Name: 体外肿瘤细胞恢复对 chimeric 抗原受体 t 细胞抗肿瘤功能的预测评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 了解体外共培养方法评估CAR T细胞抗肿瘤功能，通过重复肿瘤细胞挑战分析胶质母细胞瘤中的T细胞活化与耗竭。该方法支持高通量筛选，有助于优化癌症免疫治疗策略。

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本工作获得了加州再生医学研究所（CIRM）资助项目TR3-05641以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目P30 CA33572（核心设施）的支持。D.W. 获得了美国国家癌症研究所（NCI）F99奖学金1F99CA234923-01的资助。

我们的机构审查委员会（IRB）不要求对此方案进行审查。我们接收来自希望城病理学部门的废弃新鲜胶质母细胞瘤肿瘤样本，这些样本经过编码，我们的实验室无法获取解码信息。我们接收的标本仅附有活检/切除时的既往治疗情况和疾病状态数据，不包含任何可识别个人信息。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>准备用于培养原代胶质母细胞瘤（GBM）细胞系的神经干细胞培养基：DMEM:F12，1:50 B27，5 µg/mL 肝素，2 mmol/L L-谷氨酰胺；每周两次补充 20 ng/mL 表皮生长因子（EGF）和 20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（FGF）（参见材料表）。</li>
	<li>准备T细胞培养基：含10%胎牛血清（FCS）的X-VIVO 15培养基；每48小时补充70 IU/mL重组人IL-2（rhIL-2）和0.5 ng/mL重组人IL-15（rhIL-15）（参见材料表）。</li>
	<li>准备共培养培养基：取不含EGF和FGF补充物的神经干细胞培养基，加入10% FCS。</li>
	<li>准备流式细胞术染色溶液（FSS）：HBSS，2% FCS，NaN3（0.5 g/500 mL）。</li>
</ol>
2. 胶质母细胞瘤肿瘤细胞的制备
<ol>
	<li>通过在300 × g 条件下离心4分钟收集低代次胶质母细胞瘤肿瘤球（TSs），弃去上清液。 
	注意：胶质母细胞瘤肿瘤球（TSs）由切除的肿瘤组织按先前所述方法制备22,23,24，并在37 °C、5% CO2 的培养箱中，使用神经干细胞培养基进行维持培养。</li>
	<li>将共培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>向胶质母细胞瘤肿瘤球（TSs）中加入1 mL冷的Accutase溶液，通过吹打30–60秒使肿瘤球解离，随后加入5 mL预热的共培养基终止消化。 
	注意：胶质母细胞瘤肿瘤球（TSs）在Accutase中的处理时间不应超过5分钟。</li>
	<li>在300 × g 条件下离心4分钟收集胶质母细胞瘤细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于2 mL共培养基中。</li>
	<li>使用细胞活力计数仪测定细胞浓度。 
	注意：细胞活力必须&#62;70%。</li>
</ol>
3. CAR T 细胞的制备
<ol>
	<li>在检测前不到24小时，取100 µL培养的CAR T细胞加入流式管中，并加入2 mL FSS。 
	注意： CAR T细胞按先前所述方法制备11,21，并在T细胞培养基中培养。</li>
	<li>以300 × g 离心4分钟，弃上清液。</li>
	<li>加入2 mL FSS洗涤细胞，以300 × g 离心4分钟，弃上清液。</li>
	<li>在4 °C条件下，使用适当的抗体对细胞染色30分钟，以检测CAR表达。 
	注意： 例如，若使用先前描述的靶向IL13Rα2的CAR25，则使用抗IL13抗体进行染色。</li>
	<li>用2 mL FSS洗涤两次，然后使用流式细胞仪分析CAR表达情况。</li>
	<li>根据图1B所示的设门策略确定T细胞上的CAR%。</li>
	<li>共培养当天，以300 × g 离心4分钟收集全部CAR T细胞，弃上清液，并将细胞重悬于2 mL共培养培养基中。</li>
	<li>使用细胞活力计数仪测定细胞浓度。 
	注意： 细胞活力必须&#62;70%。</li>
</ol>
4. 建立肿瘤细胞与T细胞共培养体系
<ol>
	<li>用共培养培养基将肿瘤细胞稀释至浓度为 0.16 百万/mL。</li>
