预组装塑料微流体芯片中人类干细胞衍生神经元的分段化
2019年5月3日
该协议演示了使用分门分割的微流体芯片,注射成型在循环烯烃共聚物培养的神经元区别于人类干细胞。这些芯片是预先组装的,比传统的分块聚(二甲基硅氧烷)器件更容易使用。这里描述了多种常见的实验模式,包括病毒标记、流体隔离、轴切除术和免疫染色。
隔离微流体装置允许神经元以高度偏振的形式研究。这些设备有助于基础和转化神经科学研究。该协议描述了如何使用环烯烃共聚合物芯片来划分与人类干细胞区别的神经元。
这些 COC 芯片通过 PDMS 多节器器件产生更健康的分化神经元培养。在该协议中，我们演示了与NIH批准的H9干细胞系不同的神经元培养。类似的程序可用于区分神经元和mIPSC。
多隔间芯片必须放入二次密封中，并加湿。多节片芯片的通道必须用预涂溶液填充，然后用 PBS 冲洗。首先，在细胞培养级蒸馏水中溶解聚L-奥尼辛，使每个芯片的溶液得到600微升。
从油井中吸出剩余的 PBS，确保移液器尖端远离通道开口。在右上井中装载 150 微升聚 L- 奥尼辛工作溶液。等待 90 秒，在右下井中加入 150 微升溶液。
等待五分钟，用左井的溶液重复装载过程。然后，将加湿器托盘与芯片在四摄氏度过夜。如果使用培养皿，请用 Parafilm 包装，并过夜将其放在四摄氏度。
接下来，从油井中吸出溶液，确保移液器尖端远离通道开口。重复加载左右井与150微升每个无菌水两次。准备层压工作解决方案。
用每层压素工作溶液的 150 微升装载左右孔。在37摄氏度下在托盘内孵育芯片两小时。用PBS冲洗芯片，不带钙和镁。
用 PBS 的 150 微升加载右侧和左侧孔。等五分钟从油井中吸出 PBS，然后用 NSC 介质冲洗芯片。
每个 NSC 介质用 150 微升加载右侧和左侧孔。在 37 摄氏度的培养箱中用 5% CO2 孵育托盘中的芯片，以预化芯片。要将人类神经干细胞植入多极分芯片中，首先使用血细胞计计算细胞浓度。
然后，从井中吸出介质。将5微升的细胞溶液移到右上井，然后向右下井移5微升。使用显微镜检查细胞进入通道。
等待五分钟，让细胞粘附在芯片底部。左右井的 NSC 介质约有 150 微升。在合适的加湿容器内孵育5%CO2，37摄氏度。
48 小时后，从井中吸出 NSC 介质，并由神经分化介质代替，在每个顶部井和底部井中添加 150 微升。在加湿器托盘内 5%CO2、37 摄氏度的培养箱内培养神经元。从斧结室中取出剩余的神经分化介质，并将其放入离心管中。
储存在37摄氏度。将病毒溶液的 50 微升与 150 微升的加热介质混合。移液 100 微升的混合物到轴孔的两口井。
在37摄氏度的孵化器内孵育两小时。撤回并处置包含病毒的介质。轻轻移液75微升的新鲜介质到一轴孔隔间井，让介质流经通道进入其他轴孔井。
重复此过程一次。最后，用保存的介质填充轴孔隔间，然后将芯片转移到培养箱。在具有分化介质的芯片中一周后，人类神经干细胞分化成神经元，在体细胞室内均匀地连接和分布。
相比之下，PDMS设备中的神经元在添加分化介质后早在五天内聚集，导致细胞健康受损。使用mCherry荧光蛋白对标记神经元和树突状脊柱进行可视化，表明在芯片内分化的NSC衍生神经元形成成熟的突触。神经元被标记为兴奋突触标记，vGlut1。
免疫着色结果表明，病毒标记的神经元可以与vGlut1和神经元特异性标记，β-图布林三共同本地化。病毒性转导mCherry神经元将投影扩展为预组装芯片内建立的轴突定微环境。轴切除术之前和之后mCherry标记神经元的图像之间的比较显示轴突完全被切断。
确保通道保持充满液体至关重要，除非执行斧弓手术。COC-隔离芯片易于使用，可以打开大门，许多调查有关神经元损伤，突触发生，突触可塑性和疾病病理生理学。
概述
本协议展示了使用由环状烯烃共聚物（COC）制成的隔室式微流控芯片培养从人类干细胞分化的神经元。该研究为使用这些芯片进行各种实验范式提供了见解，包括病毒标记和免疫染色，促进了对神经元行为和机制的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 微流控技术
背景
- 隔室式微流控装置对于以极化形式研究神经元至关重要。
- 与传统的PDMS装置相比，COC芯片能产生更健康的培养物。
- 该协议包括从人类干细胞分化神经元的程序。
- 这些装置可用于探索神经元损伤、突触可塑性和相关的病理生理条件。
研究目的
- 展示COC微流控芯片在培养神经元方面的有效性。
- 详细介绍细胞干预和神经元行为观察的方法。
- 强调使用预组装COC芯片相对于传统方法的优势。
使用的方法
- 使用了由环状烯烃共聚物制成的隔室式微流控芯片。
- 在装置内分化并培养了人类神经干细胞。
- 关键时间点包括在不同温度和CO2水平下的孵育期。
- 使用的技术包括多-L-鸟氨酸涂层、层粘连蛋白应用和病毒标记。
主要结果
- 在培养后神经元均匀地粘附在芯片内，显示出有效的分化。
- 免疫染色确认了成熟突触的存在和神经元标记物的正确标记。
- 结果显示与PDMS装置相比，神经元健康和分布存在显著差异。
- 病毒标记显示神经元成功投射到轴突定位环境中。
结论
- 该研究展示了一种可靠的方法来培养具有增强生存力的神经元。
- 研究结果表明对神经元损伤和突触功能的新调查具有显著的潜力。
- 使用COC芯片可以促进与神经元机制和疾病建模相关的各种研究途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Compartmentalized microfluidic chips fabricated from cyclic olefin copolymer (COC) enable precise spatial control of human stem cell-derived neuron cultures, supporting advanced mechanistic studies in neurobiology. This platform enhances predictive confidence in neuronal differentiation, synaptic maturation, and injury modeling, directly impacting early discovery and translational neuroscience pipelines. The standardized chip format facilitates reproducible workflows and integration with high-resolution imaging, supporting portfolio-wide assay development and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal differentiation and synaptic connectivity in a controlled microenvironment.
