原子力显微镜对外泌体的成像

本方案概述了细胞外囊泡在水合与干燥状态下的原子力显微镜（AFM）成像的简单制备流程，包括囊泡的静电固定、表面扫描、囊泡识别以及数据的分析与解读。该技术的主要优势在于能够便捷地通过静电作用将囊泡固定在基底表面，并可在成像后进行分析，以校正因固定所导致的形态畸变。所获得的囊泡尺寸测量结果与作为金标准的冷冻透射电镜（CryoTEM）成像结果一致，而后者仍是一种成本较高且操作复杂的技术。

如果您是原子力显微镜（AFM）的新用户，建议先从干燥样品的表征开始，再进行水合样品的分析，因为水合样品的获取过程中存在更多可能影响结果的因素。首先，按照随附文本方案中所述方法，从生物流体中分离出细胞外囊泡。

接下来，将云母圆片牢固地粘附到磁性不锈钢样品圆片上。使用锋利的剃刀切割云母圆片，以暴露新的材料表面。在室温下，用100 µL的10 mM氯化镍（II）溶液处理云母上表面，持续10秒。

这会将表面的电荷从负性改变为正性。用无绒布或吸水纸吸去氯化镍(II)溶液。然后，用去离子水清洗云母表面三次，并用干燥的氮气流吹干。

将带有表面修饰云母的原子力显微镜样品盘放入培养皿中。接着，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释外泌体，使溶液浓度达到每毫升四百亿至四千亿个颗粒。使用纳米颗粒追踪分析法验证稀释后的颗粒浓度。

用移液枪吸取100微升稀释后的外泌体溶液，滴加到云母表面形成静滴。然后盖上培养皿盖，并用封口膜密封，以减少样品蒸发。在冰箱中孵育12小时。

孵育后，小心抽吸掉80%至90%的样品，避免扰动表面。此时，外泌体将通过静电作用固定在云母基底上。当对水合样品进行成像时，用PBS冲洗表面三次。

在整个冲洗过程中需注意保持样品湿润。用 PBS 清洗云母表面后，移除 80% 至 90% 的液体，并用移液器加入 40 微升新鲜 PBS 以覆盖样品。湿润的样品即可用于成像。

对干燥的细胞外囊泡（EV）进行成像时，用去离子水将基底冲洗三次，以去除表面的盐分。在尽可能吸除液体但不接触表面后，用干燥氮气流吹干剩余液体。为成像干燥的细胞外囊泡，选择适用于空气环境中轻敲模式和非接触模式扫描的悬臂梁，并将其安装到探针 holder 上。

将样品放置到原子力显微镜（AFM）载物台上。磁性不锈钢样品盘可将样品固定在载物台上。将探针支架放入原子力显微镜中。

留出足够时间使样品和载物台达到热平衡。采用轻敲模式扫描样品区域，扫描范围为5×5微米，扫描线数为512线，扫描速率为1赫兹。同时获取高度图和相位图，因为它们可提供关于样品表面形貌及表面特性的互补信息。

扫描时间随成像区域的增大和构成图像的扫描线数量的增加而延长，但随扫描速率的提高而缩短。由于过快的扫描速率可能影响图像质量，光栅扫描速度应在采集时间与图像质量之间取得平衡。对水合囊泡进行成像时，应选择适用于扫描柔软、水合样品的悬臂梁，并将其安装至专为液体环境中扫描设计的探针支架上。

用 PBS 润湿悬臂的尖端，以降低扫描过程中向液体中引入气泡的可能性。然后，将样品固定在原子力显微镜（AFM）载物台上。待样品达到热平衡后，采用轻敲模式对水合云母表面进行成像。

同时获取高度和相位图像。要分析所采集的图像，首先进入数据处理模块，选择“SPM模式”，然后选择“针尖”，并选择“模型针尖”。选择用于扫描样品的针尖几何形状和尺寸，然后点击“确定”。通过执行表面重构来校正针尖磨损伪影。打开图像。

从菜单中选择“数据处理”，然后选择“SPM 模式”，接着选择“针尖”，再选择“表面重构”，并点击“确定”。接下来，选择“数据处理”，然后选择“校正”，并选择“平面校正”，以校正扫描数据中基底的倾斜，使成像平面与实验室的 XY 平面对齐。通过选择“数据处理”，然后选择“校正数据”，再选择“对齐行”，可对图像中的行进行对齐。系统提供多种对齐选项，包括“中值”方法，该算法可计算每条扫描线的平均高度，并从数据中减去该值。接着，进入“数据处理”，选择“校正数据”，然后选择“去除划痕”，以消除常见的扫描伪影，即所谓的“划痕”。为将云母表面的高度调整至零，进入“数据处理”菜单，在“校正”下拉菜单中选择“基底展平”。

通过进入“Grains”菜单并使用“Mark by Threshold”功能，在扫描表面上识别细胞外囊泡。该算法通过高于用户设定阈值的高度，将固定在表面且从零表面基底突出的外泌体识别为颗粒。选择介于1至3纳米范围内的阈值，以消除大部分背景干扰。

最后，利用“Grains”菜单中可用的分布算法，对已识别的囊泡进行几何和尺寸表征。将原子力显微镜数据从Gwyddion导出，以便使用其他计算工具和自定义计算机程序进行专门分析。氯化镍表面修饰导致细胞外囊泡的固定具有时间依赖性。

孵育24小时后，固定化囊泡的表面浓度过高，而孵育12小时则产生的外泌体较少，扫描数据更易于准确分析。该原子力显微镜（AFM）图像显示了通过静电作用固定在修饰云母表面的水合MCF7外泌体。相应的AFM相位图像证实，高度图像中的颗粒为柔软的纳米级颗粒，这符合膜囊泡的预期特性。

沿同一直线的三个囊泡的高度数据如图所示。这些轮廓图显示了外泌体因静电吸引作用附着于经修饰的云母正电表面而产生的扁平化形态。在固定囊泡及其横截面的放大视图中，形态畸变清晰可见。

为了估算溶液中外泌体的球形尺寸，可以通过匹配表面固定化膜包被和球形膜包被所包围的体积来进行。溶液中球形囊泡的尺寸分布是根据561个固定化囊泡的原子力显微镜（AFM）数据确定的。冷冻透射电镜（CryoTEM）图像中的囊泡尺寸与AFM结果一致。

在对水合外泌体进行成像之前，务必记住用 PBS 充分冲洗表面，以去除未结合的外泌体并防止其附着到原子力显微镜（AFM）探针上。在对外泌体进行干燥成像时，务必使用去离子水冲洗基底。

去离子水清洗可防止基底干燥时表面形成盐晶体。如果存在盐晶体，将使图像处理变得困难。