	<li>根据 CAR%，用共培养培养基将 CAR T 细胞稀释至 CAR+ 细胞浓度为 0.04 百万/mL。 
	注意：例如，若 CAR 表达率为 50%，T 细胞浓度为 0.4 百万/mL，则需进行 1:5 稀释，以获得最终浓度为 0.04 百万 CAR+ 细胞/mL。</li>
	<li>将 100 µL 稀释后的肿瘤细胞加入 96 孔平底组织培养板的每孔中。</li>
	<li>将 100 µL 稀释后的 CAR T 细胞加入含有肿瘤细胞的各孔中，并充分混匀。 
	注意：每组肿瘤细胞-T 细胞共培养需在 4 个时间点进行分析。每个时间点可能需要 4–6 个重复，具体取决于不同的分析方法，但不建议每个时间点少于 &#60;3 个重复；代表性板图请见 表 1。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。</li>
</ol>
5. 肿瘤细胞再攻击
注意：再次刺激在初次共培养建立后的第2、4和6天进行（图1A）。
<ol>
	<li>按照上述方法（步骤 2.1-2.6）收获并解离胶质母细胞瘤肿瘤球（GBM TSs）。</li>
	<li>将胶质母细胞瘤细胞重悬于浓度为 0.64 百万/mL 的培养基中。</li>
	<li>确定需要再次刺激的共培养孔（见表 1），并小心从每孔上清中移除 50 µL 培养基。</li>
	<li>向每孔中加入 50 µL 胶质母细胞瘤细胞悬液，充分混匀后，将培养板放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中继续培养。</li>
</ol>
6. 收集样品并进行流式细胞术分析
注意：样品将在初次共培养建立后的第1、3、5和7天采集，分别对应1、2、3和4轮肿瘤刺激。
<ol>
	<li>将0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>确定需要收获的孔，并将培养基转移至新的圆底96孔板中。</li>
	<li>向孔中加入50 µL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C下消化残留的肿瘤细胞5分钟。</li>
	<li>在显微镜下确认细胞已从孔底脱落。</li>
	<li>用移液器吹打孔底使脱落的细胞重悬，然后将含有脱落细胞的胰蛋白酶-EDTA溶液转移至圆底96孔板中对应的孔。</li>
	<li>将圆底96孔板在300 x g、4 °C条件下离心4分钟，弃去上清液。</li>
	<li>每孔加入200 µL FSS洗涤细胞，在300 x g、4 °C条件下离心4分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用含抗体（见材料表）的100 µL/孔FSS重悬细胞，在4 °C避光孵育30分钟进行染色。</li>
	<li>每孔加入100 µL FSS，于300 x g、4 °C离心4分钟，弃去上清液。</li>
	<li>每孔加入200 µL FSS洗涤细胞，在300 x g、4 °C条件下离心4分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用含500 ng/mL DAPI的100–200 µL/孔FSS重悬细胞，随后通过流式细胞术分析样品。</li>
</ol>
7. CAR T 细胞的功能与表型分析
<ol>
	<li>从流式细胞仪中获取数据文件，并圈选所有活细胞（DAPI-）（图1C）。</li>
	<li>通过圈选 CD45- 群体来定量肿瘤细胞，通过圈选 CD45+、CAR+ 群体来定量CAR T细胞（图1C）。 
	注意：如果肿瘤细胞表达 CD45（例如 Raji 淋巴瘤细胞），可使用抗 CD3 染色来区分T细胞与肿瘤细胞。</li>
	<li>绘制随时间变化的肿瘤细胞和CAR T细胞数量曲线。</li>
	<li>通过 4-1BB 和 CD69 的共表达来鉴定T细胞的活化状态。 
	注意：这些表面标志物可用于初始共培养后6–24小时分析T细胞活化情况。</li>
	<li>通过 PD-1、LAG-3 和 TIM-3 的表达来鉴定T细胞耗竭状态。</li>
	<li>通过 CD45RO 和 CD62L 的表达来鉴定T细胞记忆状态。</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults%3A+a+phase+1+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li>
<li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