- Supports mechanistic de-risking by isolating axonal and somatic compartments for targeted perturbations.
- Facilitates functional target validation through compartment-specific interventions and readouts.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, slide-compatible platform for quantitative imaging and immunocytochemistry.
- Enables reproducible preparation of disease-relevant neuronal systems for downstream screening.
- Supports assay scalability and platform reuse across multiple experimental paradigms, including viral labeling and axotomy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease modeling by enabling studies of neuronal injury, synaptogenesis, and plasticity.
- Maintains translational continuity from stem cell differentiation to mature neuron function within a single device.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by providing robust, physiologically relevant data.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic chip method bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling compartmentalized neuron culture, manipulation, and analysis within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neuronal differentiation, synaptic formation, and injury response.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables high-content imaging, immunostaining, and quantitative marker analysis across compartments.
- Translational Research: Provides a platform for modeling disease-relevant neuronal processes and injury mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, standardized chip format compatible with diverse experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuronal assays and reduces mechanistic ambiguity in neurobiological studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of neuron culture workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust, high-content data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology-focused discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neuronal differentiation, and microfluidic device handling.
- Needs access to high-resolution microscopy and immunocytochemistry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of chip preparation and experimental protocols.
- Adaptable to various human stem cell lines and neuronal subtypes with protocol optimization.
- Maintaining optimal humidity and temperature is critical for long-term neuron health and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Preparation of the Multi-compartment Chips
1:05
Coating of Multi-compartment Chips for hSC-neurons
2:59
Seeding NSCs into the Multi-compartment Chip
4:05
Viral Fluorescent Labeling of hSC-neurons within the Chip
5:02
Results: Using Compartmentalized Microfluidic Chips to Isolate Neurons Differentiated from Human Stem Cells
6:16
Conclusion
