胎与死亡残体。向沉淀中加入5 mL灭菌去离子水，重悬后加入5 mL步骤1.4中配制的60%蔗糖溶液。充分混匀后以160 × g离心6分钟。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管将漂浮在液面上层的胚胎转移至新的15 mL锥形管中。转移体积不要超过3-4 mL。为去除残留蔗糖，每次用灭菌水洗涤胚胎3次，每次以140 × g离心3分钟，吸除上清液并重悬沉淀（每次加满试管）。</li>
		<li>再用1× M9缓冲液重复洗涤3次。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于10 mL M9缓冲液中。将试管置于摇床上过夜（不超过14小时），使卵孵化为L1幼虫。由于缺乏食物，线虫将停留在L1幼虫阶段。</li>
		<li>用灭菌水洗涤L1幼虫3次，以去除幼虫释放的任何信息素，每次以140 × g离心2分钟。将幼虫重悬于1 mL水中。将线虫水样稀释10倍（1:10），取10 µL滴于玻璃载玻片上，加盖盖玻片，在体视显微镜下计数线虫数量。重复计数两次，取平均值。</li>
		<li>根据计数结果，吸取相当于约1,000条线虫的体积，以小液滴形式滴加至已恢复至室温的NA22培养皿上。将培养皿半开放置，直至液滴干燥。然后盖上皿盖，倒置放入20 °C培养箱中培养约44-48小时，或直至线虫发育至晚期L4阶段，通过体视显微镜观察确认。此时线虫已准备好用于SWIP检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. SWIP
注意：我们描述了采用AMPH处理野生型线虫后，手动评估SWIP的方法。我们还简要讨论了使用自动化线虫追踪系统及追踪软件对线虫运动进行追踪和进一步动力学分析的方法，该系统和软件此前由Hardaway等人10描述过。
<ol>
	<li>检测SWIP的手动方法
	<ol>
		<li>取40 µL浓度为200 mOsm/L的蔗糖溶液，可选择性加入或不加入0.5 mM AMPH，置于玻璃点样板中。在体视显微镜下，使用睫毛或铂金接种针挑取8–10条晚期L4阶段的线虫，将接种针浸入含有溶液的孔中，直至线虫从针上脱离并游入溶液。记录移入孔中的线虫数量，启动计时器，观察并记录每分钟表现出SWIP的线虫数量。</li>
		<li>将原始数据复制到电子表格中，通过将每分钟麻痹的线虫数除以整个实验中测试的线虫总数，再乘以100，计算出麻痹线虫的百分比。将百分比数值复制到任意绘图和统计分析软件中，使用XY图格式绘制数据，以Y轴表示百分比，X轴表示时间。</li>
		<li>进行双因素方差分析（two-way ANOVA），随后进行事后分析（例如Bonferroni事后检验），以检验对照组、AMPH处理组以及处理时间之间的统计学显著性差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SWIP的自动化分析
	<ol>
		<li>每次对单条线虫进行自动化分析。有关设置摄像头、线虫追踪软件及运行追踪分析脚本的详细步骤，请参见Hardaway等人的文献16。</li>
		<li>简要而言，使用睫毛针按照3.1.2节手动方法所述，将一条晚期L4阶段的雌雄同体线虫放入玻璃点样板中。依次对单条线虫录制游泳视频，并使用线虫追踪软件计算其身体弯曲频率。</li>
		<li>根据追踪软件附带的脚本，获取线虫摆动频率，并基于摆动数据生成热图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在 C. elegans 中进行行为学检测 SWIP 的逐步实验方案。该方案简单直接，无主要技术难点，因此具有很高的用户友好性。然而，为了有效实施该检测，仍有一些关键环节需要特别注意。
进行实验时应确保所用线虫营养充足，因为饮食限制会影响SWIP17。在挑取线虫时需轻柔操作，裂解过程中氢氧化钠/次氯酸钠处理的时间也需精确控制，这些步骤至关重要；因为在挑取过程中造成机械损伤（使用铂金丝挑针时更常见）或胚胎长时间暴露于氢氧化钠/次氯酸钠溶液中，均可能对线虫造成永久性损伤18，从而影响其游泳能力。
应遵循无菌操作技术以避免污染。琼脂平板被污染会损害动物的健康，从而改变其游泳能力。使用接种了不同菌株大肠杆菌（E. coli）（如NA22、OP50等）的琼脂平板时，可观察到表现出SWIP表型的动物比例存在微小差异。在本实验方案中，我们使用NA22菌株以获得大量线虫。
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动物会表现出多种由不同神经递质介导的先天且复杂的行为，这些行为依赖于复杂的信号传导过程进行协调。神经递质多巴胺（DA）在不同物种中介导了高度保守的行为，包括学习、运动功能和奖赏处理。
秀丽隐杆线虫（C. elegans）的神经系统相对简单且图谱清晰，仅包含302个神经元，却表现出显著复杂的多种行为，其中包括许多由多巴胺（DA）调控的行为，如交配、学习、觅食、运动和产卵1。此外，其生命周期短、易于操作，以及信号分子的高度保守性等特点，进一步凸显了利用C. elegans作为研究保守行为神经基础模型的优势。
雌雄同体的 C. elegans 含有八个多巴胺能神经元；此外，雄性个体还额外具有六对用于交配的多巴胺能神经元。与哺乳动物类似，这些神经元可合成多巴胺（DA），并表达多巴胺转运体（DAT-1）——一种仅存在于多巴胺能神经元中的膜蛋白，负责将突触间隙中释放的多巴胺重新转运回多巴胺能神经元内。此外，参与多巴胺合成、囊泡包装和释放各步骤的大多数蛋白质在蠕虫与人类之间高度保守，且与哺乳动物相似，多巴胺在 C. elegans2 中调节摄食行为和运动功能。
C. elegans 在固体表面爬行，在水中则以典型的抽搐行为游泳。有趣的是，缺乏 DAT-1（dat-1）表达的突变体在固体表面爬行正常，但浸入水中后无法持续游泳。这种行为被称为游泳诱导性麻痹（swimming induced paralysis, SWIP）。先前的实验表明，SWIP 部分是由于突触间隙中多巴胺（DA）过量，进而过度激活突触后 D2 样受体（DOP-3）所致。尽管 SWIP 最初是在 dat-1 基因敲除动物中发现的3，但在野生型动物中，使用阻断 DAT 活性的药物（如丙米嗪4）和/或诱导 DA 释放的药物（如苯丙胺5）处理后，也能观察到 SWIP。另一方面，通过药理学或遗传学手段阻止 DA 的合成与释放，或阻断 DOP-3 受体功能，均可防止 SWIP 的发生6。综上所述，这些已发表的数据已确立 SWIP 作为一种可靠工具，可用于研究多巴胺能突触中突变蛋白所引起的行为效应3,4,7，并可用于正向遗传筛选，以鉴定参与 DA 信号传导的新调控通路7,8,9,10,11,12。此外，由于 SWIP 可在活体动物中提供易于量化的药物诱导行为读数，因此有助于阐明苯丙胺（AMPH）和阿扎哌酮等药物在多巴胺能突触中的作用机制5,6,13,14,15。
此前已有文献描述过执行SWIP检测的方案16。本文中，我们详细阐述了实施该检测的方法与实验设置，旨在为秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域提供一份直观的实验操作指南，以帮助研究人员高效地开展SWIP实验。