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<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths+to+stemness%3A+building+the+ultimate+antitumour+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-targeted+CD4%2B+CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li>
<li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8%2B+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li>
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<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li>
</ol>

本研究中描述的CAR构建体已授权给Mustang Bio., Inc.，S.J.F.和C.E.B.将因此获得特许权使用费。其余所有作者声明不存在潜在的利益冲突。

这种重复性肿瘤细胞攻击实验提供了一种便捷的方法，用于评估CAR T细胞的功能效力，其体外实验体系可模拟体内肿瘤模型中的高肿瘤负荷状态。在为期7天的实验过程中，CAR T细胞经历四轮肿瘤攻击（初始共培养及三次重复再攻击），从而形成一种微环境，使得T细胞可能在初始强烈应答后逐渐耗竭，并丧失对后续肿瘤攻击的响应能力。该实验可获取两个基本的检测指标：肿瘤细胞清除能力和CAR T细胞扩增能力；同时，通过表面或细胞内标志物染色，可方便地分析CAR T细胞的表型特征，以反映T细胞的活化、耗竭和/或记忆状态。该实验体系还便于与CAR T细胞转录组、蛋白质组或磷酸化蛋白质组的非偏倚性分析相结合。21,26以及用于预测临床反应的T细胞多能性27此外，还可检测肿瘤细胞对T细胞免疫的适应性反应，例如细胞因子的分泌情况28由于在多个时间点收集样本，该检测不仅能够对CAR T细胞在应对过量肿瘤细胞时的行为进行静态分析，还能够进行动态分析。
该检测方法在比较靶向相同抗原但设计不同和/或生产工艺不同的CAR T细胞效应效力方面具有显著优势。我们已利用此方法发现，CD4+ CAR T细胞相较于CD8+ T细胞能够介导更优异的长期效应功能21。此外，研究还表明，体内CAR的疗效与此检测过程中较晚时间点（第5至第7天）的细胞毒性相关，进一步凸显了在体外评估CAR T细胞时采用重复性肿瘤攻击的必要性。尽管本实验以胶质母细胞瘤（GBM）细胞作为靶细胞的示例，但该检测方法可轻松适用于其他T细胞-肿瘤组合。值得注意的是，CAR T细胞的行为也会因抗原密度的不同而发生变化，而通过基因工程改造癌细胞以表达不同水平的靶向抗原，为研究CAR识别后发生的级联分子事件提供了有力工具29。因此，该检测还可用于分析特定CAR T细胞针对不同靶标的激活模式。
由于靶细胞活力和CAR T细胞扩增是本实验的两个首要检测指标，因此所有共培养体系必须起始于具有活性（&#62;70%）的肿瘤细胞和T细胞。在进行再刺激操作时，吸取培养基（步骤5.3）的动作不应扰动孔底的肿瘤细胞和T细胞，以避免引入不必要的细胞计数差异。当本实验用于悬浮生长的靶细胞系时，建议在肿瘤细胞再刺激前通过离心收集残留细胞。
该实验的一个局限性在于，实验设置参数（初始共培养和再挑战的效靶比）需要根据不同CAR-肿瘤组合进行调整。例如，如果肿瘤细胞表达较高水平的免疫抑制分子（如PD-L1），则建议采用较高的效靶比，因为与PD-L1低表达的肿瘤细胞相比，总体杀伤效率会受到影响。在将该实验应用于新的CAR-肿瘤组合之前，建议先开展预实验以确定最佳条件，通常应使在实验中测试的最具活性的CAR T细胞在实验终点时能够清除&#62;80%的肿瘤细胞。由于CAR T细胞介导的杀伤作用需要直接的细胞间接触，如果肿瘤细胞经过荧光标记，则流式细胞术分析的荧光通道需相应调整（例如，若肿瘤细胞标记了GFP，则不应使用FITC偶联的抗体）。
CAR T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤方面的临床活性已促成两种获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物。然而，不同患者之间的治疗反应存在显著差异27,30,31，这种差异已被证实与CAR产品的表型特性相关30。本体外重复性肿瘤攻击实验提供了一种功能检测CAR效应细胞效力的方法，可作为表型分析和多功能细胞因子分泌检测的补充，并且相较于体内肿瘤模型，能够实现更高通量的临床产品筛选，同时保持较高的预测准确性。总体而言，该实验可用于CAR T细胞设计、临床前及临床开发阶段的T细胞功能检测。

