局部钙信号的分离²⁺ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号²⁺ 指示剂

在亚细胞分辨率下解析钙信号，是解码决定细胞内生物学现象输出的关键步骤之一。本方案描述了一种新的钙成像方法，能够监测钙离子流入和钙释放的精确时刻。该方案适用于所有能够表达基因编码钙指示剂的细胞类型。

我们认为，我们的方法有望扩展应用于实验室培养的活体动物中亚细胞分辨率的钙信号解析。本实验操作将由本实验室的技术员 Matsumi Hirose 协助演示。开始此操作时，将直径为 18 毫米的玻璃盖玻片放入 12 孔板的每个孔中。

使用无菌水，为每个使用的 12 孔板配制 12.5 毫升 0.4% PEI 溶液。向每个孔中加入 1 毫升 PEI 溶液，并确保盖玻片下方无气泡。在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中过夜孵育。

第二天，使用移液器吸除PEI溶液。向每个孔中加入1毫升无菌水，并振荡培养板，使盖玻片与培养板之间的PEI溶液充分洗出。用新鲜的无菌水重复此洗涤步骤两次。

最后一次洗涤后，彻底吸出每个孔中的水。在通风橱内，使用紫外灯对盖玻片进行至少15分钟的干燥和灭菌。PEI包被的培养皿可在4摄氏度下保存长达两个月。

准备就绪后，在使用前用紫外光照射培养皿15分钟。在孔之间的空间中加入5毫升无菌蒸馏水，以防止培养基蒸发。首先，用孵育用生理盐水清洗皮质组织。

然后，将皮质组织在含有胰蛋白酶和DNA酶的孵育盐水中于37摄氏度孵育5分钟。接着，用预冷的孵育盐水洗涤皮质组织三次。去除上清液，加入2毫升铺板培养基，并补充150微升DNA酶I储备液。

通过移液器吹打二十次或更少次数使细胞解离，并通过孔径为70微米的细胞筛过滤细胞。接着，用20毫升铺板培养基清洗细胞筛。对于冻存细胞库的制备，用20毫升洗涤培养基清洗细胞。

用铺板培养基将皮层细胞稀释至每毫升含140 000个活细胞的密度。然后，取1毫升稀释后的细胞悬液加入12孔板中经PEI包被的盖玻片上。将细胞置于37°C的二氧化碳培养箱中培养2至3天。

细胞接种后两到三天，待其状态稳定时，将培养基更换为维持培养基。制备冻存细胞时，使用摆动转子离心机以187 × g离心3分钟收集细胞。吸除上清液后，加入保存在4°C的冷冻保存液，调整细胞密度至每毫升含1000万个细胞。

将一毫升细胞悬液分装至冻存管中。将冻存管放入细胞冻存盒中，以每分钟降低1°C的速率进行冷冻，直至温度降至-80°C。随后将冻存盒转移至-80°C超低温冰箱中保存。

为复苏冻存的细胞，预先将冻存皮质细胞的洗涤培养基和维持培养基预热。随后，在37摄氏度水浴中快速解冻冻存细胞。用预热的洗涤培养基轻柔稀释细胞，并使用摆动转子离心机在187 × g条件下离心3分钟。

将沉淀重悬于1毫升洗涤培养基中，并测定活细胞密度。随后，用冻存皮质细胞的维持培养基稀释细胞，使细胞密度达到每毫升300 000个细胞。取1毫升该细胞悬液加入经PEI包被的12孔板的各孔中。

在接种后三至八天进行转染，标记两个离心管，一个用于质粒DNA，另一个用于转染试剂。向每管中各加入50微升低血清培养基。向质粒DNA管中，每盖玻片加入0.5微克质粒DNA，每孔加入1微升神经元转染试剂配套的添加剂。

共转染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f时，每孔加入0.5微克每种质粒和1微升添加剂至50微升低血清培养基中，混匀。接着，每孔加入1微升转染试剂至转染试剂管中。将两个管涡旋震荡1至2秒。

然后，将转染试剂混合物加入DNA混合物中。轻轻吹打混匀，并在室温下孵育5分钟。以逐滴加入的方式将此混合物加到细胞中。

在二氧化碳培养箱中孵育两到三天，直至标记蛋白表达。将 L 和 O 混合以制备 AAC 感染液。每孔加入三微升 AAC 至混合的神经元-星形胶质细胞培养物中。

轻轻摇晃培养皿以混匀。培养一至两周，直至GECIs表达。首先将含有转染了Lck-RCaMP2和OER-CaMPG6f的细胞的盖玻片装入显微镜的记录室中。

加入 400 微升成像培养基，并在腔室上加盖盖子。选择适用于 GCaMP6f 的滤光片组和光源。找到表达 OER-GCaMP6f 的星形胶质细胞。

接下来，为 RCaMP2 选择合适的滤光片组和光源，并确认 Lck-RCaMP2 是否在同一群星形胶质细胞中表达。以每秒两帧的速率连续采集 Lck-RCaMP2 的时间序列图像，持续两分钟，并保存成像数据。之后，将滤光片组切换回适用于 GCaMP6f 的设置。

以每秒两帧的频率记录 OER-GCaMP6f 持续两分钟的时间序列图像，并保存成像数据。在本研究中，转染 24 小时后，Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 在 HeLa 细胞中表达，并使用图像分光光学系统同时记录两种信号。加入组胺后，Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的信号强度均增加。

在相同的感兴趣区域中，比较了Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f报告的钙离子升高的时间过程。两种传感器均报告了类似振荡的钙离子升高现象，且在所检测的五个细胞中的两个细胞中表现出相同的时间过程。

然而，Lck-RCaMP2 显示的钙离子升高水平在其他细胞中仍高于 OER-GCaMP6f。这些结果表明，钙离子升高在质膜附近持续时间较长，而在内质网（ER）周围则较早终止，而内质网正是组胺刺激所诱导的钙离子信号的来源。在来自大鼠海马和皮层的神经元-星形胶质细胞共培养体系中，星形胶质细胞的自发性钙离子信号由 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 所显示。

自发性钙离子升高仅在星形胶质细胞的突起中可见，而在细胞体中不可见，这与以往的报道一致。在未成熟大鼠海马神经元中，通过Lck-GCaMP6f检测到的自发性钙离子升高频率为每秒两次。五个不同感兴趣区域的时间进程表明，这些钙离子升高局限于亚细胞区域，具有局部性特征。

感染了表达OER-GCaMP6f的AAV病毒载体的成熟小鼠海马神经元在加入DHPG后表现出钙离子反应。进行钙成像时，激发光强度是最关键的因素。请尽可能降低激发光强度，以避免光漂白和光毒性。

可通过使用钙通道特异性抑制剂的Pomakorzi进一步确认钙信号的来源。解析钙信号以引发特定输出一直是生物学中的一个基本问题。该钙成像技术为描述细胞内钙信号的多样性奠定了基础。