Name: 体内自身免疫性脑髓炎实验性神经血管内障碍和胶质屏障的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 了解实验性自身免疫性脑髓炎中免疫细胞迁移的分子机制，利用C57-Black/6小鼠模型评估血脑屏障通透性与基质金属蛋白酶活性。该方法有助于研究多发性硬化症的神经炎症机制。

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我们衷心感谢 Lydia Sorokin 与我们分享了她原始的 in situ 酶谱分析方案10。&#160;

所有研究均根据瑞士动物保护相关法律法规进行，并经瑞士伯尔尼州兽医办公室批准（许可编号：BE 31/17 和 BE 77/18）。
1. C57BL/6小鼠在特定无病原体（SPF）条件下的饲养
<ol>
	<li>将小鼠饲养于独立通风笼具中，保持12/12小时明暗循环，自由摄食饮水。&#160;为监控小鼠的微生物质量，实验动物群体每季度通过脏垫料哨兵鼠进行健康监测，遵循FELASA建议13。</li>
	<li>使用耳缘打孔法对8至12周龄的雌性C57BL/6小鼠进行个体标记。</li>
</ol>
2. C57BL/6 小鼠的免疫
<ol>
	<li>溶液的制备14：
	<ol>
		<li>制备完全弗氏佐剂（CFA）：在通风橱中，将30 mL不完全弗氏佐剂与120 mg新鲜研磨并经热灭活的结核分枝杆菌（H37RA）混合。将储备液储存于4 °C。</li>
		<li>制备MOGaa35-55肽储备液：将MOGaa35-55肽溶解于无菌PBS中（4 mg/mL），并于-80 °C保存。</li>
		<li>制备MOG乳剂：&#160;
		<ol>
			<li>在2 mL微量离心管中，按1:2比例将CFA与MOG肽储备液稀释。&#160;</li>
			<li>用封口膜密封微量离心管，并用胶带完全包裹固定于涡旋振荡器上。在4 °C下涡旋乳化4小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备含有稳定乳剂的注射器：&#160;
		<ol>
			<li>取出微量离心管，使用小型台式离心机短暂离心使乳剂沉降至管底。用18G × 1½’’（1.2 mm × 40 mm）注射针头吸取乳剂至注射器中。&#160;</li>
			<li>根据小鼠数量调整注射器中乳剂体积（每只小鼠100 µL），并将18G针头更换为27G × ¾’’（0.4 mm × 19 mm）注射针头。用封口膜密封连接在注射器上的注射针头。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>制备百日咳毒素（PTx）储备液：将50 µg冻干PTx溶解于500 µL无菌PBS中（100 ng/µL）。将储备液储存于4 °C。</li>
		<li>制备PTx工作液：每只小鼠使用97 µL无菌PBS与3 µL PTx储备液混合（300 ng/100 µL）（腹腔注射使用30G × ½’’（0.3 mm × 13 mm）针头）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EAE诱导
	<ol>
		<li>使用异氟烷麻醉系统对C57BL/6小鼠进行麻醉。为诱导麻醉，先将小鼠置于含4.5%异氟烷的氧气小型诱导室中，随后转移至面罩并维持2.1%异氟烷浓度。&#160;使用配备加热垫的麻醉装置，以防止小鼠体温过低。</li>
		<li>用一只手固定麻醉后的小鼠，首先将30 µL MOG35-55/CFA乳剂皮下注射至后肢两侧（图1：1 + 2；总量60 µL；左侧腹股沟区30 µL，右侧腹股沟区30 µL），靠近腹股沟淋巴结区域。</li>
		<li>将小鼠置于俯卧位，分别向尾根部左右两侧柔软脂肪组织各注射20 µL MOGaa35-55/CFA乳剂（图1：3 + 4；总量40 µL；左侧尾根20 µL，右侧尾根20 µL），并在小鼠颈部皮下注入少量MOGaa35-55/CFA乳剂（图1：5）。</li>
		<li>向小鼠腹腔内注射100 µL PTx溶液。操作时将小鼠头部置于身体下方，避免刺入肠道。&#160;</li>
		<li>将维持饲料（挤压颗粒主要营养成分：粗蛋白18.5%；粗脂肪4.5%；粗纤维4.5%；粗灰分6.5%；淀粉35%；代谢能13.1 MJ/kg）更换为繁殖饲料（挤压颗粒主要营养成分：粗蛋白23.5%；粗脂肪5.5%；粗纤维3%；粗灰分5.7%；淀粉36%；代谢能14.3 MJ/kg），以便在预期发病期前后为小鼠提供更高能量的食物。&#160;</li>
		<li>移除面罩，将小鼠转移至带有加热垫的饲养笼中。&#160;确保小鼠在10分钟后完全清醒并能自由活动。&#160;</li>
		<li>在首次处理48小时后重复注射PTx（步骤2.2.4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. EAE 小鼠评分
<ol>
	<li>每天早晨通过观察笼内情况检查EAE小鼠的健康状况。</li>
	<li>每天下午对EAE小鼠进行评分。</li>
	<li>将EAE实验中每只小鼠从笼中取出，用手指将其尾巴向上抬起，检查尾巴是否有张力。健康小鼠的尾巴会保持上翘（具有张力）。若临床EAE已开始，尾巴张力会降低，表现为尾巴逐渐下垂。最终小鼠将完全无法抬起尾巴。&#160;</li>
	<li>将EAE实验中每只小鼠放置于洁净台面上，观察并记录其行走行为。疾病严重程度评分标准（EAE评分）见表115&#160;。</li>
	<li>评估并记录实验中每只小鼠的体重。</li>
	<li>为确保临床EAE评分为1分的小鼠能够充分摄取食物和水，需在笼底放置塑料碟盛装湿润饲料，并每日更换。</li>
</ol>
4. 体内通透性检测
<ol>
	<li>溶液的配制：
	<ol>
		<li>配制葡聚糖储备液：将10 mg的10 kDa Dextran Alexa Fluor 488以及3 kDa Dextran Texas Red分别溶解于500 µL的0.9%氯化钠溶液中（浓度为20 mg/mL）。</li>