<table><tbody><tr><td>铝箔</td><td>Reynolds wrap</td><td>1091835</td><td></td></tr><tr><td>安非他明</td><td>Sigma</td><td>51-63-8&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细菌培养箱</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>M1352-0000</td><td></td></tr><tr><td>细菌学级琼脂</td><td>Lab Scientific, Inc</td><td>&amp;nbsp;A466</td><td></td></tr><tr><td>Bacto (TM) 胰蛋白胨</td><td>BD</td><td>REF 211677</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（二水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>相机&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>离心&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf 5810R 15孔离心机</td><td>E215059</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Milli-Q</td></tr><tr><td>Depression 玻璃斑点板</td><td>康宁</td><td>Corning, Inc. 722085</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4103-0250PK</td><td></td></tr><tr><td>睫毛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>绘图与统计软件</td><td>Prism</td><td></td><td>Graphpad 5</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=H3375 &amp;amp; H7006</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸盐</td><td>Hawkins</td><td>次氯酸钠 4-6%，USP&quot; 1 加仑</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基，Miller配方</td><td>Fisher</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（六水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=M0250</td><td>500 g</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Fisherbrand</td><td>16-800-510&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>NA 22 细菌</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>制霉菌素</td><td>Sigma</td><td>1400-61-9</td><td></td></tr><tr><td>渗透压计</td><td>Advanced Instruments, Inc</td><td>Model 3320</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Orion VersaStar Pro</td><td>IS-68X591202-B 0514</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯锥形管</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>VWR</td><td>10毫升=89130-898</td><td></td></tr><tr><td>沙克尔</td><td>可靠的科学</td><td>55S 12x16</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>RB=BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher</td><td>RB=S381</td><td></td></tr><tr><td>电子表格</td><td>MS Office</td><td></td><td>Microsoft Excel</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>模型 tlb3.1 stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液器吸头</td><td>各种</td><td>02-707-400</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=S5016</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Loctite</td><td>1647358 0.14 盎司</td><td></td></tr><tr><td>SwimR 软件</td><td>10.18129/B9.bioc.SwimR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker 2</td><td>Worm Tracker 2.0</td><td>www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td><td></td></tr><tr><td>视频录制软件</td><td>Virtualdub</td><td>http://www.virtualdub.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

