Name: 膜靶向 ca 2 + 指标对培养细胞中局部 Ca2 +信号的解剖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 了解膜靶向钙离子成像技术，用于解析培养神经元和胶质细胞中亚细胞水平的局部钙信号动态。该方法利用基因编码钙指示剂实现高分辨率实时监测，为神经科学研究提供重要工具。

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本工作由以下基金资助：日本科学技术振兴机构（JST）/先驱性胚胎科学与技术研究项目（PRESTO）（JPMJPR15F8，日本）；日本学术振兴会（JSPS）/科学研究费助成事业（KAKENHI）（JP18H05414、JP17H05710、JP16K07316）；武田基金会。作者感谢东京大学的Haruhiko Bito提供RCaMP2，感谢RIKEN脑科学研究中心（CBS）的Arthur J.Y. Huang和Thomas McHugh提供AAV载体以及关于AAV制备的指导。作者谨此致谢&#160;也感谢&#160;感谢《视觉化实验杂志》编辑在视频拍摄与编辑过程中提供的帮助。&#160;

本研究所述的所有实验均根据日本文部科学省发布的指南，经理化学研究所安全委员会和动物实验委员会批准。&#160;
1. 细胞准备&#160;
<ol>
	<li>聚乙烯亚胺包被盖玻片的制备 
	注意： 推荐使用聚乙烯亚胺（PEI）包被玻璃器皿，因其可使神经元和星形胶质细胞紧密贴附于盖玻片上，同时不影响其发育。然而，如有需要，也可选用其他包被方法（如多聚鸟氨酸、聚-L-赖氨酸、层粘连蛋白包被）用于玻璃底培养皿。&#160;
	<ol>
		<li>在12孔板的每个孔中放入一个直径为18 mm的玻璃盖玻片。使用无菌水配制0.04% PEI溶液（每12孔板需12.5 mL）。</li>
		<li>向每个孔中加入1 mL 0.04% PEI溶液。确保盖玻片下方无气泡。</li>
		<li>将培养板置于 CO₂ 培养箱中孵育2 37 °C 培养箱中过夜培养。</li>
		<li>第二天，用1 mL无菌水将包被的盖玻片清洗3次。用抽吸装置移除PEI溶液，每孔加入1 mL无菌水，轻轻振荡12孔板，使盖玻片与孔板之间的PEI溶液充分洗出。由于残留的PEI对细胞具有毒性，务必在最后一次清洗后将无菌水完全抽吸干净。</li>
		<li>在生物安全柜中用紫外线（UV）照射盖玻片至少15分钟以进行干燥和灭菌。PEI包被的培养皿可在4 °C保存长达2个月。使用前需用紫外线照射培养皿15分钟。</li>
		<li>在孔与孔之间的区域加入5 mL无菌蒸馏水，以防止培养基蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞系接种 
	注意： 本方案仅以哺乳动物细胞系（如HeLa细胞和COS-7细胞）的转染为例。用户可根据实验需求选择其他优化的转染方案。本节将描述HeLa细胞的培养方案，该方案同样适用于COS-7细胞。
	<ol>
		<li>转染前一天，将细胞接种于10 cm培养皿中，培养至细胞融合度达到70%–90%。</li>
		<li>预热培养基（参见 材料表) 升温至 37 °C。</li>
		<li>用不含 Ca 的磷酸盐缓冲液洗涤细胞 2 次2+ 和 Mg2+ (PBS [-])</li>
		<li>吸除 PBS(-)，加入 1 mL 0.5% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，于 37 °C 培养 90 秒，直至细胞呈圆形。</li>
		<li>加入9 mL预热的培养基以终止消化。用培养基按1:6的比例稀释细胞。</li>
		<li>在12孔板的PEI包被盖玻片上接种1 mL稀释后的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大鼠或小鼠海马神经元-星形胶质细胞混合培养的制备 
	注意： 第1.3和1.4节必须首先经过机构动物护理与使用委员会审查和批准，并须遵循官方批准的实验动物护理与使用规程。神经元培养方案的流程图如下所示： 图2.
	<ol>
		<li>在超净工作台中配制所有试剂。将杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）加入两个置于冰盒中的100 mm培养皿中（每皿约20 mL）。&#160;</li>
		<li>配制 50 mL 解剖液，由 DMEM 和 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES) 组成（参见 材料清单）并将培养基分装至三个60 mm培养皿（约7 mL/皿）和八个35 mm培养皿（约2 mL/皿）中。将培养皿放入另一个冰盒中。&#160;</li>
		<li>配制 50 mL 孵育用盐溶液，由添加 20 mM HEPES 的 Hanks 平衡盐溶液组成（参见 材料清单），并将8 mL生理盐水置于预冷的15 mL锥形管中，放在冰上。</li>
		<li>使用添加了B-27、谷氨酰胺和青霉素-链霉素的最低必需培养基（MEM）配制铺板培养基（参见 材料表）。将该培养基置于室温（20–28 °C）保存。</li>
		<li>使用70%乙醇对手术器械进行灭菌。&#160;</li>
		<li>在带盖的玻璃罐中放入一张纸巾和1 mL异氟烷，静置使异氟烷挥发1分钟。</li>
		<li>将一只怀孕的大鼠或小鼠放入按步骤1.3.6准备好的容器中，使动物在容器内持续暴露，直至深度麻醉（约30秒至1分钟）。</li>
		<li>将麻醉后的动物从容器中取出，并用70%乙醇喷洒动物体表及解剖器械进行消毒。使用标准解剖剪和镊子沿腹中线剪开，取出妊娠大鼠或小鼠的子宫。</li>
		<li>从麻醉的雌性大鼠或小鼠子宫中取出 E18–19 胚胎，使用精细解剖剪，并用环形镊子将取出的胚胎放入盛有冰冻 DMEM 的 10 cm 培养皿中，进行低温麻醉。</li>
		<li>用精细的解剖剪将胚胎头部切断，并将头置于盛有冰冻DMEM的10 cm培养皿中。</li>
		<li>使用13 cm弯曲的Semken镊子和尖端精细的镊子从每只胚胎中取出脑组织，并将脑组织置于盛有冰上预冷的解剖培养基的60 mm培养皿中。</li>
		<li>使用精细尖头镊子在35 mm培养皿的冰上解剖液中取出海马体，并将分离的组织置于盛有孵育盐溶液的15 mL锥形管中，冰上保存。</li>
		<li>用孵育盐溶液洗涤海马体，并在37 °C下用含胰蛋白酶（1.25 mg/mL）和DNase I（0.25 mg/mL）的孵育盐溶液孵育5分钟。推荐孵育体积为2.7 mL孵育盐溶液、150 µL 20x储存浓度胰蛋白酶和150 µL 20x储存浓度DNase（参见 材料表).</li>
		<li>用预冷的孵育盐溶液将海马组织清洗3次。</li>
		<li>吸弃孵育用生理盐水，加入含有DNase I的铺板培养基1 mL（10 µL贮存液；参见 材料表用移液器吹打不超过20次以重悬组织，使用细胞计数仪和台盼蓝染色法测定活细胞密度。</li>
		<li>将海马细胞稀释至密度为 1.4 x 105 每毫升大鼠活细胞数为 2.5 × 105 每毫升含活细胞数用于小鼠。将1 mL稀释后的细胞悬液接种至12孔板中经PEI包被的盖玻片上。</li>
		<li>将细胞置于37 °C的CO2培养箱中培养2–3天。</li>
		<li>移除培养基，切勿让细胞干燥。轻柔且迅速地加入预热的维持培养基（参见 材料表).&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大鼠皮层神经元-星形胶质细胞混合培养物的制备、冻存及冻存细胞的复苏 
	注意： 一种皮层细胞的冷冻保存方法此前已有描述11。本文提供了一种改良方案，可将皮层细胞在 -80 °C 条件下保存至少 3 个月。该方案的流程图如下所示 图2.