		<li>配制葡聚糖工作液：在注射前，取55 µL的10 kDa Dextran Alexa Fluor 488储备液（20 mg/mL）滴加至封口膜上，再加入55 µL的3 kDa Dextran Texas Red储备液（20 mg/mL）。混匀后吸取100 µL转移至一次性微量注射器中（终浓度为2 mg/100 µL）。&#160;</li>
		<li>配制10%甲醛（PFA）储备液：在洁净的玻璃烧杯中加入10 g高纯度PFA粉末、100 mL PBS和200 µL 1N NaOH，使用磁力搅拌器在精确控温至56 °C的条件下加热搅拌；维持56 °C持续30分钟，直至PFA完全溶解；冷却至室温；调节pH至7.4；经滤纸过滤。储存于-20 °C。该储备液可用PBS进一步稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用异氟烷对健康的C57BL/6小鼠或患有EAE的C57BL/6小鼠进行短暂麻醉（小鼠将被镇静约1分钟）。可采用步骤2.2.1中的自动化系统（小鼠先在诱导舱中暴露于含4.5%异氟烷的氧气中，随后转移至面罩，维持2.1%异氟烷）。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠侧卧于操作台上，在其苏醒前经静脉途径（如眶后注射）注入100 µL荧光示踪剂。</li>
	<li>立即移除面罩，确保小鼠在短暂麻醉后完全清醒并能自由活动。让示踪剂循环15分钟。</li>
	<li>继续进行步骤5.1。</li>
</ol>
5. 小鼠灌注
<ol>
	<li>用于体内通透性评估：
	<ol>
		<li>在荧光示踪剂注射后15分钟，通过诱导深度异氟烷麻醉开始实验操作。&#160;使用氧气中2.3%的异氟烷诱导小鼠深度麻醉。&#160;通过足部回缩反射判断麻醉深度（捏住脚趾间的皮肤；无屈曲反应表明麻醉深度足够），并对接受EAE处理的小鼠的前肢和后肢反射进行检测。&#160;</li>
		<li>将小鼠仰卧固定，用乙醇喷洒腹部。使用剪刀打开胸腔并移除膈肌。用剪刀剪开跳动心脏的右心房，经左心室灌注10 mL PBS，随后灌注10 mL PBS配制的4% PFA。&#160; 
		注意：为避免吸入PFA，应在通风橱中对小鼠进行灌注。</li>
		<li>进入第6部分。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 原位 明胶酶谱法&#160;
	<ol>
		<li>诱导深度异氟烷麻醉&#160;使用含2.3%异氟烷的氧气&#160;在患有EAE的小鼠中，按照步骤5.1.1检查麻醉深度。</li>
		<li>接下来，将小鼠仰卧固定，并用乙醇喷洒腹部。使用剪刀打开胸腔并移除膈肌。用剪刀剪开跳动心脏的右心房，通过左心室向小鼠体内灌注20 mL PBS。</li>
		<li>进入第6节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 脑组织的解剖与冷冻
<ol>
	<li>冷却浴的制备：
	<ol>
		<li>将粉碎的干冰放入一个扁平的杜瓦瓶中，并加入2-甲基丁烷（异戊烷），直至液体高度超过干冰约1 cm。用松散的盖子（例如冰桶盖）覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用锋利的剪刀剪下灌注后小鼠的头部，并用较小的剪刀去除皮肤和耳朵。</li>
	<li>从枕骨大孔开始，沿左右两侧向前剪开颅骨，小心剥离颅顶骨，使其能够向上翻开暴露脑组织。然后，使用扁平金属刮刀切断视神经，小心地从颅底完整取出脑组织。&#160;</li>
	<li>将脑组织置于铝箔上，通过两个冠状切面将脑切成三部分（前脑、中脑以及小脑+脑干）。</li>
	<li>在冷冻模具（25 mm × 20 mm × 5 mm）中加入约四分之一体积的低温恒冷切片（O.C.T.）包埋剂，将每块脑组织的腹面朝下放入模具中，然后完全覆盖O.C.T.包埋剂，确保组织被完全包裹。</li>
	<li>将装有组织的冷冻模具水平放入2-甲基丁烷浴中，确保组织块在1分钟内自下而上完成冷冻；注意避免将整个组织块完全浸入液体中。</li>
	<li>将冷冻后的组织转移至-80 °C保存，并继续进行第7节操作。</li>
</ol>
7. 冷冻组织切片的制备
<ol>
	<li>将冷冻组织从 -80 °C 平衡至冰冻切片机中的 -20 °C，持续 30 分钟。</li>
	<li>从冷冻模具中取出组织块，使用 O.C.T. 包埋剂将其固定在设定为 -15 °C 的冰冻切片机组织架上。</li>
	<li>用锋利的手术刀修剪组织块在切片机架上的边缘，并开始用冰冻切片机刀片切去 20 µm 的切片，直至暴露出组织。</li>
	<li>用于体内血脑屏障通透性分析：
	<ol>
		<li>使用冰冻切片机切取 6–10 µm 的组织切片，将其收集到粘附性玻片上，并立即用盖玻片覆盖后在荧光显微镜下成像。&#160;</li>
		<li>评估脑内血管的形态（注意非渗漏血管具有清晰的边界，而渗漏血管则呈现弥散的荧光模式）。以室周器官或脉络丛的示踪剂渗漏作为阳性对照，这些区域缺乏血脑屏障。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于原位酶谱分析（in situ zymography）：
	<ol>
		<li>使用冰冻切片机切取 6 µm 的组织切片，将其收集到粘附性玻片上，并将切片置于含硅胶封盖的冻存盒中，在 -20 °C 下冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 原位 明胶酶谱法联合层粘连蛋白/CD45免疫荧光染色
<ol>
	<li>配制溶液：
	<ol>
		<li>配制包埋液：&#160;
		<ol>
			<li>将6 g甘油（分析纯）、2.4 g聚乙烯醇、6 mL去离子水（ddH2O）和12 mL 0.2 M Tris缓冲液（pH 8）混合，并在室温下使用磁力搅拌器搅拌4小时。&#160;</li>
			<li>将溶液转移至50 mL离心管中，在室温下静置2小时。随后在50 °C水浴中孵育10分钟，并在室温下以2,700 × g离心20分钟。&#160;</li>