游泳诱导麻痹评估多巴胺信号传导 秀丽隐杆线虫

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

本方案中描述的游泳实验是一种用于鉴定调控多巴胺能突触蛋白的有效工具。与哺乳动物类似，多巴胺（DA）在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中调控多种功能，包括学习和运动活动。能够刺激DA释放的条件（例如，使用苯丙胺（AMPH）处理）或阻止DA清除的条件（例如，缺乏多巴胺转运体（dat-1）的突变体动物，无法将DA重新摄取回神经元内）会导致细胞外DA过量，最终引起运动抑制。这种行为在动物水中游泳时尤为明显。事实上，野生型动物可在水中持续游泳较长时间，而dat-1基因缺失突变体以及经AMPH或多巴胺转运体抑制剂处理的野生型动物则会沉入孔底且不再移动。该现象被称为“游泳诱导性麻痹”（SWIP）。尽管SWIP实验已被广泛采用，但其方法的详细描述尚不完善。本文中，我们提供了一套执行SWIP实验的逐步操作指南。实验时，将晚期四龄幼虫置于玻璃点板中，其中含有对照蔗糖溶液，可选择性加入AMPH。动物的游泳行为可通过体视显微镜下肉眼观察进行评分，也可通过安装在体视显微镜上的摄像机录制视频后自动分析。随后使用轨迹追踪软件分析视频，生成以热图形式呈现的摆动频率和麻痹情况的可视化结果。无论是人工还是自动化系统，均可提供易于量化的读数，反映动物的游泳能力，从而有助于筛选多巴胺能系统内携带突变的动物或辅助基因。此外，SWIP还可用于阐明滥用药物（如AMPH）的作用机制。

我们展示了由AMPH处理诱导的SWIP实验示例。图1展示了如上所述的实验设置示意图。对于手动实验，取约8-10条年龄同步的晚期L4期线虫，使用睫毛或铂金挑针收集，并置于盛有40 µL 200 mOsm/L蔗糖溶液（对照溶液）或含0.5 mM AMPH的蔗糖溶液的玻璃点板中，进行SWIP检测。
当动物停止游泳（即表现出SWIP）时，它们会迅速沉入孔底且不再移动。因此，区分仍在水面上游泳的动物与静止在孔底的动物非常直观。大多数在对照溶液中测试的线虫可连续游泳至少10分钟，而在AMPH处理下，表现出SWIP的动物数量逐渐增加。表现出SWIP的动物最大百分比与所用AMPH浓度成正比1,5,13。当对DAT-1基因敲除...

