体内自身免疫性脑髓炎实验性神经血管内障碍和胶质屏障的可视化

在这里, 我们提出的方案, 以调查损伤的神经血管单位在实验性自身免疫性脑髓炎在体内。我们专门讨论了如何确定血液脑屏障通透性和明胶酶活性与白细胞迁移跨越胶质细胞限制。

这里介绍的方法使我们能够研究免疫细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎（多发性硬化症的动物模型）中跨越大脑屏障迁移的分子机制。通过研究血脑屏障渗透性和基质-金属蛋白酶活性，同时在空间相关性与免疫细胞渗透在脑组织部分，我们可以准确地将这些神经炎症事件与EE的临床症状关联。专业处理患病小鼠需要深入训练，以及正确评分EE的临床症状。

因此，视觉演示是有益的。从 C57-Black/6 小鼠的麻醉开始，这些小鼠已被安置在文本协议中描述的特定无病原体条件下。一只手固定麻醉小鼠，将30微升MOG肽注射，将Freund的辅助乳液皮下注射到每个后腿侧翼，靠近内结淋巴结。

现在，把鼠标放在它的腹部，将20微升的MOG-肽乳液注射到尾部左右的软脂肪组织中。此外，将乳液的一小滴注入小鼠的颈部。将100微升百日咳毒素溶液内向小鼠注射。

将鼠标头放在身体中心下方，以避免注射到肠道中。将维持饮食替换为育种饮食，以便在预期的临床疾病之前和期间为小鼠提供能量含量较高的食物。在第一次治疗后48小时重复百日咳注射。

每天早上在笼子里看看EAE老鼠的健康状况。每天下午给 EAE 老鼠评分。将 EAE 实验中的每只鼠标都从笼子里拿出来，并检查尾巴是否有鼻塞。

用手指向上移动尾巴。健康的老鼠会保持它的尾巴。如果临床 EAE 已经开始，尾部的尾部将降低，通过尾部的逐渐下降可见。

最终，鼠标将无法抬起尾巴。将 EAE 实验中的每只鼠标都放在干净的长凳上，以观察和记录行走行为。有关疾病严重程度的评估（即 EAE 评分）的评分标准，请参阅文本。

评估和记录实验中包含的每只鼠标的重量。对于制备脱氧体库存溶液，在 500 微升 0.9% 氯化钠溶液中溶解 10 毫克三千克顿 Dextran 德州红，在 250 微升 0.9% 氯化钠溶液中溶解 5 毫克 10 千克多克脱氧货量。对于 dextran 工作溶液，就在注射前，移液器 55 微升 10 千克顿 Dextran Alexa Fluor 488 库存溶液上一块密封膜上。

然后，添加55微升的三千元德斯特兰德州红股票解决方案。混合并收集100微升到一次性精细注射器中。接下来，将麻醉小鼠放在表上的横向位置。

在鼠标唤醒之前，静脉注射100微升荧光示踪剂到小鼠中。让示踪器循环15分钟，然后执行文本协议中详述的小鼠灌注。用碎干冰填充平坦的脱华容器，加入2-甲基丁烷，直到液体达到干燥冰袋上方约一厘米。

盖上松动的盖子，如冰桶盖。用锋利的剪刀从被刺穿的鼠标的头部剪下来后，用一套较小的剪刀去除皮肤和耳朵。小心解剖头骨，从前身巨无霸切向左侧和右侧的前面，允许头骨盖向上折叠在大脑上。

然后，小心地从头骨底部抬起完整的大脑，同时用扁平的金属铲切断光学神经。将大脑放在铝箔上。通过放置两个日冕切口，将大脑切成三块。

这三块代表前脑、中脑和脑干小脑。使用最佳温度切割矩阵将 Cryomold 填充到第一季度。然后，将大脑切片放入 Cryomold 中，每个大脑片的前部朝下。

用矩阵完全覆盖组织。将具有组织水平方向的 Cryomold 放入 2 甲基丁烷浴中。避免将整个组织块浸入浴缸中，确保组织在一分钟内从底部冻结到顶部。

将冷冻组织转移到零下80摄氏度进行储存。有关冷冻组织部分的准备，请参阅文本协议。检索从EAE小鼠身上准备的六微米非固定脑组织部分。

在烟罩中，解冻塑料冷冻箱内的部分，盖子内含有硅胶，以避免将水留在组织中。使用防水笔绘制线条，在一张幻灯片上分离两个组织部分。在室温下，在13，300倍g下，在5分钟内进行离心反应溶液，使用水浴预热至37摄氏度。

然后，使用1X反应缓冲液在37摄氏度下补充组织部分5分钟。五分钟后，倒掉1X反应缓冲液。在组织部分添加反应溶液，在37摄氏度下孵育4小时。

然后，用双蒸馏水清洗滑梯五次。现在，在零下20摄氏度的温度下用冰冷的甲醇将部分固定5分钟，然后用PBS在室温下洗涤一次。在 PBS 中加入 1%BSA，并在室温下孵育 20 分钟。

然后，通过将幻灯片翻转纸巾，将缓冲区从该部分丢弃。将原发抗体鸡尾酒加入该部分，并在室温下孵育一小时。用PBS洗两次后，加入二次抗体鸡尾酒，在室温下孵育一小时。

然后，使用 PBS 清洗部分两次，然后使用嵌入解决方案安装幻灯片。让安装部分在室温下干燥过夜后，使用荧光显微镜分析染色组织部分。EAE 疾病的严重程度增加，直到疾病达到峰值，预计在 EAE 诱导后的第 16 天至 20 天之间。

在临床EE的高峰期，小鼠的体重也最低，这增加了与EE在疾病缓解阶段的改善的相关性。这里展示的是一个患有EAE的C57-Black/6小鼠的胆小毛症和相邻大脑帕伦奇玛的代表性图片。在牺牲前15分钟，小鼠静脉注射。

追踪器很容易通过微纤维扩散到胆齿丛的气孔中，而血脑屏障不允许循环的示踪剂扩散到大脑的面皮瘤中，因此没有任何荧光信号。这些图像显示了患有EAE的C57-Black/6小鼠小脑中具有代表性的漏血血管。箭头表示示踪迹通过大脑微壁扩散到中枢机屏障中，表明这些血管中的血脑屏障功能受损。

在中枢系统，在血管壁外可以看到绿色和红色的荧光信号。正确皮下放置 MOG-CFA 乳液对于安装导致 EAE 的适当免疫反应至关重要。应避免在脑内注射和肌肉内注射。

在烟气罩下准备 CFA，以避免吸入衰减的分枝杆菌。此外，避免使用MOG-CFA乳液进行自我注射，因为这可能导致结节瘤，甚至导致基因易感个体的EE。脑渗透免疫细胞可以从患有EAE的小鼠的CNS中分离，通过流动细胞学在神经刺激期间量化渗透免疫细胞子集。

评估内皮和胶质脑屏障的完整性可以转化为转基因小鼠模型的分析或其他神经系统疾病的模型。