			<li>取上清液，分装后于-20 °C冷冻保存。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制冷明胶溶液：&#160;
		<ol>
			<li>将0.1 g牛皮来源的冷明胶溶于10 mL去离子水（ddH2O）中。</li>
			<li>浸泡至少1天，并将分装样品于4 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制冰甲醇（-20 °C）：&#160;
		<ol>
			<li>将100%甲醇加入染色缸中，并冷却至-20 °C。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制10%叠氮化钠储备液：&#160;
		<ol>
			<li>将1 g叠氮化钠加入10 mL去离子水（ddH2O）中，室温保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制0.1%叠氮化钠工作液：&#160;
		<ol>
			<li>将99 µL去离子水（ddH2O）与1 µL 10%叠氮化钠储备液混合。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将1 mg猪皮来源的荧光素标记淬灭型（DQ）明胶溶于1 mL叠氮化钠工作液中，避光分装为100 µL，于4 °C保存。</li>
		<li>将30 mg 1,10-菲啰啉一水合物溶于76 µL乙醇中，并于-20 °C保存。</li>
		<li>配制25倍蛋白酶抑制剂溶液：&#160;
		<ol>
			<li>将1片不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂加入2 mL去离子水（ddH2O）中。于-20 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用前立即配制反应液（每张切片150 µL）：&#160;
		<ol>
			<li>将1 mg/mL DQ明胶溶液在13,300 × g条件下离心5分钟。&#160;</li>
			<li>混合127.2 µL去离子水（ddH2O）、15 µL 10倍反应缓冲液（明胶酶/胶原酶检测试剂盒；见材料表）、0.3 µL 20 mg/mL冷明胶、1.5 µL 1 mg/mL DQ明胶和6 µL 25倍蛋白酶抑制剂溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用前立即配制菲啰啉阴性对照反应液（每张切片150 µL）：&#160;
		<ol>
			<li>混合125.2 µL去离子水（ddH2O）、15 µL 10倍反应缓冲液、0.3 µL 20 mg/mL冷明胶、1.5 µL 1 mg/mL DQ明胶、6 µL 25倍不含EDTA的蛋白酶抑制剂和2 µL 2 M 1,10-菲啰啉（MMP抑制剂）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用前立即配制冷明胶（非荧光）阴性对照反应液（每张切片150 µL）：
		<ol>
			<li>混合128.7 µL去离子水（ddH2O）、15 µL 10倍反应缓冲液、0.3 µL 20 mg/mL冷明胶和6 µL 25倍不含EDTA的蛋白酶抑制剂。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制用于复染的初级抗体混合液，例如：将0.95 µg/mL兔多克隆抗层粘连蛋白抗体和10 µg/mL大鼠多克隆抗CD45抗体溶于含1% BSA的PBS中，并配制相应的同型对照初级抗体混合液。</li>
		<li>配制次级抗体溶液，例如：将7.5 µg/mL Cy3标记的山羊抗大鼠抗体和15 µg/mL AMCA标记的抗兔抗体溶于含1% BSA的PBS中（避光保存）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在通风橱内，从含有干燥硅胶的塑料冷冻盒中取出实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的6 µm未固定脑组织切片，使其在盒盖内自然解冻，以避免水分滞留于组织上；使用疏水笔在一张载玻片上划分两个区域，分别放置两片组织切片。</li>
	<li>配制反应液（步骤8.1.9–8.1.11），在室温下以13,400 × g离心5分钟，并使用水浴预热至37 °C。</li>
	<li>使用1倍反应缓冲液在37 °C下对组织切片复水5分钟。随后弃去1倍反应缓冲液，向切片上加入反应液，在37 °C孵育4小时。用去离子水（ddH2O）洗涤载玻片5次。</li>
	<li>使用-20 °C的冰甲醇固定切片5分钟，然后在室温下用PBS洗涤一次。</li>
	<li>向切片上加入含1% BSA的PBS，室温孵育20分钟（避光）。随后将载玻片倒置于吸水纸上以去除1% BSA/PBS溶液，加入初级抗体混合液，在室温下孵育1小时（避光）。</li>
	<li>用PBS洗涤切片两次，加入次级抗体混合液，在室温下孵育1小时（避光）。</li>
	<li>用PBS洗涤切片两次，用包埋液封片，室温避光过夜干燥。最后使用荧光显微镜分析染色后的组织切片。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了一种在雌性C57BL/6小鼠中诱导和监测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。由于多发性硬化症（MS）在女性与男性的发病率之比为3:1，因此优先选择雌性小鼠进行研究。为评估EAE的严重程度，我们采用了一种3分制评分表。EAE的严重程度通常依据运动功能障碍的程度进行评分。对于处于EAE晚期阶段、即评分超过2分的小鼠，应实施安乐死，以避免动物遭受不必要的痛苦。因此，建议按照本方案所述，以较短的时间间隔（例如每日两次）对小鼠进行评分。目前已有多种评分系统被使用，评分范围从0–3分到0–6分16,17,18,19&#160;，甚至包含更多细分等级20。然而，我们先前的研究表明，在评估整体疾病严重程度时，看似更精细的EAE评分方法并不能提高检测组间潜在统计学显著差异的能力15。基于...