利用嵌合抗原受体（CAR）工程化T细胞进行免疫治疗在对抗B细胞恶性肿瘤方面已显示出良好的疗效1,2,3,4，而针对其他肿瘤的应用潜力仍在深入研究中5,6,7。目前在优化CAR结构、制备工艺以及患者输注前治疗方案方面已取得显著进展6,7,8，新型合成生物学方法有望进一步提高CAR T细胞的持久性、安全性和肿瘤特异性9,10。然而，准确评估CAR T细胞的治疗潜力以指导最佳临床转化方案仍面临困难且耗时耗力。迄今为止，评估CAR T细胞功能最成熟的方法是在携带人源肿瘤异种移植的免疫缺陷小鼠模型中进行，通过检测CAR T细胞的抗肿瘤效果，并在不同细胞剂量下进行比较11,12,13,14,15。这类体内小鼠实验工作量大、耗时长，尤其在需要筛选大量参数时更为明显。此外，体内实验还可能受到小鼠品系获取、动物饲养设施及动物操作技术的限制。因此，亟需建立更为便捷的体外检测方法，以快速读取效应活性，同时又能真实反映这些T细胞在体内的抗肿瘤功能。
传统的体外检测T细胞毒性的方法主要集中在脱颗粒、细胞因子产生以及裂解放射性同位素标记靶细胞的能力（例如铬释放实验）的检测。尽管这些实验对于定义CAR T细胞的特异性和重定向靶标识别具有重要信息价值，但它们往往无法反映工程化T细胞在体内的抗肿瘤潜力12,13,16。在某些情况下，短期体外杀伤实验的结果甚至与体内抗肿瘤功能呈负相关16。这种不一致很可能是由于这些体外实验中使用了较高的效应细胞与靶细胞（E:T）比例，因而无法区分那些易于发生耗竭的CAR T细胞产品17。相比之下，在体内肿瘤清除过程中，T细胞通常需要应对较大的肿瘤负荷，因而需经历多轮杀伤，进而驱动T细胞的分化和耗竭18,19,20，而T细胞耗竭是CAR T细胞有效清除肿瘤的主要障碍之一12,13。同时，大多数短期体外杀伤实验也无法检测T细胞增殖能力的差异，而在接受CAR T细胞治疗的患者中，CAR T细胞的扩增能力与临床应答密切相关4。因此，理想的体外实验应能模拟高肿瘤负荷的条件，诱导T细胞耗竭，并能够检测T细胞的扩增情况。
本文介绍了一种通过简单的体外共培养实验评估CAR T细胞重复杀伤肿瘤潜能的策略。该方法可同时检测多种T细胞效应功能参数，包括靶细胞杀伤、CAR T细胞扩增以及与记忆性或耗竭相关的表型。该实验所得结果与CAR T细胞在体内的抗肿瘤效应具有良好相关性，可用于评估CAR T细胞产品的效力。尽管本文描述的是针对IL13Ra2的CAR T细胞杀伤原代胶质母细胞瘤（GBM）细胞系的实验方法21，但该方案可轻松适用于任何CAR T细胞平台。

<table><tbody><tr><td>不含钙和镁的HBSS中的0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA</td><td>康宁</td><td>MT25051CI</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺</td><td>Cambrex 生物科学</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）—FluoroPure 级</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>创新细胞技术</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aldesleukin Proleukin（rhIL-2）</td><td>诺华肿瘤学</td><td>NDC 0078-0495-61</td><td></td></tr><tr><td>抗CD137，PE</td><td>BD 生物科学</td><td>555956</td><td>4B4-1</td></tr><tr><td>抗CD19，PE-Cy7</td><td>BD 生物科学</td><td>557835</td><td>SJ25C1</td></tr><tr><td>抗CD3，PERCP</td><td>BD 生物科学</td><td>340663</td><td>SK7</td></tr><tr><td>抗CD4，FITC</td><td>BD 生物科学</td><td>340133</td><td>SK3</td></tr><tr><td>抗CD45，PERCP</td><td>BD 生物科学</td><td>340665</td><td>2D1</td></tr><tr><td>抗-CD45RO，PE</td><td>BD 