游泳诱导麻痹（SWIP）是一种成熟的动物行为检测方法，用于研究秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称 C. elegans）中多巴胺信号传导的潜在机制。然而，目前尚缺乏执行该检测的详细方法。本文中，我们描述了一种SWIP的逐步操作方案。

本方案中描述的游泳实验是鉴定调控多巴胺能突触蛋白的有效工具。与哺乳动物类似，多巴胺（DA）……

本实验的总体目标是演示游泳诱导麻痹（SWIP），这是一种用于评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）多巴胺信号传导的行为学检测方法。SWIP 能够快速鉴定多巴胺能突触中或与之相关的基因。该方法可用于研究由细胞外多巴胺过量所引起的作用，例如由药物或多巴胺转运体突变所导致的效应。为了确保在检测过程中所有线虫在溶液中游泳的时间相同，必须迅速将动物转移至溶液中。本次操作将由Sirisha Kudumala和Serene Sossi进行演示。她们均在我的实验室工作。为建立线虫起始培养物，使用无菌刮铲从含有充分喂食的秀丽隐杆线虫（C.elegans）的培养皿中切取少量琼脂块，并将琼脂块转移至含有大肠杆菌NA22（E.coli）的独立培养皿中。将培养皿在20摄氏度下孵育三至四天后，在体视显微镜下观察确认存在产卵期成虫。为获得同步化的线虫群体，将水喷洒至布满产卵期成虫的培养皿中。轻轻摇晃培养板以使线虫脱离，使用移液管将线虫转移至一个15毫升聚苯乙烯圆锥形管中。从第二块培养板中收集线虫并加入同一管中后，以15毫升无菌水洗涤三次，每次均通过离心收集线虫。最后一次洗涤后，水应呈现清澈状态。最后一次离心后，向线虫中加入5毫升新配制的次氯酸钠-氢氧化钠溶液，并用涡旋振荡器迅速混匀。将离心管置于摇床上孵育，每2分钟取一滴线虫溶液置于玻璃显微镜载玻片上，在体视显微镜下检查线虫裂解情况，持续4至8分钟。当约70%的线虫已裂解且卵已释放时，立即加入卵缓冲液终止裂解反应。随后离心胚胎和线虫尸体，共洗涤四次，每次用新鲜的卵缓冲液重悬沉淀，以去除残留的次氯酸钠。最后一次洗涤后，沉淀应呈现白色。将沉淀用5 mL无菌水和5 mL 60%蔗糖溶液重悬，通过离心分离胚胎与尸体。密度梯度分离后，小心地从离心机中取出离心管，使用玻璃巴斯德吸管将漂浮在上层弯月面的 3 至 4 毫升胚胎转移至新的 15 毫升锥形管中。用高压灭菌水洗涤胚胎三次以去除蔗糖，随后再用 M9 缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，将胚胎置于 10 毫升新鲜 M9 缓冲液中，在摇床中过夜孵育，使卵孵化并停留在 L1 幼虫阶段。在摇床中培养不超过14小时后，用灭菌水洗涤L1幼虫三次，以去除幼虫释放的任何信息素，并将幼虫沉淀重悬于1毫升水中。取部分线虫样品稀释至1:10的比例，吸取10微升稀释液滴加到玻片上，在体视显微镜下计数线虫数量。重复操作以获得线虫的平均数量。使用移液枪向室温的 NA22 平板上滴加足够数量的线虫溶液，使接种的线虫数量约为 1 × 10³ 个，将平板半打开，直至液滴干燥。随后将平板倒置并盖好，在 20°C 下培养约 44 至 48 小时，或直至线虫发育至晚期 L4 阶段，通过体视显微镜观察确认。进行 SWIP 手动评估时，向玻璃点板中加入 40 µL 对照溶液，可含或不含 0.5 mM 安非他明。在体视显微镜下，用睫毛挑取8至

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学习使用游泳诱导麻痹法评估秀丽隐杆线虫的多巴胺信号传导。该方法可快速识别与多巴胺突触相关的基因，帮助研究人员深入理解神经递质在行为调控中的作用机制。

游泳诱导麻痹评估多巴胺信号传导秀丽隐杆线虫

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