利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳与免疫印迹法分析培养的人类细胞中线粒体呼吸链复合物

蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分析线粒体氧化磷酸化系统的完整复合物。这是一种方便且经济的技术，可用于检测线粒体氧化磷酸化系统各复合物的整体组装情况。制备线粒体裂解液时，首先使用预冷的PBS溶液轻轻洗涤细胞一次。

在4°C、800 G条件下离心10分钟，刮取细胞并收集沉淀。随后，用预冷的PBS洗涤细胞沉淀两次，每次在4°C、800 G条件下离心10分钟。接下来，将200微升100倍蛋白酶抑制剂加入20毫升PBS中。

将细胞重悬于PBS蛋白酶抑制剂混合液中，使最终蛋白浓度为5毫克/毫升。为配制含蛋白酶抑制剂的3.3毫摩尔/升皂苷素PBS溶液，将4毫克皂苷素溶于1毫升PBS中，在100摄氏度下加热至无沉淀可见。立即置于冰上冷却，并向1毫升皂苷素溶液中加入10微升100倍浓度的蛋白酶抑制剂。

接下来，将皂苷素-蛋白酶抑制剂混合物加入细胞中，终浓度为 1.65 毫摩尔。充分混匀后，冰上孵育 5 分钟。然后，向细胞中加入 PBS-蛋白酶抑制剂混合物，终体积为 1.5 毫升。

在4°C、10,000 G条件下离心10分钟。弃去上清液，并将线粒体沉淀重悬于线粒体缓冲液中。用PBS配制一毫升新鲜的10%洛雷尔抑制剂溶液。

向线粒体中加入10%洛莱蒙塔塞德，使其终浓度为1%。冰上孵育至少15分钟。在4°C、20,000 G条件下离心20分钟。将上清液收集至新管中，并加入样品缓冲液。

为制备蓝非变性PAGE的梯度凝胶，首先将梯度混合器置于搅拌台上，并通过一根软管将其连接至蠕动泵。将带有针头的输液装置连接到软管上。将一个磁力搅拌子放入梯度混合器的近端室中，并以最大泵速用蒸馏水冲洗软管10分钟。

接下来，排空管道和梯度混合器。使用移液管移除梯度混合器各室之间通道中残留的蒸馏水。用阀门关闭通道和管道。

将两块玻璃板组装到支架中，并将其放置在支架台上。利用凝胶支架底部的孔，将连接到管路的针头置于两块玻璃板之间。制备8.3厘米×7.3厘米的凝胶时，首先配制6%和15%的凝胶溶液，并置于冰上保存。

轻轻混匀，避免产生气泡。然后，向梯度凝胶混合器管道腔的近端加入 2.6 毫升 6% 凝胶，远端加入 2.1 毫升 15% 凝胶。接着，打开磁力搅拌器，并开启梯度生成器腔室之间的管道和通道。

立即打开蠕动泵，流速调至每分钟5毫升。当管路中无凝胶时，填充玻璃板并移除针头。轻轻在凝胶上层覆盖蒸馏水，并在室温下静置至少1小时。

立即用蒸馏水冲洗管路，将梯度室中充满蒸馏水，并以最大流速使用蠕动泵。取6毫升蒸馏水与3毫升3x凝胶缓冲液混合，配制成1x凝胶缓冲液。用滤纸轻轻吸去凝胶表面的蒸馏水。

用1×凝胶缓冲液冲洗凝胶表面，并用滤纸轻轻吸去缓冲液。根据手稿配制4%浓缩胶。轻轻混匀，避免产生气泡。

然后，将梳子插入两块玻璃板之间，并在梳子下方倒入浓缩胶。确保梳子完全浸入。让浓缩胶聚合至少30分钟。

然后，移除梳子，并用移液器加入1×凝胶缓冲液洗涤各孔。进行蓝色天然凝胶电泳时，首先将蓝色阴极缓冲液加入凝胶盒中。用移液器以蓝色阴极缓冲液洗涤并充满各孔。

然后，将 5 至 30 微克的蛋白质样品加入上样孔中。用蓝色阴极缓冲液轻轻加满胶盒至顶部，并向电泳槽中加入阳极缓冲液。首先以 40 伏恒定电压电泳 15 分钟。

然后，将电压升至80伏。电泳运行至染料迁移至凝胶长度的2/3处。将蓝色阴极缓冲液更换为阴极缓冲液，继续电泳，直至染料前沿跑出凝胶。

取出玻璃板，通过半干转印法将蛋白质转移至PVDF膜上。使用25伏恒定电压，电流限制在1安培，转印30分钟。与未经处理的对照细胞相比，经氯霉素处理后，人神经母细胞瘤细胞中呼吸链复合物的组装受到抑制。

相比之下，由核基因编码的复合物表达上调。多次冻融循环后可观察到氧化磷酸化复合物的降解。凝胶的质量可能影响氧化磷酸化复合物的检测。

此外，膜的剥离会降低信噪比。在操作过程中，必须注意在低温条件下进行简单的样品制备和凝胶电泳，以保持氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的完整性。在完成蓝色天然PAGE后，可进行第二维SDS-PAGE，以研究呼吸链复合物的蛋白质亚基。

蓝色天然PAGE使研究人员能够研究氧化磷酸化系统复合物甚至超复合物的组装。