Name: 用于抗倍体植入前基因测试的半导体测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 了解用于胚胎非整倍体筛查的半导体测序方法。该技术具有运行时间短、成本低、通量高的特点，可在五天内完成从样本接收到出具报告的流程，为植入前遗传学检测提供高效可靠的解决方案。

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本研究得到了中国香港地区的一般研究基金（编号：14162417）、国家自然科学基金委员会（编号：81860272）、广西壮族自治区科学技术基金重大研究计划（编号：AB16380219）以及中国博士后科学基金（编号：2018M630993）的资助。

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<li>Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+microarray-based+24+chromosome+aneuploidy+screening+demonstrates+that+cleavage-stage+FISH+poorly+predicts+aneuploidy+in+embryos+that+develop+to+morphologically+normal+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts.</a> Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).</li>
<li>Barbash-Hazan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+aneuploid+embryos+undergo+self-correction+in+correlation+with+their+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).</li>
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<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+next-generation+sequencing-based+protocol+for+24-chromosome+aneuploidy+screening+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos.</a> Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).</li>
<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+preimplantation+genetic+screening+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li>
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<li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium%2FEmbryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis%2Fscreening+%28PGD%2FPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与其他测序化学方法不同，此处描述的测序仪采用半导体技术检测核苷酸。该芯片本身是一种电子器件，可通过聚合酶介导的碱基掺入过程检测氢离子17，从而实现质子测序仪（Proton）2−4小时的测序时间。此外，该芯片为微孔芯片，可实现单个靶分子的定位，这与其他测序仪供应商采用的流动池测序化学方法不同。本方案是为植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）应用而优化的改良方案。优化内容包括：采用酶法而非超声处理对扩增后的DNA进行片段化，以降低污染风险，以及优化片段筛选和PCR体系，以在降低成本的同时获得更佳性能。此外，在临床应用中，我们使用经过验证的内部流程进行变异检测。
在操作过程中需注意若干关键步骤。用于纯化的乙醇必须在实验前新鲜配制，因为乙醇浓度过高会导致污染DNA洗涤不充分，而浓度过低则会引起目标DNA的损失。荧光计必须使用已知浓度的阳性对照进行校准，以确保检测结果的准确性。此外，模板的充分加载对测序至关重要。适当大小的气泡有助于推动模板微珠进入微孔，但气泡过大可能导致加载不充分。用户可根据需要调整每次运行所测序的样本数量（不一定为24个）。...

在辅助生殖中，选择染色体拷贝数正常（整倍体）且质量优良、具有活力的胚胎进行移植，有助于改善妊娠结局。传统上，由于形态学评分系统易于获取且具有非侵入性，已被广泛用于胚胎评估。然而研究表明，形态学评估仅能提供有限的胚胎质量1和着床潜力2信息。其根本原因之一在于无法评估胚胎的染色体组成。
染色体非整倍体（染色体数目异常）是导致胚胎发育停滞、着床失败或妊娠丢失的主要原因之一。人类胚胎中非整倍体的发生率已有充分记录，在卵裂期胚胎中占60%−70%3,4，在囊胚中占50%−60%5。这在一定程度上造成了体外受精（IVF）治疗妊娠率提升的瓶颈，目前其妊娠率仍维持在约35%−40%6,7。因此，选择整倍体胚胎进行移植被认为有助于改善妊娠结局。为此，已进一步发展了针对非整倍体的胚胎植入前遗传学检测（PGT-A），以通过遗传学方法评估胚胎的发育潜能。越来越多的随机对照试验和队列研究支持PGT-A的关键作用。已有研究证实，应用PGT-A可降低流产率，并提高临床妊娠率和着床率8，以及持续妊娠率和活产率9。
历史上，植入前遗传学检测非整倍体（PGT-A）曾采用多种不同方法，例如荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）、微阵列-CGH（array-CGH）以及单核苷酸多态性（SNP）微阵列。先前的研究表明，通过FISH对卵裂期胚胎进行PGT-A所得结果，与利用59273array-CGH或SNP微阵列5927310对相应囊胚进行全染色体筛查（CCS）所获得的结果一致性较差。这些差异可能归因于染色体嵌合现象、FISH技术本身产生的假象，或胚胎在发育过程中对染色体分离错误的自我校正能力11。目前普遍认为，采用囊胚滋养外胚层（TE）活检结合基于微阵列的技术（如array-CGH或SNP微阵列）进行PGT-A，能够有效识别胚胎中的染色体不平衡10,12。近年来，单细胞高通量测序（NGS）作为一种高通量且成本效益较高的遗传分析方法，已在PGT-A中展现出临床应用价值13,14,15，使其成为现有检测方法的一种极具前景的替代方案。
本文介绍一种基于半导体测序的快速、稳健且低成本的高通量测序（NGS）方法，用于人类胚胎非整倍体的筛查。该流程的第一步是对活检所得的胚胎样本进行全基因组扩增（WGA），使用单细胞WGA试剂盒完成；随后构建测序文库，并在半导体测序系统上进行测序。
通过检测DNA链合成过程中每个脱氧核糖核苷三磷酸掺入时释放的H+离子，该系统将半导体元件捕获的化学信号（pH变化）直接转换为数字数据，并进一步解读为DNA序列信息。这种简单的测序化学方法无需昂贵的光学检测和复杂的测序反应，从而降低了总体试剂成本，并将测序运行时间缩短至2−4小时16。更重要的是，根据制造商的性能规格，该半导体测序平台每次运行最多可产生15 GB的测序数据（取决于文库质量），显著高于其他一些仅产生约3−4 GB数据（读长为2 × 75 bp）的测序仪17。在PGT-A的临床应用中，该平台可在每张芯片上处理24个样本，产生多达8000万条读段17，每个样本至少获得100万条唯一读段。测序深度可确保每个样本的全基因组覆盖度至少达到0.05x。该平台的上述优势使其成为理想的筛查方法，因而促进了其在PGT-A中的广泛应用18。

