基于微注射的免疫胚胎心肌细胞体内植入系统

该协议帮助我们确定局部生物力学、组织结构、寄生虫环境和朱克其林相互作用的变化如何影响细胞表型。这项技术使我们能够探索经典的范式和实验胚胎学，而不会造成在传统图形实验中通常出现的大规模组织侮辱。为了找到合适的注射压力，从较低的注射压力开始并逐渐增加，直到达到稳定的细胞流动是很有帮助的。

可视化此技术有助于直接了解注射设备需要如何相对于目标组织进行定位。演示这个程序的将是我的实验室的两个成员，特雷弗·亨利和坎迪斯·托马斯。在植入前24小时，按照标准方案将玻璃毛细管拉到微管拉拔器上，将毛细管浸入硅化剂中，以覆盖针头的外表面。

接下来，将 5 至 10 微升硅化剂装入微注射移液器尖端，将尖端放在一个外部涂层拉玻璃毛细管的宽端。将移液器尖端尽可能靠近玻璃针尖，并弹出硅化剂，同时缓慢缩回装载移液器，以最大限度地减少针头内的气泡。将硅化剂留在玻璃针中 10 分钟，然后使用新的装载移液器吸气溶液。

然后用烟罩将针头干燥过夜。在宿主胚胎制备过程中，在38摄氏度的加湿孵化器中以水平方向孵育肥卵，并使用倾斜钳子在鸡蛋赤道上每个卵子平端底部进行直径大于一毫米的穿刺。将连接到 10 毫升注射器的 18 针插入穿刺中，取出约 5 毫升的白条。

将透明胶带涂抹在蛋壳顶部。用倾斜钳子沿鸡蛋顶部对带带区域进行评分，并使用弯曲的十分肌剪刀在蛋的带子部分切割大约 2.5 厘米的窗口。根据汉堡和汉密尔顿制定的标准检查和阶段胚胎，并使用装有 32 量针的 1 毫米注射器在胚胎下方的 HBSS 中注射约 200 微升的 1 至 5 印度墨水。

然后用透明胶带密封穿刺，将一毫升的HSS滴入胚胎盘，然后用石蜡膜密封带窗的外壳，将卵子放回加湿的培养箱中。当胚胎到达汉堡和汉密尔顿阶段19时，用去维化水冲洗硅胶涂层的玻璃毛细管，让毛细管在室温下干燥三到四个小时。同时，将胚胎从一个卵子中移植到含有无菌室温的100毫米培养皿中，然后将该培养皿置于立体显微镜下。

使用钳子、十肌切除术剪刀和微型铲子，将整个胚胎心脏从胚胎中分离，将阿泰里亚从心脏中分离开。将心房组织放在含有一毫升HBSS的无菌1.5毫升微离心管中。收集所有供体组织后，通过离心在固定的角微离心中对组织进行颗粒化。

对于供体组织消化，将颗粒重新悬浮在预加热的05%trypsin EDTA的一毫升中，以每分钟300次旋转的速度在摇晃的热块中孵育15分钟。在孵育结束时，移液器消化液多次分解任何剩余的组织，通过离心使心脏解出来。将颗粒重新悬浮在一毫升的尝试性中和溶液中，进行另一个离心，然后重新悬浮在400微升红色荧光染料溶液中。

在37摄氏度下20分钟后，通过离心对细胞进行一到三次洗涤，每次洗涤一毫升HSS。然后在新鲜的HSS中，每微升浓度的五倍十至四细胞重新悬浮标记的细胞。对于供体细胞的体内注射，将细胞悬浮液回装干，如硅胶处理的玻璃毛细管移液器中，将移液器安装到压力微注射器装置中。

在荧光立体解剖显微镜下，将每个宿主胚胎从加湿培养箱注射到蛋架中。并使用无菌细钳打开葡萄线膜。在渗透体中进行 5 到 1 毫米的切口，并放置微注射器，使微注射针的尖端穿透目标组织。

将微显流器设置为在持续时间内应用 5 秒的单脉冲，压力范围从 100 到 400 个下位。和压力注入细胞。在重新密封卵子之前，通过成像荧光信号来验证细胞植入是否成功至关重要。

也可以对胚胎进行拍照，以记录这一过程。当所有细胞都注射后，收回微注射器装置，从支架中取出卵子。然后将一毫升温暖的HSS滴到胚胎上。

用透明包装胶带密封鸡蛋，将鸡蛋返回加湿孵化器，在植入后24小时。在这里，在供体心房菌植入后，宿主胚胎心脏的心脏和周围组织被显示出来。在这个具有代表性的实验中，供体细胞被微入类似阶段的宿主胚胎的胚胎中。

使用共聚焦显微镜进行光学剖切显示，在正皮细胞内，唯一的心脏肌肉标记阳性细胞是聚焦植入的荧光红阳性细胞。注意不要过度操纵接受者胚胎，因为注射针引起的心脏破裂和局部血管可能导致生存能力降低。按照这个程序，可以进行各种下游测定，包括免疫基础化学、原位杂交和细胞分选。

硅化剂极易燃，毒性极强。应始终在烟罩内小心处理适当的个人防护设备。