中枢神经系统（CNS）协调脊椎动物的所有身体和心理功能，而CNS稳态对于神经元之间的正常通信至关重要。神经血管单元（NVU）可确保CNS稳态，保护中枢神经系统免受血液环境变化的影响。NVU由CNS微血管内皮细胞组成，这些细胞在生化上具有独特性，并通过与周细胞、星形胶质细胞、神经元以及细胞外基质（ECM）成分的持续双向交流，形成血脑屏障（BBB），并建立两层不同的基底膜1。包裹BBB内皮细胞腔外侧的内皮基底膜含有大量周细胞，主要由层粘连蛋白α4和层粘连蛋白α5以及其他ECM蛋白构成2。相比之下，实质基底膜则由层粘连蛋白α1和层粘连蛋白α2组成，并被星形胶质细胞终足所包绕。实质基底膜与星形胶质细胞终足共同构成胶质界膜，将中枢神经系统的神经元网络与充满脑脊液的血管周围腔隙或蛛网膜下腔分隔开来3。由于NVU独特的结构，免疫细胞进入CNS的过程不同于其进入外周组织的过程，必须经历两个步骤：免疫细胞首先需穿越内皮性血脑屏障，随后再突破胶质界膜，才能进入CNS实质&#160;
多发性硬化症（MS）是一种常见的中枢神经系统（CNS）神经炎症性疾病，其特征是大量循环免疫细胞进入中枢神经系统，引发神经炎症、脱髓鞘以及血脑屏障（BBB）完整性的局灶性丧失4。BBB完整性的破坏是MS的早期标志，磁共振成像（MRI）中可见的钆对比增强病灶即提示了这一现象5。白细胞向中枢神经系统的外渗主要发生在后微静脉水平；然而，免疫细胞穿过BBB基底膜以及随后的胶质屏障的确切机制仍有待进一步研究。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的动物模型，极大地促进了我们对MS发病机制的理解。例如，利用EAE模型已发现，白细胞外渗是一个多步骤过程，包括最初由选择素和黏蛋白样分子（如P-选择素糖蛋白配体（PSGL）-1）介导的捕获和滚动阶段，随后是整合素依赖的牢固黏附以及T细胞在BBB内皮细胞上的爬行，最终到达适宜外渗的部位6。&#160;
一旦T细胞穿过内皮血脑屏障（BBB）和内皮基底膜，它们需要在软脑膜或血管周围间隙中遇到由巨噬细胞或树突状细胞呈递的特异性抗原。这种相互作用会诱导促炎介质的局部产生，进而触发免疫细胞通过胶质界膜侵入中枢神经系统所需的后续机制7,8,9。基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的局部活化会改变趋化因子的活性，并诱导星形胶质细胞终足上的细胞外基质受体降解，这是免疫细胞迁移穿过胶质界膜进入中枢神经系统实质并引发实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）临床症状的前提条件10,11。&#160;
在中枢神经系统（CNS）组织切片中联合检测浸润性免疫细胞、血脑屏障（BBB）渗漏及明胶酶活性，可为神经炎症背景下血管内皮屏障和胶质屏障的功能完整性提供重要信息。例如，我们近期研究了内皮紧密连接分子连接黏附分子（junctional adhesion molecule, JAM）-B的组成性缺失对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中免疫细胞进入中枢神经系统的影响。与健康的野生型C57BL/6小鼠相比，健康的JAM-B缺陷型同窝小鼠并未表现出血脑屏障完整性的损害，这一点通过体内通透性评估（使用内源性和外源性示踪剂）已得到证实12。在EAE模型中，JAM-B缺陷型C57BL/6小鼠表现出疾病症状减轻，这与炎性细胞被滞留在软脑膜及血管周围间隙有关12。为了进一步探究这一现象，我们应用了原位明胶酶谱法（in situ zymography），以检测明胶酶活性，从而验证JAM-B缺陷小鼠中明胶酶活性的缺乏是否可能导致能够突破胶质界膜的免疫细胞数量减少12。
鉴于存在多种基因修饰小鼠模型，例如缺乏不同血脑屏障（BBB）紧密连接分子的模型，这些模型可能导致BBB功能改变，因此研究BBB完整性的方法显得尤为重要。此外，新开发的药物可能影响神经血管单元（NVU）屏障。本文介绍如何通过使用完全弗氏佐剂中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）肽段aa35-55对C57BL/6小鼠进行主动免疫，以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。随后，我们阐述如何定位免疫细胞在NVU内皮屏障和胶质屏障中的浸润情况，并分别通过原位检测外源性示踪剂和明胶酶活性，来研究体内内皮屏障和胶质屏障的完整性。

