蓝色原代聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法诱导人细胞线粒体呼吸链配合物的分析

蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳允许分析线粒体氧化磷酸化系统的触觉复合物。它是一种方便、廉价的技术，可用于覆盖线粒体氧化磷酸化系统整个复合物的组装。要准备线粒体解酸，首先使用冰冷的PBS溶液轻轻清洗细胞一次。

刮取细胞，在800摄氏度下在4摄氏度下进行颗粒，10分钟。然后，用冰冷的PBS清洗细胞颗粒两次，在800G的4摄氏度下离心10分钟。接下来，在20毫升PBS中加入200微升100倍蛋白酶抑制剂。

将PBS蛋白酶抑制剂混合物中的细胞重新悬浮到每毫升5毫克的最终蛋白质浓度。要用蛋白酶抑制剂在PBS中准备3.3毫摩尔比诺宁，在100摄氏度的PBS中溶解4毫克的位杨素，直到看不到沉淀物。立即在冰上冷却，在1毫升的位丁宁溶液中加入10微升100倍蛋白酶抑制剂。

接下来，在最终浓度为1.65毫摩尔时，将数字素蛋白酶抑制剂混合物加入细胞中。混合好，在冰上孵育五分钟。然后，将PBS蛋白酶抑制剂混合物加入到1.5毫升的最终体积中。

在10，000G的4摄氏度下离心10分钟。去除上流剂，在线粒体缓冲液中重新悬浮线粒。在PBS抑制剂溶液中准备一毫升新鲜10%的露体安装。

在冰上1%的孵育最后浓度为1%的线粒体中加入10%的洛雷亚尔，至少15分钟。在20，000G的4摄氏度下离心20分钟。将上流液收集到新管中，然后添加样品缓冲液。

要为蓝色原生页面准备梯度凝胶，请先将梯度制造者放在搅拌板上，然后用柔性油管将其连接到近位泵。将带针的输液装置连接到管子上。将磁搅拌器放入梯度制造商的近端室，以最大泵速用蒸馏水清洗油管 10 分钟。

接下来，清空油管和梯度制造商。使用移液器去除梯度制造者腔室之间的通道中残留的蒸馏水。用阀门关闭通道和油管。

将两个玻璃板组装在支架上，并放在支架上。使用凝胶支架底部的孔，将针头连接到玻璃板之间的管子上。要制作 8.3 7.3 厘米凝胶，请先准备 6% 和 15% 凝胶溶液，并把它们放在冰上。

轻轻混合，避免产生气泡。然后，用 6% 凝胶的 2.6 毫升和 15% 凝胶的 2.1 毫升重装 2.6 毫升的梯度凝胶搅拌管室的近端。接下来，打开磁力搅拌器，打开管道和梯度制造者腔室之间的通道。

立即将近光泵打开至每分钟五毫升。当管子中没有凝胶时，填充玻璃板并取出针头。用蒸馏水轻轻覆盖凝胶，将凝胶保持室温至少一小时。

立即用蒸馏水填充梯度室，并使用近光泵以最大速度清洗管子。将六毫升蒸馏水加入三毫升的3倍凝胶缓冲液中，制作1x凝胶缓冲液。用滤纸轻轻去除凝胶表面的蒸馏水。

用 1x 凝胶缓冲液清洗凝胶表面，然后用滤纸轻轻取出缓冲液。根据手稿准备 4% 堆叠凝胶。轻轻混合以避免产生气泡。

然后，将梳子放在玻璃板之间，将堆叠凝胶倒入梳子下。将梳子完全浸。让堆叠凝胶聚合至少 30 分钟。

然后，拆下梳子并使用移液器用 1x 凝胶缓冲液清洗孔。要执行蓝色原生凝胶电泳，首先将蓝色阴极缓冲液添加到凝胶盒中。使用移液器用蓝色阴极缓冲液清洗和填充孔。

然后，将5至30微克蛋白质样品加载到井中。用蓝色阴极缓冲液轻轻填充凝胶盒到顶部，用阳极缓冲器将罐体填充。首先，以 40 伏的恒定电压运行凝胶 15 分钟。

然后，将电压增加至 80 伏。运行凝胶，直到染料达到凝胶长度的2/3。用阴极缓冲液更换蓝色阴极缓冲液，并继续电泳，直到染料前部从凝胶上脱落。

取回玻璃板，通过半干印迹将蛋白质转移到PVDF膜上。使用 25 伏的恒定电压和限制为 1 安培的电流 30 分钟。与无需治疗的对照细胞相比，在氯霉素治疗后抑制了人类神经母细胞细胞中呼吸链复合物的组装。

相比之下，由核基因编码的复合物受到向上调节。在多个冷冻-解冻周期中观察到氧化磷酸化复合物的降解。凝胶的质量会影响氧化磷酸化复合物的检测。

此外，剥离膜降低了信噪比。执行该过程时，重要的是要记住在寒冷条件下进行简单的制备和凝胶电泳，以保留在触觉中的 OXPHOS 复合物。继蓝色原生页面之后，第二维SDS页面可以应用于研究呼吸链复合物的蛋白质亚单位。

蓝色原生页面允许研究人员研究氧化磷酸化系统的复合物甚至超复合物的组装。