	<ol>
		<li>配制步骤1.3.1–1.3.4中所述的DMEM、解剖液、孵育盐溶液和铺板培养基，以及 材料表.&#160;</li>
		<li>准备洗涤培养基，其成分为DMEM、热灭活胎牛血清和青霉素-链霉素（参见 材料表如有必要。</li>
		<li>从麻醉的雌性大鼠或小鼠子宫中取出 E18–19 胚胎，使用精细解剖剪，并用环形镊子将每只取出的胚胎放入冰冻的 DMEM 中进行低温麻醉。</li>
		<li>将胚胎的脑组织取出，置于冰上预冷的解剖液中。剥离大脑皮层，并将其置于盛有孵育盐溶液的15 mL离心管中，冰上保存。</li>
		<li>用孵育盐水洗涤皮层组织，然后将皮层组织置于含有胰蛋白酶（1.25 mg/mL）和DNase I（0.25 mg/mL）的孵育盐水中，于37 °C孵育5分钟。推荐每12个皮层组织使用5.4 mL孵育盐水、300 µL 20倍浓缩胰蛋白酶原液和300 µL 20倍浓缩DNase I原液。</li>
		<li>用冰浴的孵育用生理盐水洗涤皮层组织3次。</li>
		<li>吸除上清液，加入2 mL含有150 µL DNase I储备液的铺板培养基。用移液器吹打不超过20次以解离细胞，然后使用孔径为70 µm的细胞筛过滤细胞。</li>
		<li>用20 mL铺板培养基冲洗细胞滤网，用于铺板。对于冻存细胞库的制备，用20 mL洗涤培养基洗涤细胞（参见 材料表)</li>
		<li>使用细胞计数器和台盼蓝染色法测定活细胞密度。</li>
		<li>将皮层细胞稀释至密度为 1.4 x 105 以铺板培养基将细胞稀释至适宜浓度，每毫升含活细胞数符合实验要求，并将1 mL稀释后的细胞悬液加入12孔板中经PEI包被的盖玻片上。</li>
		<li>在37 °C、CO₂培养箱中培养细胞2 在培养箱中孵育2–3天，然后将培养基更换为维持培养基。</li>
		<li>在步骤1.4.9之后，通过在187 x g条件下离心细胞来制备冷冻皮层细胞储备液 g 使用摆动转子离心3分钟。&#160;</li>
		<li>吸弃上清液，加入冻存培养基（参见 材料表) 置于 4 °C 保存，以获得 1 x 10 的细胞密度7 细胞/mL。将1 mL细胞悬液分装至冻存管中。</li>
		<li>将试管放入细胞冻存盒中，以-1 °C/min的速率降温至-80 °C，随后将冻存盒转移至-80 °C超低温冰箱中。细胞可在-80 °C条件下保存至少3个月。</li>
		<li>复苏冻存细胞时，预先将洗涤培养基（每支冻存管约13 mL）和冻存皮层细胞维持培养基预热（参见 材料清单).</li>
		<li>将冻存的细胞在37 °C水浴中快速解冻。</li>
		<li>轻轻将解冻的细胞用预热的洗涤培养基稀释。在187 x g 使用摆动转子离心3分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于1 mL洗涤液中，并测定活细胞密度。</li>
		<li>用冻存皮层细胞的维持培养基稀释细胞，使细胞密度达到 3.0 x 105 活细胞数/mL，并将1 mL细胞悬液接种至PEI包被的12孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 膜靶向GECI的表达
<ol>
	<li>细胞转染&#160;
	<ol>
		<li>每孔加入250 ng的GECI质粒（例如Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2或OER-GCaMP6f，带有CMV启动子）7,8,9 至100 µL低血清培养基中（见材料表）。若共转染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f，则每孔在100 µL低血清培养基中加入各250 ng的两种质粒。</li>
		<li>每孔向质粒-低血清培养基混合物中加入0.5 µL转染试剂（见材料表）。共转染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f时，每孔同样加入0.5 µL转染试剂。</li>
		<li>将混合物在室温（20–28 °C）下孵育30分钟。</li>
		<li>以逐滴方式将100 µL混合物加至每个盖玻片上。</li>
		<li>将细胞在37 °C、CO2培养箱中孵育48–72小时，以实现GECI的表达。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>海马体或皮层神经元的转染与腺相关病毒（AAV）感染 
	注意：体外培养3–5天（DIV）进行转染可获得较高的神经元转染率。星形胶质细胞中GECI的最佳表达则推荐在6–8 DIV时进行转染。对于体外培养超过9 DIV的分离神经元，使用腺相关病毒（AAV）载体感染可实现更优的GECI表达效果。在EF1a启动子驱动下表达Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的AAV载体，已如先前所述使用HEK293细胞制备12（见材料表）。&#160;
	<ol>
		<li>若在铺板后3–8天进行转染，请标记两个离心管，分别用于盛放质粒DNA和转染试剂。</li>
		<li>每管中加入50 µL低血清培养基（见材料表）。</li>
		<li>在质粒DNA管中，每盖玻片加入0.5 µg质粒DNA，每孔加入1 µL神经元专用转染试剂配套添加剂（见材料表）。若共转染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f，则每孔在50 µL低血清培养基中混合各0.5 µg质粒及1 µL添加剂。&#160;</li>
		<li>在转染试剂管中，每孔加入1 µL转染试剂（见材料表）。共转染时使用相同量的转染试剂。</li>
		<li>将两个管涡旋振荡1–2秒。</li>
		<li>将转染试剂混合物（来自步骤2.2.4）加入DNA混合物（来自步骤2.2.3）中，轻轻吹打混匀，并将混合物（每盖玻片100 µL）在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>以逐滴方式将此混合物加入细胞中。&#160;</li>
		<li>将细胞置于CO2培养箱中孵育2–3天，直至标记蛋白表达。</li>
		<li>进行AAV感染时，每孔向神经元-星形胶质细胞混合培养物中加入3 µL AAV。通过轻轻摇动培养皿使液体混合均匀。若同时感染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f，则每孔分别加入3 µL两种AAV。若表达GECI的细胞数量不足，应确定最佳AAV感染用量。</li>
		<li>继续培养1–2周，直至GECI充分表达。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ca2+ 成像
<ol>
	<li>同时成像表达 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞 
	注意：为了同时记录 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 信号，需要使用图像分光光学器件。该光学器件可将 RCaMP2 和 GCaMP6f 的发射光分离，并投射到相机的同一成像画面上（图 3A）。同时成像还需要满足以下条件：(1) 光源能够同时发射蓝光（450–490 nm）和绿光（500–560 nm）范围的激发光；(2) 显微镜配备双通滤光片和二向色镜组；(3) 配备用于 RCaMP2 和 GCaMP6f 的发射滤光片。具体细节请参见材料表。&#160;
	<ol>
		<li>在开始记录前至少 30 分钟开启成像设备和计算机。将显微镜加热腔预热至 37 °C。安装图像分光装置、滤光片和光源。调整图像分光光学系统，使同一视野出现在相机画面上。选择合适的物镜（见材料表）。</li>