<table><tbody><tr><td>AMCA 抗兔抗体</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>111-156-045</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C；避光保存</td></tr><tr><td>抗CD45抗体（30F11）</td><td>Pharmingen</td><td>07-1401</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>抗层粘连蛋白抗体</td><td>DAKO</td><td>Z0097</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>育种食物</td><td>例如，PROVIMI KLIBA SA</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>独立通气笼具，Blue line II型或III型</td><td>例如，Tecniplast </td><td>1145T, 1285L</td><td></td></tr><tr><td>BSA 第五组分</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>冷明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 9391</td><td></td></tr><tr><td>考普林罐 + 支架</td><td>例如，Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>H554.1；H552.1</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 抗大鼠抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-156-144</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C；避光保存</td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 40 mm #1</td><td>例如：Thermo Scientific</td><td>85-0186-00</td><td></td></tr><tr><td>Dextran Alexa Fluor 488（10,000 MW）</td><td>例如：分子探针</td><td>D22910</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C；避光保存</td></tr><tr><td>德克萨斯红葡聚糖（3000 MW）</td><td>Invitrogen</td><td>D3328</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C；避光保存</td></tr><tr><td>EnzChek 明胶酶/胶原酶检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技；EnzCheck</td><td>E12055</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C；避光保存</td></tr><tr><td>雌性C57BL/6J小鼠（8–12周龄）</td><td>例如：Janvier Labs</td><td></td><td>雌性，8-12 周龄</td></tr><tr><td>组织学切片冷冻盒</td><td>例如：Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>2285.1</td><td></td></tr><tr><td>18G × 1&amp;frac12;&amp;rsquo;&amp;rsquo; (1.2 mm × 40 mm) 注射针</td><td>例如 BD，BD Microlance 3</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>27G x &amp;frac34;&amp;rsquo;&amp;rsquo; &amp;ndash; 20号（0.4 mm × 19 mm）注射针</td><td>例如：BD，BD Microlance 3</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>30G × &amp;frac12;&amp;rsquo;&amp;rsquo; (0.3 mm x 13 mm) 注射针</td><td>例如：BD，BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>不完全弗氏佐剂&amp;rsquo;不完全佐剂（IFA）</td><td>例如，Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24648</td><td>4°C 下保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>维持食物</td><td>例如，PROVIMI KLIBA SA</td><td>3436</td><td></td></tr><tr><td>MOGaa&lt;sub&gt;35-55&lt;/sub&gt; 肽</td><td>例如，GenScript</td><td></td><td>-80℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>显微镜载玻片（Superfrost Plus）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;结核分枝杆菌 &lt;/em&gt;H37RA</td><td>例如，BD</td><td>231141</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td>B. Braun</td><td>3535789</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 化合物（Tissue-Tek）</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 30G x &amp;frac12;&amp;rsquo;&amp;rsquo;</td><td>B. Braun</td><td>9151125S</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>默克</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>例如：List 生物实验室股份有限公司</td><td>180</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>聚乙烯醇（Mowiol 4-88）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂，无EDTA（Roche）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693132001</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>排斥笔，例如 DAKO Pen</td><td>例如：DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>封口膜，例如 Parafilm M</td><td>例如 Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>硅胶</td><td>例如：Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9351.1</td><td></td></tr><tr><td>缝合剪刀</td><td>F.S.T</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>例如，PRIMO</td><td>62.1002</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>例如：CODAN Medical ApS</td><td>2022-05</td><td></td></tr><tr><td>Univentor 400 雾化系统</td><td>UNO.BV</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