<table><tbody><tr><td>PCR管，0.2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4，不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M NaOH (1.0N) 溶液</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S2567</td><td>用于熔解溶液。分子级</td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind 管，1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ELGA PURELAB Flex 3 水纯化系统或&lt;br/&gt;等效的18 M&amp;Omega;水系统</td><td>ThermoFisher</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 扩增缓冲液</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 扩增酶</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。</td></tr><tr><td>Ion OneTouch 扩增板</td><td></td><td></td><td>包含于试剂盒：Ion OneTouch 2 Supplies（部件号 A26367）。扩展试剂盒组件见表5</td></tr><tr><td>Ion PI 退火缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyOne 磁珠捕获溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪仪器</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 裂解溶液（黑色盖）</td><td></td><td></td><td>包含于试剂盒：Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200（部件号 A26429）。扩展试剂盒组件见表5</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠</td><td>ThermoFisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 细胞裂解缓冲液</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-00。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 细胞裂解酶</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。</td></tr><tr><td>Ion PI 芯片试剂盒 v3</td><td>ThermoFisher</td><td>A26771</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chip Minifuge，230 V</td><td>ThermoFisher</td><td>4479673</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dATP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dCTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dGTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ThermoQ&amp;ndash;温度干浴器</td><td>TAMAR</td><td>HB-T2-A</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext 双链DNA片段化酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext 双链DNA片段化酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dTTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 2 仪器</td><td>ThermoFisher</td><td>INS1005527</td><td>ThermoFisher 货号：4474778。</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion One Touch ES</td><td>ThermoFisher</td><td>8441-22</td><td>ThermoFisher 货号：4469495。扩展试剂盒组件见表5</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>51976</td><td>可由任意品牌的分子级无水乙醇替代。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 提取酶稀释缓冲液</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-01。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 提取酶稀释缓冲液</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-02。</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td>该型号已被Qubit 4 荧光计替代，货号：Q33226。</td></tr><tr><td>Qubit ds DNA HS 检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>M2002-02</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 起泡溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>文库加标签用索引</td><td>BaseCare</td><td></td><td>为实验室自制索引。用户可购买ThermoFisher的Ion Xpress Barcode Adapters试剂盒（货号：4474517）作为商业产品。</td></tr><tr><td>Ion PI 上样缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Solid(TM) 缓冲液试剂盒-1X 低TE缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>4389764</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 试剂盒</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架（磁性支架）</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Master Mix PCR 缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 微型离心机</td><td>Micro 17</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>可由其他品牌替代。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 无核酸酶水</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。</td></tr><tr><td>Ion OneTouch 油瓶</td><td></td><td></td><td>Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200（部件号 A26429）。扩展试剂盒组件见表5</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>扩展试剂盒组件见表3</td></tr><tr><td>双链DNA标准品</td><td></td><td></td><td>为实验室自制的DNA标准品，用于文库定量前Qubit的校准。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 预扩增缓冲液</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 预扩增酶</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。</td></tr><tr><td>文库扩增引物混合液</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>扩展试剂盒组件见表3</td></tr><tr><td>Ion OneTouch 反应滤器</td><td></td><td></td><td>扩展试剂盒组件见表5</td></tr><tr><td>回收路由装置</td><td></td><td></td><td>扩展试剂盒组件见表5</td></tr><tr><td>回收管</td><td></td><td></td><td>扩展试剂盒组件见表5</td></tr><tr><td>ISP 重悬溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ion Proton</td><td>ThermoFisher</td><td>DA8600</td><td>该型号由中山大学达安基因有限公司从ThermoFisher进口，并已获得中国食品药品监督管理局的临床应用认证。ThermoFisher目录号为4476610。</td></tr><tr><td>Ion PI Hi?Q 测序聚合酶</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 测序引物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>测序仪服务器</td><td>Lenovo</td><td>T260</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 球形颗粒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 25 mm 注射器滤器</td><td>ThermoFisher</td><td>724-2045</td><td>孔径：0.45&amp;mu;m。专用于水性液体。</td></tr><tr><td>Ion PI Hi?Q W2 溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 1X W3 溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 洗涤溶液 C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The Ion PGM Hi?Q View 测序试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>A30044</td><td>扩展试剂盒组件见表2</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>扩展试剂盒组件见表3</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q 测序200试剂盒（每次初始化支持一次测序运行）</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td>扩展试剂盒组件见表4</td></tr><tr><td>Ion PI Hi?Q OT2 200 试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>A26434</td><td>扩展试剂盒组件见表5</td></tr></tbody></table>