生物科学</td><td>561137</td><td>UCHL1</td></tr><tr><td>抗CD62L，APC</td><td>BD 生物科学</td><td>559772</td><td>DREG-56</td></tr><tr><td>抗CD69，APC</td><td>BD 生物科学</td><td>340560</td><td>L78</td></tr><tr><td>抗CD8，APC-Cy7</td><td>BD 生物科学</td><td>348793</td><td>SK1</td></tr><tr><td>抗IL-13，PE</td><td>BD 生物科学</td><td>340508</td><td>JES10-5A2</td></tr><tr><td>抗LAG-3，PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-2239-41</td><td>3DS223H</td></tr><tr><td>抗PD-1，APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>329921</td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>抗TIM-3，APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-3109-42</td><td>F38-2E2</td></tr><tr><td>B-27 无血清添加剂（50倍浓缩）</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>康宁 96 孔透明平底聚苯乙烯 TC 处理微孔板，单独包装，带盖，无菌（产品编号 #3596）</td><td>康宁生命科学</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>无定型胎牛血清，HI IR</td><td>Hyclone Labs</td><td>SH30070.03IH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 50:50 (1x) 不含谷氨酰胺</td><td>MediaTech, Inc.</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖无L-谷氨酰胺，含丙酮酸钠，1 L</td><td>Invitrogen</td><td>11960051</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Ham's F12 50:50 培养基，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10092CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Irvine Scientific</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠（1,000 U/mL）</td><td>美国制药</td><td>401811B</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant</td><td>Milteni Biotech Inc.</td><td>BIS013220&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1× 含 CA &amp;和 MG</td><td>Irvine Scientific</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>含1 mM EDTA的PBS（无Ca2+和Mg2+）</td><td>VWR 科学产品</td><td>PB15009A</td><td></td></tr><tr><td>重组人EGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>rhIL-15 工作稀释液（10 ng/&amp;micro;L</td><td>CellGenix，美国业务部</td><td>tF0297</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>41693700</td><td></td></tr><tr><td>TC-HEPES缓冲液（1 M）溶液 100 mL&amp;nbsp;</td><td>IRVINE SCIENTIFIC 公司</td><td>6472</td><td></td></tr><tr><td>Tecnol Procedure Mask</td><td>Kimberly-Clark</td><td>47117</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BW04-744Q</td><td></td></tr></tbody></table>