神经血管单元（NVU）由形成血脑屏障（BBB）的微血管内皮细胞、嵌入周细胞的内皮基底膜以及由实质基底膜和星形胶质细胞终足构成的胶质界膜组成，后者包绕中枢神经系统（CNS）微血管的远腔面。除了维持中枢神经系统稳态外，NVU还调控免疫细胞向中枢神经系统的迁移。在中枢神经系统免疫监视过程中，少量活化的淋巴细胞可穿过内皮屏障，而不会引起血脑屏障功能障碍或临床疾病。相反，在神经炎症过程中，例如多发性硬化或其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，大量免疫细胞可穿越血脑屏障，继而穿过胶质界膜，最终进入中枢神经系统实质，导致临床疾病的发生。

免疫细胞迁移进入中枢神经系统实质是一个两步过程，涉及依次穿越NVU的内皮屏障和胶质屏障，并依赖不同的分子机制。当T细胞穿越内皮屏障后，若在血管周围抗原呈递细胞上遇到其特异性抗原，则局部再活化将启动后续机制，导致明胶酶（gelatinases）的局灶性激活，从而使T细胞得以穿越胶质屏障并进入中枢神经系统实质。因此，在EAE过程中，通过空间关联分析中枢神经系统内免疫细胞积聚部位的血脑屏障通透性和基质金属蛋白酶（MMP）活性，可明确NVU内皮屏障和胶质屏障完整性的丧失情况。

本文展示了如何通过主动免疫在C57BL/6小鼠中诱导EAE，以及如何随后利用外源性荧光示踪剂联合应用，在体内分析血脑屏障的通透性。我们进一步展示了如何通过原位明胶酶谱法结合对血脑屏障基底膜和CD45+侵入性免疫细胞的免疫荧光染色，对EAE小鼠脑组织中的明胶酶活性进行可视化和定位。

在C57BL/6小鼠中评估EAE的临床病程应得到如图所示的疾病曲线 图 2A 小鼠体重的变化，如图所示 图2BC57BL/6小鼠在用MOGaa35-55免疫后，通常在主动免疫后的第10至12天开始出现疾病症状图1A）。通常，免疫小鼠在注射乳剂和首剂百日咳毒素后的第二天会出现短暂的体重下降图1B）。从EAE诱导后的第2天起，免疫小鼠的体重逐渐增加，直至疾病发作；通常在临床症状出现前一天，体重开始下降，并随着疾病症状的加重而持续降低，与症状严重程度呈正相关。图1A,B）。EAE 疾病严重程度持续加重，直至疾病高峰期，通常在 EAE 诱导后第 16 至 20 天之间达到。图2A）。在EAE临床症状最严重的阶段，小鼠的体重也降至最低。<strong clas...