半导体测序用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

染色体非整倍性是导致胚胎发育停滞、着床失败或妊娠丢失的主要原因之一，在人类胚胎中已有充分记录。针对非整倍性的胚胎植入前遗传学检测（PGT-A）是一种能够通过检测胚胎染色体异常显著改善生殖结局的遗传学检测技术。新一代测序（NGS）为遗传分析提供了高通量且成本效益高的方法，并已在PGT-A中展现出临床适用性。本文介绍一种基于半导体测序的快速、低成本NGS方法，用于胚胎非整倍性筛查。该流程的第一步是对活检所得的胚胎样本进行全基因组扩增（WGA），随后构建测序文库，并在半导体测序系统上进行测序。通常情况下，在PGT-A应用中，每个芯片可加载并测序24个样本，产生6000万至8000万条读长，平均读长为150个碱基对。该方法优化了测序文库模板扩增与富集的实验流程，使PGT-A检测具有可重复性、高通量、成本低且节省时间的优点。该半导体测序仪的运行时间仅为2至4小时，将从接收样本到出具报告的周转时间缩短至5天。上述优势使该检测方法成为检测胚胎染色体非整倍性的理想选择，从而促进其在PGT-A中的广泛应用。

基于此改进后的方案，半导体测序平台首次被应用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）。我们对来自卵裂期卵裂球和囊胚期胚胎的活检样本进行了测试。建议活检细胞应尽快进行全基因组扩增（WGA），以防止DNA降解。先前一项研究比较了不同WGA方法的性能，结果表明，本文所述方法在100 KB的分箱尺寸下具有最佳的扩增均一性20。综合考虑扩增均一性与中位绝对成对差异（MAPD）21的表现，本研究选择该WGA方法用于半导体测序仪的PGT-A检测。通过对186个卵裂期胚胎和1135个囊胚期胚胎进行回顾性统计分析，我们发现卵裂球样本的WGA成功率为95.4%，囊胚样本的成功率为96.9%（图1）。文库构建前的纯化步骤作为片段大小选择过程，对测序质量至关重要，因其可富集较大的DNA片段。此外，该步骤有助于实现文库构建所需的300 ng输入量。酶法片段化方法可高效地将WGA产物剪切至约160 bp。
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本文介绍了一种用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）的半导体测序方法，该方法具有周转时间短、成本低和高通量的优点。