		<li>将含有转染了 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞的盖玻片安装至记录腔室中，在腔室内加入适量成像介质或缓冲液（18 mm 盖玻片加 400 µL），然后将其放置于显微镜载物台上。盖上腔室盖以防止介质蒸发。</li>
		<li>通过荧光成像定位同时表达 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞。尽量降低激发光强度，以避免光漂白和光毒性。</li>
		<li>移去盖子，以 10 Hz 开始时间序列记录。在记录过程中向腔室中加入激动剂以诱发 Ca2+ 反应（例如，HeLa 细胞使用组胺，COS-7 细胞使用 ATP）。&#160;</li>
		<li>将时间序列数据保存至硬盘驱动器（HDD）。</li>
		<li>使用图像分析软件对数据进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录表达 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的星形胶质细胞的自发活动 
	注意：若无图像分光光学器件，仍可在同一细胞中分别监测细胞膜和内质网周围的 Ca2+ 信号。此处描述的是在同一星形胶质细胞中依次记录 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 信号的方法。建议使用数值孔径大于 1.3 的油浸物镜以检测自发性 Ca2+ 活动。&#160;
	<ol>
		<li>在记录前至少 30 分钟开启显微镜、相机、光源及显微镜加热腔。</li>
		<li>将含有转染了 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞的盖玻片安装至记录腔室，并加入 400 µL 成像介质。在腔室上方加盖盖子。</li>
		<li>选择适用于 GCaMP6f 的滤光片组和光源（蓝光激发，例如 470–490 nm；见材料表），定位表达 OER-GCaMP6f 的星形胶质细胞。</li>
		<li>选择适用于 RCaMP2 的滤光片组和光源（绿光激发，例如 510–560 nm；见材料表），确认同一星形胶质细胞是否表达 Lck-RCaMP2。避免长时间暴露于光源下，以防光漂白。&#160;</li>
		<li>以 2 Hz 采集 Lck-RCaMP2 的时间序列图像，持续 2 分钟。将成像数据保存至硬盘驱动器（HDD）。</li>
		<li>更换为适用于 GCaMP6f 的滤光片组，在相同视野下以 2 Hz 采集 OER-GCaMP6f 的时间序列图像，持续 2 分钟。将数据保存至硬盘驱动器（HDD）。</li>
		<li>使用图像分析软件对数据进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录神经元的自发活动及诱导性 Ca2+ 升高 
	注意：用于神经元成像的显微镜设置与第 3.2 节所述相同。此处描述的是由 Lck-GCaMP6f 检测的自发性 Ca2+ 升高，以及由 OER-GCaMP6f 检测的因 mGluR 激活而诱导的 Ca2+ 升高。&#160;
	<ol>
		<li>为记录神经元的自发活动，将表达 Lck-GCaMP6f 的细胞所在的盖玻片安装至记录腔室，并加入 400 µL 成像介质。在腔室上方加盖盖子。</li>
		<li>将滤光片和光源设置为适用于 GCaMP6f 的条件（蓝光激发，例如 470–490 nm；见材料表），寻找表达 Lck-GCaMP6f 并呈现自发活动的神经元。</li>
		<li>以 2 Hz 或更快的速度采集图像。将数据保存至硬盘驱动器（HDD）。</li>
		<li>使用图像分析软件对数据进行分析。</li>
		<li>为记录诱导性 Ca2+ 升高，将表达 OER-GCaMP6f 的细胞所在的盖玻片安装至记录腔室，并加入 400 µL 成像介质。在腔室上方加盖盖子。&#160;</li>
		<li>使用适用于 GCaMP6f 的滤光片组，定位表达 OER-GCaMP6f 的神经元。</li>
		<li>移去盖子，以 2 Hz 或更快的速度开始时间序列记录。在记录过程中加入 Gq 蛋白偶联受体的激动剂（例如 mGluR5 激动剂 [RS]-3,5-二羟基苯甘氨酸 [DHPG]），以诱发内质网中的 Ca2+ 释放。</li>
		<li>将时间序列图像保存至硬盘驱动器（HDD），并对数据进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Ca2+信号会引发多种生物学效应。Ca2+是一种多功能的细胞内信号信使。如何解码Ca2+信号以触发特定的生物学响应，一直是基本的生物学问题，因此需要采用Ca2+成像技术来描述Ca2+信号的多样性。本文详细描述的实验方案能够检测细胞质膜和内质网（图3和图4）上的不同Ca2+信号，以及细胞内局部的Ca2+微区（图4和图5），有助于系统描述细胞内Ca2+信号的多样性。通过将基因编码的钙指示剂（GECIs）靶向定位于质膜和内质网，还可提高Ca2+信号的时间分辨率，因为该策略可避免Ca2+及GECIs本身在三维空间中的扩散效应，从而有可能精确检测发生在膜上的Ca2+内流或Ca2+释放的瞬时过程。&#160;
该方案存在一些局限性。用户应牢记，所检测到的信号是“Ca2+内流或释放瞬间”与“从原始Ca2+源扩散出的Ca2+”两者的总和，尤其对于较大的Ca2+信号而言更是如此。例如，尽管组胺（His）刺激HeLa细胞会引发内质网（ER）中Ca2+的释放，但所产生的Ca2+信号不仅可被靶向内质网的OER-GCaMP6f检测到，也可被靶向质膜的Lck-RCaMP2检测到（图3）。另一个局限性在于，Ca2+信号的空间-时间模式可能并非决定Ca2+信号输出的唯一因素。下游效应蛋白（如Ca2+依赖性激酶和磷酸酶）的分布也可能是一个决定性因素2。要完全解析细胞内Ca2+信号，必须对下游酶的行为进行分析，而本方案未涵盖这部分内容。
成功的钙离子（Ca2+）成像最关键的方面之一是成像系统的设置和图像采集条件，这一点与其他活细胞成像研究同样重要。我们先前已证明，细胞内的Ca2+反应高度依赖于激发光的持续时间与强度，以及图像采集条件，包括曝光时间和采集频率16。其中，激发光的功率是最关键的因素，因为它可能导致光毒性以及基因编码钙离子指示剂（GECIs）的光漂白。曝光时间、记录频率、激发光强度和记录时长等记录参数应根据实验目的进行优化。我们建议尽可能降低曝光时间和激发光强度，以避免光漂白和对细胞的光毒性。记录频率和记录时长应足以覆盖感兴趣的Ca2+升高事件，但同时也应尽可能降低，以减少光漂白和光毒性。我们建议首先确定记录频率和记录时长，再优化光照强度和曝光时间，以最大程度地减少GECIs的光漂白。另一个重要因素是GECIs的表达水平。由于GECIs是钙离子结合蛋白，因此具有Ca2+缓冲效应。因此，GECIs的过表达会导致对细胞生理上必需的Ca2+的缓冲作用。应尽量降低GECIs的表达量，以避免对高表达GECIs的细胞进行成像。 
&#160; 
总之，在亚细胞分辨率下解析Ca2+信号是解码决定细胞内生物学效应的Ca2+信号的最重要步骤之一。本实验方案提供了一种新的方法，用于解析Ca2+信号并描述这些信号之间的多样性。目前，该技术主要限于体外实验。然而，Lck-GCaMP6f已开始用于小鼠体内的Ca2+成像17，而OER-GCaMP6f已在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的VD运动神经元中被证实可用于体内Ca2+信号监测7。因此，将GECIs靶向定位于亚细胞区室的技术未来有望拓展至体内成像，从而实现活体条件下的Ca2+信号解析。

