基于显微注射的禽类胚胎体内植入胚胎心肌细胞系统

本方案有助于我们确定局部生物力学、组织结构、旁分泌环境以及邻近细胞相互作用的改变如何影响细胞表型。该技术使我们能够在不引起传统移植实验中常见的大规模组织损伤的情况下，探索经典的范式和实验胚胎学问题。为确定合适的注射压力，建议从较低的注射压力开始，逐步增加压力，直至实现细胞的稳定流动。

可视化该技术有助于直接理解注射设备相对于目标组织的正确放置方式。本次操作将由我实验室的两名成员Trevor Henley和Kandace Thomas进行演示。在植入前24小时，按照标准操作规程使用微量移液器拉制仪拉制玻璃毛细管，并将毛细管浸入硅化剂中，以包被针头的外表面。

接下来，将 5 至 10 微升硅化剂吸入显微注射移液器尖端，并将该尖端插入一根外部已涂覆的拉制玻璃毛细管的宽端。将移液器尖端尽可能靠近玻璃针尖，并在缓慢抽出装液移液器的同时排出硅化剂，以尽量减少针内气泡的产生。硅化剂在玻璃针中保留 10 分钟后，使用新的装液移液器吸取溶液。

然后将针头在通风橱中过夜干燥。对于宿主胚胎的制备，将受精的鸡卵置于38摄氏度的湿润培养箱中水平孵育，并使用斜口镊子在每枚鸡蛋钝端底部沿蛋体赤道线位置制造一个直径大于1毫米的穿刺孔。将连接10毫升注射器的18号针头插入穿刺孔，抽出约5毫升蛋清。

在蛋壳顶部贴上透明胶带。用有角度的镊子在蛋壳顶部的胶带区域划痕，并使用弯头肌腱剪在胶带覆盖区域剪出一个约2.5厘米的窗口。根据Hamburger和Hamilton制定的标准检查并确定胚胎的发育阶段，并使用配备32号针头的1毫升注射器，将约200微升的印度墨水与HBSS按1:5稀释后的溶液注射到胚胎下方。

然后用透明胶带封闭穿刺部位，并以滴加方式在胚胎盘上加入1毫升HBSS，再用石蜡膜密封开窗的蛋壳，将鸡蛋放回湿润的培养箱中继续孵育。当胚胎发育至Hamburger和Hamilton 19期时，用去离子水冲洗硅化玻璃毛细管，并在室温下干燥3至4小时。在此期间，将另一枚鸡蛋中的胚胎转移至一个100毫米×15毫米的无菌培养皿中，皿内含有室温的无菌HBSS，并将培养皿置于体视显微镜下。

使用镊子、断腱剪和显微铲，从胚胎中分离出完整的胚胎心脏，并将心房从心脏中分离出来。将心房组织置于含有1毫升HBSS的无菌1.5毫升微量离心管中，并置于冰上。当所有供体组织收集完毕后，使用固定角度的微量离心机通过离心使组织沉淀。

对于供体组织的消化，将沉淀物重悬于1毫升预热的0.5%胰蛋白酶EDTA溶液中，在300转/分钟的振荡加热块中孵育15分钟。孵育结束后，用移液器反复吹打消化液数次，以分散残留的组织，然后通过离心收集心肌裂解物沉淀。将沉淀物重悬于1毫升胰蛋白酶中和液中，再次离心后，重悬于400微升红色荧光染料溶液中。

在37摄氏度孵育20分钟后，通过离心将细胞沉淀，每次用1毫升HBSS洗涤，重复洗涤一至三次。随后，将标记的细胞重新悬浮于新鲜HBSS中，浓度为每微升5×10⁴个细胞。对于供体细胞的体内注射，如图所示，将细胞悬液反向装入干燥的、经硅化处理的玻璃毛细移液管中，并将该移液管安装至压力显微注射装置上。

在荧光体视显微镜下，将每个待注射的宿主胚胎从加湿的培养箱转移至卵固定装置中。使用无菌精细镊子打开卵黄膜，在心包膜上做一个5至1毫米的切口，并调整显微注射仪的位置，使显微注射针的尖端刺入目标组织。

将显微注射仪设置为施加持续时间为5秒的单次脉冲，压力范围为100至400百帕。然后对细胞进行压力注射。在重新封闭卵子之前，通过成像荧光信号来确认细胞植入是否成功至关重要。

也可对胚胎进行拍照，以记录该操作过程。当所有细胞均完成注射后，撤回显微注射装置，并将卵子从固定装置中取出。随后，逐滴加入一毫升温热的HBSS至胚胎上。

用透明封箱胶带密封鸡蛋，并将鸡蛋放回加湿的培养箱中，于移植后继续孵育24小时。此处显示的是供体心房心肌细胞移植后宿主胚胎心脏及其周围组织的情况。在此代表性实验中，供体细胞被显微注射至发育阶段相似的宿主胚胎的生心外膜区。

使用共聚焦显微镜进行光学切片显示，胚心外膜原基中唯一呈心脏肌细胞标志物阳性的细胞是局部植入的荧光红色阳性细胞。操作受体胚胎时需小心，避免过度操作，因为注射针头可能导致心脏和局部血管破裂，从而降低胚胎存活率。在此操作之后，可进行多种下游检测，包括免疫组织化学、原位杂交和细胞分选。

硅化剂极易燃且具有急性毒性。应在通风橱内小心操作，并始终佩戴适当的个人防护装备。