染色体非整倍性是导致胚胎发育停滞、着床失败或妊娠丢失的主要原因之一，已有充分文献记载……

本文介绍的方案是一种快速、低成本的基于半导体测序技术的胚胎非整倍体筛查方法。经过优化的模板扩增实验流程以及测序文库构建步骤，使胚胎植入前非整倍体检测（PGTA）具有可重复性、高通量、成本效益高且节省时间的特点。该半导体测序仪的运行时间仅为两到四小时。将从接收样本到出具报告的周转时间缩短至五天。该方法可提供用于非整倍体筛查、拷贝数变异分析以及单核苷酸多态性检测的基因组测序。由于测序化学原理不同，本方案所制备的文库无法直接在其他测序系统上进行测序。但使用相同的测序仪，仅采用不同的文库制备方法，即可实现无创产前筛查。本次实验操作由本实验室技术员 Xiangchun Guo 演示。开始测序前，将每个稀释后的文库涡旋混匀，并在小型离心机上短暂离心，每次3秒，共离心4次。然后，取每个文库五微升，加入无核的1.5毫升离心管中进行混合。涡旋振荡混合文库，并在小型离心机上短暂离心三秒。向两个新的回收管中各加入150微升裂解液。安装新的回收管、回收装置和扩增板。通过倒置油瓶三次来混匀。确保油和回收溶液的液面高度均至少达到三分之二以上。将主混合PCR缓冲液涡旋振荡30秒，并在小型离心机上短暂离心3秒。将微球颗粒和混合文库分别涡旋振荡1分钟，并在小型离心机上短暂离心3秒。接下来，向含有2000 µL主混合PCR缓冲液的离心管中加入172 µL无核酸酶水、8 µL混合文库、120 µL酶混合液和100 µL微球颗粒，配制成总体积为2400 µL的连接反应混合液。将移液器调至 800 微升，通过样品口将连接反应混合物加入反应滤膜中。将油瓶倒置三次，使用 P1000 移液器向反应滤膜中加入 200 微升反应油。选择 Proton 程序，然后选择辅助按钮，根据显示器上的指示确保设备已正确设置。然后单击“下一步”以启动程序。将100 µL乳液PCR产物样品、130 µL洗涤后的磁珠、300 µL ES洗涤液和300 µL洗脱液加入八联管条中。将八联管条放置到富集系统上。安装移液枪头和一个新的0.2 mL离心管，并启动程序。在15,500 ×g条件下离心0.2 mL离心管5分钟。弃去上清液，保留10 µL富集产物。向离心管中加入 200 微升无核酸酶水，通过涡旋振荡混匀。再次离心 0.2 毫升离心管。弃去上清液，保留 10 微升富集产物。向离心管中加入90微升无核酸酶水，通过涡旋振荡混匀。为制备模板，涡旋振荡阳性对照后短暂离心。取5微升阳性对照加入100微升富集产物中。涡旋混匀后，在15,500 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，保留10微升模板。接着，向模板管中加入20微升测序引物和15微升退火缓冲液。涡旋振荡离心管，并在小型离心机上短暂离心三秒钟。将离心管放入带加热盖的热循环仪中孵育。然后向离心管中加入10 µL上样缓冲液。通过上下吹打混匀。用移液器上下吹打55 µL样品使其混匀，并将样品加入芯片的加样孔中。保留使用过的移液器吸头和0.2 mL PCR管。当部分样本进入芯片后，将芯片放入微型离心机中。检查芯片位置，然后离心10分钟。取500微升杂交缓冲液和500微升无核酸酶水加入1.5毫升离心管中，配制50%杂交缓冲液。通过将500微升退火缓冲液和500微升100%异丙醇加入一个1.5毫升离心管中，制备冲洗溶液。然后，通过将49微升50%退火缓冲液和1微升发泡溶液加入两个新的1.5毫升离心管中，制备发泡混合液。用移液器将空气吹入其中一份发泡混合液中，产生泡沫后，将120微升泡沫加入上样孔中。将出口孔中排出的过量液体转移至加样孔中，然后在芯片迷你离心机上离心芯片30秒。对第二种发泡混合物重复此过程。向保存在0.2毫升离心管中的样品加入55微升50%退火缓冲液。使用保留的吸头进行上下吹打。将55微升退火缓冲液全部加入上样孔中。将芯片放入指定的芯片迷你离心机中，离心30秒。将100微升冲洗液加入芯片加样孔中，并弃去出口孔中排出的液体。重复此加样步骤一次。向芯片加样孔中加入100微升50%退火缓冲液。重复此上样步骤，共三次。在新的1.5毫升离心管中加入60微升50%退火缓冲液和6微升测序酶。通过移液器吹打混匀。将65微升该混合溶液缓慢移液至芯片加样孔中，避免产生气泡。将芯片避光保存，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，立即把芯片装载到测序仪上，然后在屏幕上点击“开始测序运行”以启动测序。对186个卵裂期胚胎和1135个囊胚期胚胎进行的回顾性统计分析显示，两种样本的全基因组扩增（WGA）成功率均超过95%。卵裂期组测序质控失败率为3.4%，囊胚期组仅为1.9%。除非整倍性分析外，测序数据还可用于其他分析。例如，拷贝数变异的大小小于五兆碱基，或线粒体DNA分析，具体取决于测序深度和质量。随着拷贝数检测技术的不断改进，研究人员可以进一步探究人类早期胚胎中染色体嵌合现象的未来发展方向。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