Ca2+ 信号代表细胞内 Ca2+ 浓度的升高。Ca2+ 是真核细胞中普遍存在的第二信使。细胞通过多种细胞内信号通路利用 Ca2+ 实现功能，并引发多样的生物学效应。例如，在神经元中，突触前末梢的突触囊泡释放、细胞核内的基因表达以及突触后部位突触可塑性的诱导，均由不同的 Ca2+ 信号所调控；这些信号能够在正确的位置和精确的时间点，特异性地激活相应的下游酶1。&#160;
特定的时空钙信号模式2+ 信号激活特定的下游酶。Ca2+ 信号由两种不同的Ca协调产生2+ 来源：Ca2+ 来自细胞外空间的内流和Ca2+ 内质网（ER）的释放，内质网作为细胞内钙库2+ 储存。有意义的时空Ca2+ 由10–100 µM Ca²⁺纳米结构域支持的信号模式也可诱导特定的细胞功能2+ 在Ca附近产生2+ 质膜或内质网膜上的通道2重要的是，Ca²⁺的来源2+ 信号是决定下游生物学效应的最关键因素之一。在神经元中，Ca2+ 内流和Ca2+ 释放对γ-氨基丁酸（GABA）的聚集具有相反的作用A 受体（GABAAR）位于GABA能突触，负责抑制神经元兴奋性3钙2+ 伴随大规模神经元兴奋的内流导致突触GABA的弥散AR簇，而持续的Ca2+ 内质网释放促进突触GABA的聚集ARs。其他研究团队也报道过，生长锥的转向方向在很大程度上依赖于Ca²⁺的来源。2+ 信号：Ca2+ 内流诱导排斥，而Ca2+ 释放因子引导神经元生长锥的趋化性4因此，为了充分理解Ca2+ 信号通路介导特定细胞反应的机制，识别Ca²⁺的来源至关重要2+ 通过描述Ca信号2+ 亚细胞分辨率下的信号。
在本实验方案中，我们描述了一种钙离子（Ca2+）成像方法，可用于在亚细胞分辨率下记录Ca2+信号，从而推断Ca2+信号的来源（图1）。通过将Src激酶中的质膜定位信号Lck连接至基因编码的Ca2+指示剂（GECIs）的N端，可实现对质膜下方局部Ca2+微区的高效监测5。为了以更高的空间和时间分辨率检测内质网（ER）附近区域的Ca2+信号模式，我们近期开发了OER-GCaMP6f，该指示剂利用内质网跨膜蛋白将GCaMP6f6靶向定位于内质网外膜。在COS-7细胞7和HEK293细胞8中，OER-GCaMP6f能够比传统的非靶向型GCaMP6f更灵敏地报告内质网Ca2+释放，其优势在于避免了Ca2+和GECIs的扩散。我们还证实，OER-GCaMP6f在培养的海马星形胶质细胞中记录到的自发性Ca2+升高事件，其时空动态模式与质膜靶向型GCaMP6f（Lck-GCaMP6f）所监测到的模式存在差异7,9，表明结合使用OER-GCaMP6f与Lck-GCaMP6f进行Ca2+成像，有助于在亚细胞分辨率下解析Ca2+信号并识别其来源。
目前，我们详细描述了在玻璃盖玻片上培养的HeLa细胞以及神经元-星形胶质细胞共培养体系中进行Ca2+信号解析的实验方案。此处所介绍的基于基因编码钙离子指示剂（GECIs）的Ca2+成像技术，包括Lck-GCaMP6f、靶向细胞膜的RCaMP210（Lck-RCaMP2）和OER-GCaMP6f（图1），适用于所有能够表达这些GECIs的细胞类型。

