上眼眶沟的可视化 斑马鱼 胚胎发生

这一系列标准化方案可用于深入研究发育中眼睛新近发现的结构——眼上沟（superior ocular sulcus, SOS）。这些方案可使全球任何实验人员在斑马鱼眼部发育过程中清晰地观察到 SOS。首先，在配对前一晚，将杂合的生长分化因子 six A 雄性和雌性斑马鱼分别放置于盛有去氯水的鱼缸中，用隔板分隔开。

第二天早晨，移除隔板，让鱼交配不超过30分钟。交配期结束后，将胚胎收集到含有E3培养基的培养皿中，并置于28.5°C培养箱内孵育。受精后20小时，用添加了0.004% 1-苯基-2-硫脲（1-Phenyl-2-thiourea）的E3培养基替换上清液，以抑制色素生成，并通过光学显微镜检查胚胎，确认所有胚胎均处于适当的发育阶段。

将样本置于解剖显微镜下，丢弃发育不成熟的胚胎，使用精细镊子轻轻分离卵壳。观察 SOS 结构，其可能表现为眼睛背侧边缘的凹陷或线条状结构。

随后，将表现出体节闭合延迟的胚胎与未表现出延迟的胚胎进行分类。使用解剖显微镜拍摄这些胚胎时，准备一个含有E3培养基中1%琼脂糖的培养皿，并轻轻刺破琼脂糖中心，形成一个浅孔，用于放置胚胎的卵黄。然后，将麻醉后的胚胎侧向置于琼脂糖上。

使用复式显微镜或共聚焦显微镜观察胚胎时，将一个胚胎转移至含有少量未凝固的1%低熔点琼脂糖（溶于E3培养基）的35毫米培养皿中，并使用细钓鱼线迅速将胚胎置于侧卧位置。待琼脂糖冷却凝固后，向培养皿中加入足量E3培养基以浸没琼脂糖，然后使用20倍水浸物镜观察SOS结构。成像完成后，轻轻将琼脂糖从胚胎上剥离，随后将组织固定于4%多聚甲醛中，或让斑马鱼继续发育。

为了通过荧光mRNA表达可视化SOS，使用显微注射装置将300皮克的增强型GFP-CAX mRNA注入单细胞期的胚胎中。随后，利用荧光体视显微镜筛选出具有强增强型GFP表达的胚胎，并通过所示的一种成像方法获取胚胎图像。对于整装免疫荧光染色胚胎斑马鱼层粘连蛋白，按所示方法去除胚胎的绒毛膜，并将胚胎置于微量离心管中，用新配制的4%多聚甲醛在室温摇床上固定两小时。

固定结束后，用含吐温的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤胚胎四次，每次五分钟。随后在室温下用浓度为每毫升10微克的蛋白酶K处理五分钟以进行通透。通透后的胚胎按上述方法再用PBST洗涤四次，并在含5%正常山羊血清和每毫升2毫克牛血清白蛋白的PBST中，于室温摇床上封闭1至2小时。封闭孵育结束后，将胚胎置于感兴趣的抗层粘连蛋白一抗溶液中，于4摄氏度摇床孵育过夜。

第二天早晨，用PBST清洗胚胎，每次15分钟，共清洗五次，并在避光条件下，于4摄氏度摇床上用适当的二抗对组织进行过夜孵育。第二天早晨，用PBST清洗胚胎四次，每次15分钟，然后将胚胎转移至含有新鲜PBST的小培养皿中。使用精细镊子轻轻破坏卵黄，并通过轻柔刮擦卵黄囊去除卵黄细胞。

将去卵黄的胚胎转移至新配制的30%甘油PBS溶液中，确保将胚胎置于液面上方，并尽可能少地带入前一步的溶液，然后等待胚胎沉入管底。当胚胎沉至容器底部后，按上述方法依次将其转移至50%和70%的甘油PBS溶液中。待胚胎沉入70%甘油溶液容器底部后，将样品转移至小型塑料培养皿中进行解剖，并在后脑之后切断胚胎。

使用精细解剖工具，将一个头部转移至载玻片上，尽量减少甘油的量，并从内部将细小的昆虫针轻轻插入前脑室，向下推动，以分离头部的左右两半。当头部沿中线完全剖开后，将每侧头部以中线朝下、眼侧朝上的方式固定。在受精后20至23小时，可通过解剖显微镜观察到视网膜裂隙（SOS），在微分干涉对比成像中表现为眼背侧一条细线，分隔发育中视网膜的鼻侧和颞侧部分。

此外，眼睛背侧边界可能可见轻微的凹陷。通过层粘连蛋白免疫荧光染色后，该细线可被确认为基底膜。当视泡闭合（SOS）延迟时，可在解剖显微镜下观察到其在眼睛背侧持续存在并表现为明显的裂隙。

在使用微分干涉差显微镜观察时，这一特征更为明显，眼睛的鼻侧与颞侧被视杯裂（SOS）分隔，而在背侧眼区，SOS清晰可见为一条线状结构。在野生型斑马鱼受精后28小时，层粘连蛋白染色结果明确显示，视杯裂已完全闭合，因此该时期是监测裂隙闭合延迟的理想阶段。注射增强型GFP-CAX mRNA可使活体或固定胚胎的细胞膜可视化，从而追踪导致视杯裂闭合的细胞形态变化。

由于窦状隙（SOS）狭窄且存在时间短暂，对其进行可视化观察较为困难。然而，在评估后续时间点的闭合延迟时，必须保持一致的评分方法。这些技术可与实验干预手段相结合，用于鉴定影响窦状隙正常形成与闭合的遗传因素或药理学物质。