用于抗倍体植入前基因测试的半导体测序

本文介绍了在临床环境中应用于胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的单细胞FISH探针选择、卵裂球细胞核铺展技术、原位杂交以及信号判读方法。...

用于胚胎植入前遗传学诊断的荧光原位杂交技术

亚硫酸氢盐突变是分析DNA甲基化的金标准。我们改进的方案可实现单细胞水平的DNA甲基化分析，专为单个卵母细胞设计，也可用于卵裂期胚胎。...

单卵母细胞亚硫酸氢盐突变分析

室管膜下结节状异位（PNH）是成年期最常见的皮质发育畸形（MCD）形式，但在大多数散发病例中，其遗传基础仍不明确。我们近期开发了一种策略，用于识别MCDs的新型候选基因，并直接验证其致病作用 体内.

一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略 子宫内 电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因

下一代测序（NGS）是一种强大的基因组表征工具，但其应用受到该平台较高错误率（约0.5–2.0%）的限制。我们介绍了错误校正测序的方法，可消除NGS的错误率影响，检测到低至0.0001变异等位基因分数的突变。...

利用纠错型DNA和RNA测序进行稀有事件检测

本实验方案的目的是在不牺牲胚胎的情况下，对原肠胚形成时期的海葵Nematostella...

海葵早期发育过程中的基因分型

本研究报道了一种利用使用过的胚胎培养液对人类胚胎进行染色体筛查的方案，该方法无需胚胎活检，即可通过高通量测序（NGS）实现染色体倍性鉴定。本文详细介绍了实验流程，包括培养液的准备、全基因组扩增（WGA）、高通量测序（NGS）文库构建以及数据分析。...

利用培养废液对人类植入前胚胎进行染色体筛查：样本采集与染色体倍性分析

本方案介绍了在基于半导体的下一代测序平台上进行胚胎植入前非整倍体遗传学检测所需的全部实验室操作流程。本文详细阐述了全基因组扩增、DNA片段筛选、文库构建、模板制备及测序工作流程的各个步骤，并展示了代表性结果。...

基于半导体的下一代测序平台上进行非整倍体植入前遗传学检测

本方案介绍了基于离子半导体测序平台检测胃癌样本中单核苷酸多态性所需的完整实验流程。同时详细描述了目标序列、连接接头、文库扩增与纯化步骤，以及质量控制标准。...

基于离子半导体测序平台的胃癌多基因单核苷酸多态性检测

本文介绍了一种利用甲基结合DNA捕获测序技术（MBDCap-seq 或...

用于患者组织的甲基化结合DNA捕获测序

我们在此报告对分子遗传操作的方法 Yarrowia lipolytica Po1g菌株以提高基因敲除效率。所获得的基因工程菌株 Y. lipolytica...

非常规酵母的基因工程改造用于可再生生物燃料与生物化学品生产

了解用于胚胎非整倍体筛查的半导体测序方法。该技术具有运行时间短、成本低、通量高的特点，可在五天内完成从样本接收到出具报告的流程，为植入前遗传学检测提供高效可靠的解决方案。

半导体测序用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测

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