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。&#160;

神经血管单元（NVU）由形成血脑屏障（BBB）的微血管内皮细胞、含有……的内皮基底膜组成

本文所述方法使我们能够研究实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化动物模型）中免疫细胞跨越脑屏障的分子机制。通过在空间上关联脑组织切片中免疫细胞浸润的位置，同时检测血脑屏障通透性和基质金属蛋白酶活性，我们可以精确地将这些神经炎症事件与EAE的临床症状相关联。对患病小鼠的专业操作需要经过深入培训，以及对EAE临床症状的准确评分。因此，直观的演示非常有益。按照文本方案所述，在特定无病原体条件下饲养的C57-Black/6小鼠，首先对其进行麻醉。用一只手固定麻醉后的小鼠，将30 µL MOG多肽与完全弗氏佐剂乳化液在靠近腹股沟淋巴结处，分别皮下注射至后肢两侧 flank 部位。现在将小鼠置于腹部位置，在尾根部左右两侧的柔软脂肪组织中各注射 20 µL MOG 肽乳剂。同时，向小鼠颈部皮下注射少量乳剂。向小鼠腹腔内注射 100 µL 百日咳毒素溶液。将小鼠头部固定在身体中心下方，以避免注射到肠道。在预期的临床疾病发生前和期间，将维持饮食更换为繁殖饮食，以提供更高能量的食物。在首次处理后的48小时重复百日咳毒素注射。每天早晨通过观察笼内情况检查EAE小鼠的健康状况。每天下午对EAE小鼠进行评分。将EAE实验中每只单独的小鼠从笼中取出，检查其尾巴是否有张力。用手指将小鼠尾巴向上移动。健康的小鼠会保持尾巴上扬。如果临床EAE已经发生，尾巴张力会降低，表现为尾巴逐渐下垂。最终，小鼠将完全无法抬起尾巴。将EAE实验中涉及的每只小鼠单独放置于洁净台面上，观察并记录其行走行为。疾病严重程度的评估标准（即EAE评分）详见正文。记录并评估实验中每只小鼠的体重。配制葡聚糖储备液时，将10毫克3千道尔顿的德克萨斯红葡聚糖溶解于500微升0.9%氯化钠溶液中，将5毫克10千道尔顿的Alexa Fluor 488葡聚糖溶解于250微升0.9%氯化钠溶液中。配制葡聚糖工作液时，在注射前，用移液器将55微升10千道尔顿Alexa Fluor 488葡聚糖储备液滴加至一片封口膜上。然后，加入55 µL的3 kDa德克萨斯红葡聚糖储备液。混匀后，用一次性细针筒收集100 µL溶液。接着，将麻醉后的小鼠置于实验台上，保持侧卧位。 在小鼠苏醒前，经静脉注射 100 微升荧光示踪剂。示踪剂循环 15 分钟后，按照文本方案中所述步骤对小鼠进行灌注。取一个平底杜瓦瓶，装入粉碎的干冰，并加入 2-甲基丁烷，直至液面高出干冰约 1 厘米。用一个松动的盖子（如冰桶盖）盖住。用锋利的剪刀剪下灌注小鼠的头部后，使用较小的剪刀去除皮肤和耳朵。小心地解剖颅骨盖，从枕骨大孔向左右两侧向前剪开，以便将颅骨盖向上翻开露出脑组织。然后，使用扁平的金属解剖刀切断视神经，小心地从颅底取出完整的大脑。将大脑置于铝箔上，通过做两个冠状切面将大脑切成三部分。这三个部分分别代表前脑、中脑以及小脑与脑干。先用最佳切片温度包埋剂填充 Cryomold 至四分之一处，然后将脑切片放入 Cryomold 中，使每块脑组织的腹侧朝下。用基质完全覆盖组织。将装有组织的冷冻模具水平放入2-甲基丁烷浴中。避免将整个组织块浸入浴液中，以确保组织在1分钟内从底部到顶部逐渐冻结。将冷冻组织转移至零下80摄氏度保存。有关冷冻组织切片的制备，请参见文字版实验方案。取自EAE小鼠制备的6微米厚、未经固定的脑组织切片。在通风橱内，将组织切片置于含有硅胶的塑料冷冻盒中（硅胶置于盒盖内），以避免组织中水分滞留，使其解冻。使用防水笔在一张载玻片上画线，分隔两个组织切片区。将反应溶液在室温下以13,300 ×g离心5分钟，并使用水浴预热至37°C。然后，使用1X反应缓冲液在37摄氏度下对组织切片复水5分钟。5分钟后，倒掉1X反应缓冲液。向组织切片上加入反应溶液，并在37摄氏度下孵育4小时。然后，用双蒸水将切片洗涤五次。接着，用预冷至零下20摄氏度的甲醇固定切片5分钟，随后在室温下用PBS洗涤一次。向切片中加入含1% BSA的PBS溶液，于室温孵育20分钟。然后，将切片翻转至吸水纸上，弃去缓冲液。向切片上加入一抗混合液，在室温下孵育1小时。用PBS洗涤切片两次后，加入二抗混合液，在室温下孵育1小时。然后，用 PBS 清洗切片两次，并用封片液封片。将封好的切片在室温下静置过夜干燥后，使用荧光显微镜分析染色的组织切片。EAE 疾病严重程度逐渐加重，直至达到疾病高峰期，通常在 EAE 诱导后的第 16 至 20 天之间出现。在临床EAE的高峰期，小鼠的体重也最低，随着EAE在疾病缓解期的改善，体重逐渐增加。图中显示的是患有EAE的C57-Black/6小鼠脉络丛及其邻近脑实质的代表性图像。该小鼠在处死前15分钟接受了静脉注射。示踪剂可轻易穿过脉络丛毛细血管的窗孔，扩散至脉络丛间质，而血脑屏障则阻止循环示踪剂进入脑实质，因此脑实质中无任何荧光信号。这些图像显示了患实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的C57-Black/6小鼠小脑中具有代表性的渗漏性血管。箭头指示示踪剂已穿过脑微血管进入中枢神经系统实质，提示这些血管的血脑屏障功能受损。在中枢神经系统实质中，血管壁外可见绿色和红色荧光信号。正确地将MOG-CFA乳剂注射至皮下是诱发EAE所需适当免疫反应的关键。应避免腹腔内和肌肉内注射。在通风橱中制备完全弗氏佐剂（CFA），以避免吸入减毒的分枝杆菌。同时，应避免将MOG-CFA乳液注射到自身体内，因为这可能导致尖锐湿疣，甚至在具有遗传易感性的个体中诱发实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。可通过流式细胞术检测患EAE小鼠中枢神经系统（CNS）中的脑浸润免疫细胞，以定量分析神经炎症过程中浸润的免疫细胞亚群。对脑内皮屏障和胶质屏障完整性的评估可应用于基因修饰小鼠模型或其他神经系统疾病模型的分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