<table><tbody><tr><td>(RS)-3,5-二羟基苯基甘氨酸（DHPG）</td><td>Tocris</td><td>#0342</td><td></td></tr><tr><td>0.5% DNase I 储存液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#11284932001</td><td>在 Hank's 平衡盐溶液中配制 0.5% DNase I（w/v）&amp;nbsp; 添加 120 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;. 准备 160 &amp;micro;L 分装并储存在 -30 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#25300054</td><td></td></tr><tr><td>100 mM L-谷氨酰胺（&amp;times;100 倍浓缩液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#25030081</td><td>准备250-750的小份 aliquot &amp;micro;L 并于 -30 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>100 mM 丙酮酸钠&amp;times;100 倍浓缩液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#11360070</td><td>分装（10 mL）可在 -20 &amp;deg;C. 解冻后，溶液可在4℃保存 &amp;deg;2个月</td></tr><tr><td>12孔低蒸发盖多孔培养板</td><td>Falcon</td><td>#353043</td><td>低蒸发盖对于神经元-胶质细胞共培养至关重要。对于细胞系细胞，可使用其他培养皿。</td></tr><tr><td>直径18 mm的圆形盖玻片</td><td>Karl Hecht &quot;辅助&quot;</td><td>#41001118</td><td>厚度1，直径18 mm的圆形盖玻片；也可使用其他规格的盖玻片。</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15630080</td><td>pH 7.2–7.6</td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶储存液（&amp;times;20 倍浓缩液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T4674</td><td>准备 150 &amp;micro;L 分装并储存在 -30 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>50% 聚乙烯亚胺（PEI）溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3143</td><td>配制 2% (V/V) PEI 储存液&amp;times;50）用经滤膜除菌的蒸馏水稀释。将储备液保存于 -30 &amp;deg;C，在制备250-750的小份样品后 &amp;micro;L. 在盖玻片包被当天，用蒸馏水配制 0.04% PEI 溶液。</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>保存于喷雾瓶中，用于表面消毒。</td></tr><tr><td>腺相关病毒（AAV），用于在EF1a启动子调控下表达Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2和OER-RCaMP2</td><td></td><td></td><td>AAV 可使用 AAV Helper Free System（Agilent Technologies）和 HEK293 细胞制备，也可采用其他方法。pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f、pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 以及&amp;nbsp; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f 可根据要求提供。</td></tr><tr><td>B-27 添加剂（&amp;times;50 倍浓缩液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#17504044</td><td>这可以替换为 B-27 Plus 添加剂（Thermo Fisher Scientific；#A3582801）或 MACS NeuroBrew-21（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国；#130-093-566）。</td></tr><tr><td>B57BL/6</td><td>日本 SLC 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于显微图像记录的相机</td><td></td><td></td><td>以下相机可供使用：制冷CCD相机（例如，Hamamatsu Photonics，OECA-ER）、EM-CCD相机（例如，Hamamatsu Photonics，&amp;nbsp; ImagEM；Andor，iXon）或&amp;nbsp; CMOS相机（例如，Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0）</td></tr><tr><td>细胞冻存容器</td><td>Sarstedt K.K.</td><td>#95.64.253</td><td>可使用其他细胞冻存容器。</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td></td><td></td><td>维持在 37 &amp;deg;℃，5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>康宁</td><td>#430661</td><td>可使用其他类型的冷冻管。</td></tr><tr><td>冷冻保存培养基</td><td>Zenoaq</td><td></td><td>&quot;CELLBANKER1&quot;</td></tr><tr><td>培养基（用于HeLa细胞）</td><td></td><td></td><td>添加10%热灭活胎牛血清和青霉素-链霉素溶液（终浓度：青霉素100 U/mL和链霉素100）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>解剖液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1 毫升 1 M HEPES（终浓度 20 mM）加入 49 毫升 DMEM 中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>#08456-65</td><td>可使用其他种类的DMEM。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>#08456-65</td><td>低葡萄糖</td></tr><tr><td>DNA转染试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#6366244001</td><td>&quot;X-tremegene HP DNA 转染试剂&quot;&lt;br/&gt; 可使用其他转染试剂。</td></tr><tr><td>带盖玻璃罐</td><td></td><td></td><td>用于麻醉动物的 500 mL（小鼠）或 1,500 mL（大鼠）广口瓶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#14170161</td><td>无钙镁 HBSS</td></tr><tr><td>热灭活牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#10100147</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>理化学研究所生物资源中心</td><td>#RCB0007</td><td></td></tr><tr><td>组胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H7125</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td></td><td></td><td>例如 Metamorph（Molecular Devices）、ImageJ（NIH）和 TI Workbench14（定制）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>图像分光光学器件</td><td>滨松光子学</td><td>#A12801-01</td><td>W-view GEMINI</td></tr><tr><td>图像分光光学二向色镜</td><td>Semrock</td><td>#FF560-FDi01-25&amp;times;36</td><td>用于绿色荧光蛋白/红色荧光蛋白的分离&amp;nbsp; （GFP/RFP）信号</td></tr><tr><td>图像分光光学发射滤光片</td><td>Semrock</td><td>#FF01-512/25-25，#FF01-630/92-25</td><td>分别用于GFP/RFP信号的发射</td></tr><tr><td>成像培养基与缓冲液</td><td></td><td></td><td>使用适合实验的培养基或缓冲液。若使用培养基，建议选用不含酚红的培养基，以减少背景荧光。添加 20 mM HEPES 以在非 CO₂ 培养环境中维持 pH 值。&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td></tr><tr><td>孵育液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>加入1 mL 1 M HEPES（终浓度20 mM）至49 mL HBSS中</td></tr><tr><td>倒置荧光显微镜</td><td></td><td></td><td>例如 IX73（Olympus）或&amp;nbsp; Eclipse TI (Nikon Instech)</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Pfizer</td><td></td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>维持培养基（用于4 &amp;times; 12 孔板</td><td></td><td></td><td>48.5 mL Neurobasal-A 培养基，添加 1 mL B-27、500 &amp;micro;L-谷氨酰胺储备液和25 &amp;micro;L-青霉素-链霉素溶液。</td></tr><tr><td>冻存皮质细胞的维持培养基（配制1 L） &amp;times; 12 孔板&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>12.2 mL 添加了250的Neurobasal完全培养基 &amp;micro;L B-27，125 &amp;micro;L 谷氨酰胺储备液和 6.2 &amp;micro;L 青霉素-链霉素溶液。</td></tr><tr><td>最小必需培养基（Minimum Essential Medium, MEM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#11090-081</td><td></td></tr><tr><td>用于GCaMP6f成像的显微镜滤光片组</td><td></td><td></td><td>适用于GFP的滤光片（激发光，480 &amp;plusmn; 10 nm；发射，530 &amp;plusmn; 20 nm</td></tr><tr><td>用于RCaMP2成像的显微镜滤光片组</td><td></td><td></td><td>适用于RFP的滤光片（激发光，535 &amp;plusmn; 50 nm；发射，590 nm 长通</td></tr><tr><td>用于RCaMP2与GCaMP6f双通道成像的显微镜滤光片组</td><td>Semrock</td><td>#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&amp;times;36, #FF01-512/630-25</td><td>GFP/RFP成像用双激发滤光片、双二向色镜和发射滤光片</td></tr><tr><td>显微镜加热系统</td><td></td><td></td><td>用于维持细胞在 37 ℃ 的加热系统 &amp;deg;成像过程中保持恒温。为避免热膨胀引起的漂移，建议使用覆盖整个显微镜本体的加热系统（例如 Tokai Hit，Thermobox）。</td></tr><tr><td>用于激发的显微镜光源</td><td></td><td></td><td>汞灯（100 W）、氙灯（75 W）、发光二极管（LED）照明系统（例如 CoolLED Ltd.，precisExcite；Thorlabs Inc.，4-Wavelength LED Source；Lumencor，SPECTRA X light engine）。若使用汞灯或氙灯，需使用中性密度滤光片（ND滤光片）以降低激发光强度。</td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td></td><td></td><td>建议使用数值孔径高于1.3的Plan-Apochromat油浸物镜，以记录自发性Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 神经元和星形胶质细胞中的活动。</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#10888022</td><td>Neurobasal plus 培养基（Thermo Fisher，A3582901）可替代 Neurobasal-A 培养基使用。</td></tr><tr><td>PBS(-)：无钙磷酸盐缓冲液&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>富士胶片和光纯药株式会社</td><td>#164-23551</td><td>钙离子信号缺失&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 关键在于不能抑制胰蛋白酶的活性。可使用不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS(-)）的替代溶液。</td></tr><tr><td>PC 与图像采集软件</td><td></td><td></td><td>例如 Metamorph（Molecular Devices）；Micromanager；TI Workbench&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15140122</td><td>青霉素 10,000 U/mL 和链霉素 10,000 &amp;micro;g/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>在巨细胞病毒启动子下表达 Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2 和 OER-RCaMP2 的质粒 &lt;sup&gt;7-9&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>应要求提供</td></tr><tr><td>铺板培养基（用于4 &amp;times; 12 孔板</td><td></td><td></td><td>48 mL MEM 添加 1 mL B-27 补充剂、500 &amp;micro;L-谷氨酰胺储备液（终浓度：2 mM），500 &amp;micro;L 毫摩尔浓度为 1 mM 的丙酮酸钠储备液和 25 &amp;micro;L 青霉素-链霉素溶液（青霉素 5 U/mL，链霉素 5 &amp;micro;g/mL）。该浓度的青霉素-链霉素为1/20&amp;nbsp; 厂家推荐的浓度对神经元存活至关重要。</td></tr><tr><td>记录室</td><td>Elveflow</td><td>Ludin室</td><td>该记录室适用于直径为18 mm的圆形盖玻片。</td></tr><tr><td>低血清培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11058021</td><td>Opti-MEM</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td>用于解剖海马体。可使用 Olympus SZ60 或同等型号的体视显微镜。</td></tr><tr><td>手术器械</td><td></td><td></td><td>标准解剖剪用于剪开小鼠或大鼠的腹部，镊子用于夹取子宫，精细解剖剪用于剪切子宫和胚胎头部，环形镊用于夹取胚胎，13 cm 弯曲Semken镊（Fine Science Tools #11009-13）用于取出脑组织，&amp;nbsp; 3 把尖头镊子&amp;nbsp; （Dumont Inox #5）</td></tr><tr><td>神经元转染试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#L3000008</td><td>&quot;Lipofectamine 3000&quot; 试剂&lt;br/&gt; 它由 &quot;补充剂（P3000）&quot; 在步骤 2.2.3 中应与质粒 DNA 混合的 &quot;转染试剂（Lipofectamine 3000）&quot; 用于步骤 2.2.4 中</td></tr><tr><td>台盼蓝（0.4%）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15250061</td><td></td></tr><tr><td>冻存皮层细胞洗涤液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>25 mL DMEM，添加250 &amp;micro;升 热灭活胎牛血清 + 12.5 &amp;micro;青霉素链霉素溶液</td></tr><tr><td>Wistar 大鼠</td><td>Japan SLC, Inc</td><td></td><td>怀孕大鼠（E18）</td></tr></tbody></table>

