在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本文所述方法使我们能够研究实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化动物模型）中免疫细胞跨越脑屏障的分子机制。通过在空间上关联脑组织切片中免疫细胞浸润的位置，同时检测血脑屏障通透性和基质金属蛋白酶活性，我们可以精确地将这些神经炎症事件与EAE的临床症状相关联。对患病小鼠的专业操作需要经过深入培训，以及对EAE临床症状的准确评分。

因此，直观的演示非常有益。按照文本方案所述，在特定无病原体条件下饲养的C57-Black/6小鼠，首先对其进行麻醉。用一只手固定麻醉后的小鼠，将30 µL MOG多肽与完全弗氏佐剂乳化液在靠近腹股沟淋巴结处，分别皮下注射至后肢两侧 flank 部位。

现在将小鼠置于腹部位置，在尾根部左右两侧的柔软脂肪组织中各注射 20 µL MOG 肽乳剂。同时，向小鼠颈部皮下注射少量乳剂。向小鼠腹腔内注射 100 µL 百日咳毒素溶液。

将小鼠头部固定在身体中心下方，以避免注射到肠道。在预期的临床疾病发生前和期间，将维持饮食更换为繁殖饮食，以提供更高能量的食物。在首次处理后的48小时重复百日咳毒素注射。

每天早晨通过观察笼内情况检查EAE小鼠的健康状况。每天下午对EAE小鼠进行评分。将EAE实验中每只单独的小鼠从笼中取出，检查其尾巴是否有张力。

用手指将小鼠尾巴向上移动。健康的小鼠会保持尾巴上扬。如果临床EAE已经发生，尾巴张力会降低，表现为尾巴逐渐下垂。

最终，小鼠将完全无法抬起尾巴。将EAE实验中涉及的每只小鼠单独放置于洁净台面上，观察并记录其行走行为。疾病严重程度的评估标准（即EAE评分）详见正文。

记录并评估实验中每只小鼠的体重。配制葡聚糖储备液时，将10毫克3千道尔顿的德克萨斯红葡聚糖溶解于500微升0.9%氯化钠溶液中，将5毫克10千道尔顿的Alexa Fluor 488葡聚糖溶解于250微升0.9%氯化钠溶液中。配制葡聚糖工作液时，在注射前，用移液器将55微升10千道尔顿Alexa Fluor 488葡聚糖储备液滴加至一片封口膜上。

然后，加入55 µL的3 kDa德克萨斯红葡聚糖储备液。混匀后，用一次性细针筒收集100 µL溶液。接着，将麻醉后的小鼠置于实验台上，保持侧卧位。

在小鼠苏醒前，经静脉注射 100 微升荧光示踪剂。示踪剂循环 15 分钟后，按照文本方案中所述步骤对小鼠进行灌注。取一个平底杜瓦瓶，装入粉碎的干冰，并加入 2-甲基丁烷，直至液面高出干冰约 1 厘米。

用一个松动的盖子（如冰桶盖）盖住。用锋利的剪刀剪下灌注小鼠的头部后，使用较小的剪刀去除皮肤和耳朵。小心地解剖颅骨盖，从枕骨大孔向左右两侧向前剪开，以便将颅骨盖向上翻开露出脑组织。

然后，使用扁平的金属解剖刀切断视神经，小心地从颅底取出完整的大脑。将大脑置于铝箔上，通过做两个冠状切面将大脑切成三部分。

这三个部分分别代表前脑、中脑以及小脑与脑干。先用最佳切片温度包埋剂填充 Cryomold 至四分之一处，然后将脑切片放入 Cryomold 中，使每块脑组织的腹侧朝下。

用基质完全覆盖组织。将装有组织的冷冻模具水平放入2-甲基丁烷浴中。避免将整个组织块浸入浴液中，以确保组织在1分钟内从底部到顶部逐渐冻结。

将冷冻组织转移至零下80摄氏度保存。有关冷冻组织切片的制备，请参见文字版实验方案。取自EAE小鼠制备的6微米厚、未经固定的脑组织切片。

在通风橱内，将组织切片置于含有硅胶的塑料冷冻盒中（硅胶置于盒盖内），以避免组织中水分滞留，使其解冻。使用防水笔在一张载玻片上画线，分隔两个组织切片区。将反应溶液在室温下以13,300 ×g离心5分钟，并使用水浴预热至37°C。

然后，使用1X反应缓冲液在37摄氏度下对组织切片复水5分钟。5分钟后，倒掉1X反应缓冲液。向组织切片上加入反应溶液，并在37摄氏度下孵育4小时。

然后，用双蒸水将切片洗涤五次。接着，用预冷至零下20摄氏度的甲醇固定切片5分钟，随后在室温下用PBS洗涤一次。向切片中加入含1% BSA的PBS溶液，于室温孵育20分钟。

然后，将切片翻转至吸水纸上，弃去缓冲液。向切片上加入一抗混合液，在室温下孵育1小时。用PBS洗涤切片两次后，加入二抗混合液，在室温下孵育1小时。

然后，用 PBS 清洗切片两次，并用封片液封片。将封好的切片在室温下静置过夜干燥后，使用荧光显微镜分析染色的组织切片。EAE 疾病严重程度逐渐加重，直至达到疾病高峰期，通常在 EAE 诱导后的第 16 至 20 天之间出现。

在临床EAE的高峰期，小鼠的体重也最低，随着EAE在疾病缓解期的改善，体重逐渐增加。图中显示的是患有EAE的C57-Black/6小鼠脉络丛及其邻近脑实质的代表性图像。该小鼠在处死前15分钟接受了静脉注射。

示踪剂可轻易穿过脉络丛毛细血管的窗孔，扩散至脉络丛间质，而血脑屏障则阻止循环示踪剂进入脑实质，因此脑实质中无任何荧光信号。这些图像显示了患实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的C57-Black/6小鼠小脑中具有代表性的渗漏性血管。箭头指示示踪剂已穿过脑微血管进入中枢神经系统实质，提示这些血管的血脑屏障功能受损。

在中枢神经系统实质中，血管壁外可见绿色和红色荧光信号。正确地将MOG-CFA乳剂注射至皮下是诱发EAE所需适当免疫反应的关键。应避免腹腔内和肌肉内注射。

在通风橱中制备完全弗氏佐剂（CFA），以避免吸入减毒的分枝杆菌。同时，应避免将MOG-CFA乳液注射到自身体内，因为这可能导致尖锐湿疣，甚至在具有遗传易感性的个体中诱发实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。可通过流式细胞术检测患EAE小鼠中枢神经系统（CNS）中的脑浸润免疫细胞，以定量分析神经炎症过程中浸润的免疫细胞亚群。

对脑内皮屏障和胶质屏障完整性的评估可应用于基因修饰小鼠模型或其他神经系统疾病模型的分析。