体内自身免疫性脑髓炎实验性神经血管内障碍和胶质屏障的可视化

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

本视频演示了在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中评估血脑屏障破坏的实验方法。通过眼眶后注射不同分子量的荧光染料，使其在脑部血管中循环。较小分子量的染料可渗漏进入脑组织，而较大分子量的染料仅在血脑屏障严重受损时才能进入，从而反映屏障损伤的程度。...

利用荧光染料检测实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中血脑屏障的破坏

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

来源： Schmitz, K., et al., 小鼠多发性硬化EAE模型中视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像。 J. Vis. Exp.

在EAE小鼠模型中进行生物发光成像

我们介绍了一种在成年小鼠暴露的脊髓上植入并维持玻璃窗的方法，用于研究实验性自身免疫性脑脊髓炎。这些玻璃窗可长期提供对脊髓的光学通路，从而在活体动物中利用双光子显微镜在亚细胞水平上监测细胞动态。...

在实验性自身免疫性脑脊髓炎成年小鼠中植入玻璃脊髓窗

本方案描述了如何确定实验性自身免疫性脑脊髓炎的药物治疗是通过抑制免疫细胞浸润而产生中枢神经系统保护作用，还是在免疫细胞浸润攻击过程中具有神经保护作用。...

确定药理学干预在自身免疫性脱髓鞘中对免疫系统抑制与中枢神经系统保护的作用

小鼠多发性硬化EAE模型中视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像

本实验方案的目的是从无脑回和有脑回的脊椎动物中枢神经系统的多个区域中分离微血管。...

跨五个脊椎动物类群的中枢神经系统微血管可靠分离

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的动物模型。本文介绍了一种对EAE小鼠脊髓中的炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分的方法。此外，还提供了一种定量检测小鼠血清中可溶性神经丝轻链水平的方法，有助于在活体小鼠中评估轴突损伤。...

评估实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘及轴突损伤

了解实验性自身免疫性脑髓炎中免疫细胞迁移的分子机制，利用C57-Black/6小鼠模型评估血脑屏障通透性与基质金属蛋白酶活性。该方法有助于研究多发性硬化症的神经炎症机制。

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

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