局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

钙离子（Ca2+) 是一种普遍存在的细胞内信使分子，可激活多条信号通路，从而产生多种生物学效应。两个 Ca2+ 信号源—“Ca2+ 细胞外的“内流”和“Ca2+ 从内质网（ER）这一细胞内Ca2+储存库中释放——被认为是介导Ca2+多种时空动态模式的基础2+ 导致细胞多种生物学功能的信号。本实验方案的目的是描述一种新的 Ca2+ 成像方法，可实现对“Ca瞬间的监测2+ 内流”和“Ca2+ 释放”。OER-GCaMP6f 是一种基因编码的 Ca2+ 指示剂（GECI），包含靶向内质网外膜的GCaMP6f。OER-GCaMP6f可用于监测Ca2+ 比传统的GCaMP6f具有更高的时间分辨率。结合靶向细胞膜的GECIs，可实现对钙信号的时空动态检测2+ 信号模式可在亚细胞分辨率下进行描述。亚细胞定位的 Ca2+ 此处描述的指示剂原则上适用于所有细胞类型，甚至适用于活体成像 秀丽隐杆线虫 神经元。在本方案中，我们介绍 Ca2+ 在细胞系、原代分离培养的神经元和胶质细胞中进行成像，并描述大鼠皮层神经元冻存储备的制备方法。

Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 在转染后 24 小时于 HeLa 细胞中表达，并使用图像分光光学系统同时记录两种信号图 3A 和 视频 1）。图像以10 Hz的频率采集。组胺（His, 1 µM)，这会诱导 Ca2+ 从内质网释放的物质在记录期间加入。加入His后，Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的信号强度增加，伪彩色图显示了ΔF/F0的变化，即相对于初始荧光强度的变化值图3B）。Ca²⁺ 的时间过程2+ 由 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 报告的同一兴趣区域（ROI）内的荧光强度变化（ΔF/F0）进行了比较图3C）。为了比较两种表达水平和分布不同的GECI，将ΔF/F0值归一化为其峰值。两种传感器均报告了类似振荡的Ca2+ 升高。Lck-RCaMP2 与 OER-GCaMP6f 的钙信号时间过程一致2+ 在所检测的五种细胞类型中，有两种细胞出现升高图3C，ROI 1 和 3）。然而，Ca2+ Lck-RCaMP2 显示的钙离子水平较 OER-GCaMP6f 保持在更高水平图3C，ROI 2、4 和 5）。结果表明，Ca2+ 细胞膜附近的钙离子浓度升高持续时间较长，而在内质网（ER）周围则较早终止，因为内质网是该钙离子的来源2+ 由His刺激诱导的信号 
通过 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 可观察到大鼠海马（图 4A）和皮层（图 4B）神经元-星形胶质细胞共培养体系中星形胶质细胞的自发性 Ca2+ 信号（图 4、视频 2、视频 3、视频 4 和 视频 5）。皮层培养物由本实验方案所述方法制备的冻存细胞复苏而来。对同一细胞依次以 2 Hz 频率记录 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 信号。在每种 GECI 显示 Ca2+ 升高的区域选择三个 ROI，分析 ΔF/Fbase（即荧光强度）随时间的变化，其中 Fbase 为整个记录期间的平均荧光强度。当基础荧光稳定且 Ca2+ 升高事件较少时，Fbase 可作为检测 Ca2+ 升高事件的有效基线。自发性 Ca2+ 升高仅出现在星形胶质细胞的突起中，而不在胞体中出现。该结果与先前使用其他 GECI 在体外13 和体内14 观察到的星形胶质细胞自发性 Ca2+ 信号报道一致。在海马和皮层星形胶质细胞中，Lck-RCaMP2（上图）显示的 Ca2+ 升高事件频率均高于 OER-GCaMP6f。该结果与我们先前的研究一致，即使用 Lck-GCaMP6f 检测到的星形胶质细胞 Ca2+ 升高事件比 OER-GCaMP6f 更频繁7，并提示这一现象在单细胞水平同样适用。
在未成熟的大鼠海马神经元（10 DIV）中，通过 Lck-GCaMP6f 观察到自发的 Ca2+ 升高，频率为 2 Hz（图 5A 和 视频 6）。五个不同 ROI 的 ΔF/F0 时间过程表明，这些 Ca2+ 升高局限于亚细胞区域。 图 5B（视频 7）显示了感染表达 OER-GCaMP6f 的 AAV 载体的成熟小鼠海马神经元（30 DIV）中的 Ca2+ 反应。使用 100 µM DHPG 刺激神经元，DHPG 是代谢型谷氨酸受体的激动剂，可诱导 Ca2+ 释放。检测到了由 OER-GCaMP6f 报告的 DHPG 诱导的 Ca2+ 释放。
<img alt="显示使用 Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 指示剂进行 Ca2+ 信号检测的细胞示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：显示膜靶向 GECI 的示意图。 质膜靶向 GECI（Lck-GCaMP6f 和 Lck-RCaMP2）以及外层内质网膜靶向 GCaMP6f（OER-GCaMP6f）的示意图。
<img alt="皮层细胞制备流程图：培养、冻存、复苏和转染步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：海马和皮层细胞制备、质粒转染及 AAV 感染的流程图。 显微图像分别代表刚接种的 DIV-6 皮层细胞（左）和从冻存细胞库中复苏的细胞（右）。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f对Ca2+动态进行荧光显微成像的示意图与数据，组胺刺激后。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：在HeLa细胞中同时成像Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的示例。（A）利用图像分光光学元件实现信号分离的示意图。Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的同一视野被同时投射到相机上。由CMOS相机以10 Hz采集的代表性记录见视频1，该记录中的一个帧显示在图版A（右）。（B）Lck-GCaMP2（上）和OER-GCaMP6f（下）的ΔF/F0伪彩图像。在0 s时加入组胺（His，1 µM）。（C）Lck-GCaMP2（品红色）和OER-GCaMP6f（绿色）归一化的ΔF/F0时间过程的代表性曲线。数据被归一化至每条曲线的最大ΔF/F0值。灰色条表示组胺施加的时间点。数据分析使用自定义软件TI Workbench15完成。比例尺 = 50 µm（显微图像）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经元钙成像示意图；荧光信号轨迹；ΔF/F 分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：自发性Ca2+ 通过 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 表达监测星形胶质细胞中的升高。 (A代表性海马体和（B) 转染了 Lck-RCaMP2（上）和 OER-GCaMP6f（下）的皮层星形胶质细胞。皮层细胞由冻存培养物复苏获得。Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 图像在同一细胞中以 2 Hz 频率用 EM-CCD 相机依次采集。左侧曲线图显示显微图像中标注的感兴趣区域（ROI）内测得的 ΔF/Fbase 随时间变化过程。数据使用 TI Workbench 进行分析。实际动态影像见 视频 2, 视频 3， 视频 4，以及 视频 5比例尺 = 20 µm （显微图像）。基线漂移表明全局 Ca 的变化2+ 细胞内的水平  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经元钙成像与ΔF/F₀曲线；荧光显微镜；突触活性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：表达Lck-GCaMP6f和OER-GCaMP6f的神经元中钙离子（Ca2+）成像示例。（A）第10天体外培养（DIV 10）的大鼠海马神经元表达Lck-GCaMP6f的代表性图像（左图），以及在图像中标示的感兴趣区域（黄色圆圈）内测得的ΔF/F₀随时间变化的曲线（右图）。时间曲线上标注的数字对应于图像中各感兴趣区域的编号。注意，不同感兴趣区域的Ca2+升高时间模式存在差异。基线漂移提示该神经元内整体Ca2+水平上升。（B）成熟小鼠海马神经元（DIV 30）感染OER-GCaMP6f表达型AAV载体后的示例（左图）。右图为测得的ΔF/F₀随时间变化曲线，显示在灰色条所示时间点施加100 µM (RS)-3,5-二羟基苯甘氨酸（DHPG）后引发的Ca2+反应。黄色圆圈标示获取时间曲线的感兴趣区域位置。图像使用制冷CCD相机（图A）或EM-CCD相机（图B）以2 Hz频率采集，并通过TI Workbench软件进行分析。比例尺 = 20 µm（显微图像）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的荧光显微成像；细胞成像，钙离子动态。" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="视频 1"> 
视频 1：HeLa 细胞中 Lck-RCaMP2 与 OER-GCaMP6f 同时成像的示例。 代表性记录以 10 Hz 采集，见图 3。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="显微镜图像、神经元活动可视化、海马体、荧光、神经网络图谱。" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="视频 2"> 
视频 2：在海马体星形胶质细胞的 Lck-RCaMP2 中观察到的自发性 Ca2+ 瞬变。 以 2 Hz 采集的代表性记录（图 4A），与视频 3在相同的视野中记录。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="神经元钙成像，海马体，荧光显微镜，动态活动追踪。" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="视频 3"> 
视频 3：在海马体星形胶质细胞的 OER-GCaMP6f 中观察到的自发性 Ca2+ 瞬变。 以 2 Hz 采集的代表性记录（图 4A），与视频 2处于同一视野。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="荧光显微镜，Lck-RCaMP2，皮层神经元活动成像，脑细胞分析。" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="视频 4"> 
视频 4：在皮层星形胶质细胞的 Lck-RCaMP2 中观察到的自发性 Ca2+ 瞬变 以 2 Hz 采集的代表性记录（图 4B），与 视频 5 在同一视野中记录。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="大脑皮层中的神经元活动、钙成像、显微镜图像、荧光可视化。" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="视频 5"> 
视频 5：在皮层星形胶质细胞的 OER-GCaMP6f 中观察到的自发性 Ca2+ 瞬变。 该代表性记录以 2 Hz 采集（图 4B），与 视频 4 为同一视野。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="神经元细胞成像，荧光显微镜，神经元结构，树突可视化，20 μm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Video 6"> 
视频 6：通过 Lck-GCaMP6f 对大鼠海马神经元（DIV 10）进行 Ca2+ 成像的示例。以 2 Hz 记录的神经元 Ca2+ 信号示例（图 5A）。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
<img alt="神经网络神经元的荧光显微图像，突出显示细胞连接性与结构。" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="视频 7"> 
视频 7：表达 OER-GCaMP6f 的小鼠海马神经元中的 Ca2+ 释放（DIV 30）。 记录感染 OER-GCaMP6f 表达型 AAV 载体的小鼠海马神经元中神经元 Ca2+ 信号的示例（图 5B）。通过在 30 秒时施加 100 µM 二羟基苯基甘氨酸（DHPG）刺激神经元，以诱导内质网中 Ca2+ 的释放。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本文介绍了一种用于神经元和胶质细胞中钙离子（Ca2+）成像的实验方案，可实现亚细胞水平上Ca2+信号的解析。该方法适用于所有能够表达基因编码Ca2+指示剂的细胞类型。

局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

钙离子（Ca2+）是一种普遍存在的细胞内信使分子，可驱动多种信号通路，从而产生多样的生物学效应。

在亚细胞分辨率下解析钙信号，是解码决定细胞内生物学现象输出的关键步骤之一。本方案描述了一种新的钙成像方法，能够监测钙离子流入和钙释放的精确时刻。该方案适用于所有能够表达基因编码钙指示剂的细胞类型。我们认为，我们的方法有望扩展应用于实验室培养的活体动物中亚细胞分辨率的钙信号解析。本实验操作将由本实验室的技术员 Matsumi Hirose 协助演示。开始此操作时，将直径为 18 毫米的玻璃盖玻片放入 12 孔板的每个孔中。使用无菌水，为每个使用的 12 孔板配制 12.5 毫升 0.4% PEI 溶液。向每个孔中加入 1 毫升 PEI 溶液，并确保盖玻片下方无气泡。在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中过夜孵育。第二天，使用移液器吸除PEI溶液。向每个孔中加入1毫升无菌水，并振荡培养板，使盖玻片与培养板之间的PEI溶液充分洗出。用新鲜的无菌水重复此洗涤步骤两次。最后一次洗涤后，彻底吸出每个孔中的水。在通风橱内，使用紫外灯对盖玻片进行至少15分钟的干燥和灭菌。PEI包被的培养皿可在4摄氏度下保存长达两个月。准备就绪后，在使用前用紫外光照射培养皿15分钟。在孔之间的空间中加入5毫升无菌蒸馏水，以防止培养基蒸发。首先，用孵育用生理盐水清洗皮质组织。然后，将皮质组织在含有胰蛋白酶和DNA酶的孵育盐水中于37摄氏度孵育5分钟。接着，用预冷的孵育盐水洗涤皮质组织三次。去除上清液，加入2毫升铺板培养基，并补充150微升DNA酶I储备液。通过移液器吹打二十次或更少次数使细胞解离，并通过孔径为70微米的细胞筛过滤细胞。接着，用20毫升铺板培养基清洗细胞筛。对于冻存细胞库的制备，用20毫升洗涤培养基清洗细胞。用铺板培养基将皮层细胞稀释至每毫升含140 000个活细胞的密度。然后，取1毫升稀释后的细胞悬液加入12孔板中经PEI包被的盖玻片上。将细胞置于37°C的二氧化碳培养箱中培养2至3天。细胞接种后两到三天，待其状态稳定时，将培养基更换为维持培养基。制备冻存细胞时，使用摆动转子离心机以187 × g离心3分钟收集细胞。吸除上清液后，加入保存在4°C的冷冻保存液，调整细胞密度至每毫升含1000万个细胞。将一毫升细胞悬液分装至冻存管中。将冻存管放入细胞冻存盒中，以每分钟降低1°C的速率进行冷冻，直至温度降至-80°C。随后将冻存盒转移至-80°C超低温冰箱中保存。为复苏冻存的细胞，预先将冻存皮质细胞的洗涤培养基和维持培养基预热。随后，在37摄氏度水浴中快速解冻冻存细胞。用预热的洗涤培养基轻柔稀释细胞，并使用摆动转子离心机在187 × g条件下离心3分钟。将沉淀重悬于1毫升洗涤培养基中，并测定活细胞密度。随后，用冻存皮质细胞的维持培养基稀释细胞，使细胞密度达到每毫升300 000个细胞。取1毫升该细胞悬液加入经PEI包被的12孔板的各孔中。在接种后三至八天进行转染，标记两个离心管，一个用于质粒DNA，另一个用于转染试剂。向每管中各加入50微升低血清培养基。向质粒DNA管中，每盖玻片加入0.5微克质粒DNA，每孔加入1微升神经元转染试剂配套的添加剂。共转染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f时，每孔加入0.5微克每种质粒和1微升添加剂至50微升低血清培养基中，混匀。接着，每孔加入1微升转染试剂至转染试剂管中。将两个管涡旋震荡1至2秒。然后，将转染试剂混合物加入DNA混合物中。轻轻吹打混匀，并在室温下孵育5分钟。以逐滴加入的方式将此混合物加到细胞中。在二氧化碳培养箱中孵育两到三天，直至标记蛋白表达。将 L 和 O 混合以制备 AAC 感染液。每孔加入三微升 AAC 至混合的神经元-星形胶质细胞培养物中。轻轻摇晃培养皿以混匀。培养一至两周，直至GECIs表达。首先将含有转染了Lck-RCaMP2和OER-CaMPG6f的细胞的盖玻片装入显微镜的记录室中。加入 400 微升成像培养基，并在腔室上加盖盖子。选择适用于 GCaMP6f 的滤光片组和光源。找到表达 OER-GCaMP6f 的星形胶质细胞。接下来，为 RCaMP2 选择合适的滤光片组和光源，并确认 Lck-RCaMP2 是否在同一群星形胶质细胞中表达。以每秒两帧的速率连续采集 Lck-RCaMP2 的时间序列图像，持续两分钟，并保存成像数据。之后，将滤光片组切换回适用于 GCaMP6f 的设置。以每秒两帧的频率记录 OER-GCaMP6f 持续两分钟的时间序列图像，并保存成像数据。在本研究中，转染 24 小时后，Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 在 HeLa 细胞中表达，并使用图像分光光学系统同时记录两种信号。加入组胺后，Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的信号强度均增加。在相同的感兴趣区域中，比较了Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f报告的钙离子升高的时间过程。两种传感器均报告了类似振荡的钙离子升高现象，且在所检测的五个细胞中的两个细胞中表现出相同的时间过程。然而，Lck-RCaMP2 显示的钙离子升高水平在其他细胞中仍高于 OER-GCaMP6f。这些结果表明，钙离子升高在质膜附近持续时间较长，而在内质网（ER）周围则较早终止，而内质网正是组胺刺激所诱导的钙离子信号的来源。在来自大鼠海马和皮层的神经元-星形胶质细胞共培养体系中，星形胶质细胞的自发性钙离子信号由 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 所显示。自发性钙离子升高仅在星形胶质细胞的突起中可见，而在细胞体中不可见，这与以往的报道一致。在未成熟大鼠海马神经元中，通过Lck-GCaMP6f检测到的自发性钙离子升高频率为每秒两次。五个不同感兴趣区域的时间进程表明，这些钙离子升高局限于亚细胞区域，具有局部性特征。感染了表达OER-GCaMP6f的AAV病毒载体的成熟小鼠海马神经元在加入DHPG后表现出钙离子反应。进行钙成像时，激发光强度是最关键的因素。请尽可能降低激发光强度，以避免光漂白和光毒性。可通过使用钙通道特异性抑制剂的Pomakorzi进一步确认钙信号的来源。解析钙信号以引发特定输出一直是生物学中的一个基本问题。该钙成像技术为描述细胞内钙信号的多样性奠定了基础。

dissection-local-ca2-signals-cultured-cells-membrane-targeted-ca2

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

膜靶向 ca 2 + 指标对培养细胞中局部 Ca2 +信号的解剖

内质网在蛋白质生物合成和钙稳态中起关键作用。我们已建立一个实验系统，可用于研究Ca2+泄漏通道的作用，并表征其可能的调控机制。该系统包括siRNA介导的基因沉默和活细胞Ca2+成像。...

活细胞钙成像结合siRNA介导的基因沉默技术鉴定内质网膜上的Ca2+渗漏通道及其调控机制

对暴露于亲脂性染料FM1-43的细胞进行活体成像，可精确测定孔形成毒素从质膜上被清除的动力学过程。该方法是一种灵敏的检测手段，可用于评估Ca2+、鞘磷脂酶及其他因素在质膜修复过程中的作用需求。...

活体成像实验用于评估Ca2+和鞘磷脂酶在孔形成毒素损伤修复中的作用

Ca2+ 信号调控植物中多种多样的生物学过程。本文介绍了利用基因编码的 Ca2+ 探针 Aequorin 或 Case12，监测非生物胁迫在拟南芥细胞和组织中诱导产生的时空 Ca2+...

测量拟南芥植物中的空间和时间Ca2+信号

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca2+指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP3介导的局部Ca2+事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。...

培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。...

使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+...

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

本文概述了一种利用基态耗尽（GSD）超分辨率显微技术在哺乳动物细胞中检测一种或多种血浆和/或细胞内膜蛋白的实验方案。本文讨论了采用此类方法在细胞蛋白可视化与定量分析中的优势及注意事项。...

基态耗尽超分辨率成像在哺乳动物细胞中的应用

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

基因编码的 Ca2+ 指示剂（GECIs）彻底改变了原位Ca2+ 进行成像。为了从此类记录中最大限度地回收数据，需对Ca2+ 信号是必需的。本文中的方案有助于Ca的定量分析2+...

时空映射与颗粒分析技术在原位定量细胞内 Ca2+ 信号传导中的应用

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

本文提供了一种全面的实验方案，利用荧光显微镜检测原代小鼠和人T细胞中的初始局部Ca2+信号（即Ca2+微区）。该方案可为研究免疫细胞内Ca2+信号通路及其功能的科研人员提供重要参考。...

成像初始Ca2+微区在原代T细胞中的研究

了解膜靶向钙离子成像技术，用于解析培养神经元和胶质细胞中亚细胞水平的局部钙信号动态。该方法利用基因编码钙指示剂实现高分辨率实时监测，为神经科学研究提供重要工具。

局部钙信号的分离²⁺ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号²⁺ 指示剂

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