体外肿瘤细胞再攻击用于预测性评估嵌合抗原受体t细胞的抗肿瘤功能

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗领域正在快速发展，CAR设计、基因工程方法和生产工艺优化不断取得进步。然而，这些研发工作面临的一个挑战是建立可靠的体外检测方法，以有效筛选出在体内具有最佳治疗效果的CAR T细胞产品。传统的体外肿瘤细胞裂解实验由于共培养时间较短以及T细胞与肿瘤细胞比例较高，往往无法真实反映CAR T细胞的抗肿瘤潜力。本文介绍一种在高肿瘤细胞负荷条件下评估CAR T细胞重复杀伤能力的体外共培养方法。该方法通过在7天内持续观察CAR T细胞的长期细胞毒性和增殖能力，并每隔一天向共培养体系中补充新的肿瘤靶细胞。该检测可结合T细胞活化、耗竭及记忆表型的分析。利用该方法，我们成功区分了CD4+与CD8+ CAR T细胞在针对胶质母细胞瘤（GBM）细胞时的功能和表型差异，这些差异与其在原位异种移植模型中的体内抗肿瘤活性差异相一致。该方法为评估CAR T细胞效力以及阐明不同CAR T细胞产品之间的功能差异提供了一种简便有效的手段。

利用上述检测方法，我们区分了CD4+和CD8+ CAR T细胞介导的不同效应功能强度及杀伤动力学。本文展示的结果说明了来自健康供体的CD4+和CD8+ CAR T细胞之间的差异，这些细胞的制备独立于我们此前的发表21。
通过标准脱颗粒实验，我们观察到CD4+ 和 CD8+ CAR T细胞对表达靶向抗原的GBM细胞表现出同等程度的活化，这通过CD107a的表达及细胞内细胞因子的产生得以证实图2A）。然而，通过使用重复性肿瘤攻击实验，我们发现 CD4+ 但不包括 CD8+ CAR T细胞表现出多轮杀伤能力（图2B）。CD4+ CAR T 细胞在此项检测中也表现出优于 CD8+ 细胞的扩增能力图2C). 在经过两轮肿瘤攻击（1:12 E:T）后，从第3天（D3）开始观察到CAR T细胞亚群扩增能力的差异；而在经过三轮肿瘤攻击（1:20 E:T）后，从第5天（D5）开始观察到细胞毒性的差异，表明短期检测无法揭示不同CAR T细胞产品在效力上的差别。当CD4与CD8以1:1混合时+ 和 CD8+ CAR T 细胞被应用于该检测，结果发现其表现优于 CD8+ 但不包括 CD4+ 长期细胞毒性实验中的CAR T细胞（图2B）。CD8的扩增+ CAR T细胞通过联合应用CD4诱导+ 细胞，而CD4+ CD8存在时，CAR T细胞的扩增受到抑制+ 细胞 (图2C).
解释区分CD4效应活性的机制+ 和 CD8+ CAR T细胞，我们首先确认在初次共培养24小时后，CD4和CD8+ 和 CD8+ CAR T细胞的活化程度相当（图3A）。同时，根据 CD45RO 和 CD62L 的表达情况，CD4 细胞中+ 和 CD8+ CAR T细胞表现出从中央记忆型（CD45RO+CD62L+) 转化为效应记忆（CD45RO+CD62L-）表型在重复性肿瘤攻击期间的表现（图3B）。随后，我们在该实验的第3天（D3）对细胞进行了表征，此时间点早于CAR T细胞亚群开始表现出功能差异的阶段。T细胞耗竭以抑制性受体PD-1、LAG-3和TIM-3的共表达为标志。15,21，表明 CD8+ CAR T细胞相较于CD4更容易出现耗竭+ CAR T细胞（图3C。此外，在CD8上未观察到差异+ 共应用 CD4 存在/缺失条件下 CAR T 细胞的耗竭+ 细胞 (图3C)，表明CD4诱导的CD8+ CAR T细胞扩增与更强的效应功能无关。
综合本实验结果可知，CD4+ CAR T 细胞在长期细胞毒性方面表现优于 CD8+ 细胞。尽管在短期细胞毒性（重新攻击后1–3天）方面两者表现相似，但CD4+ CAR T 细胞在反复肿瘤攻击下仍能维持效应功能，而CD8+ 细胞则出现耗竭，无法控制肿瘤细胞的生长。当两种亚群混合时，CD4+ CAR T 细胞可促进CD8+ CAR T 细胞的扩增，但未能改善CD8+ 细胞的耗竭状态，因此两组之间未产生协同效应。此前已有研究报道，在体内模型中也观察到CD4+ 与CD8+ CAR T 细胞之间存在类似差异21。事实上，CD8+ CAR T 细胞虽可介导短期肿瘤清除，但随后出现抗原阳性复发；相比之下，CD4+ CAR T 细胞治疗可实现长期肿瘤根除21，这与其在体外反复攻击实验中表现出的重复杀伤潜能相一致。
<img alt="CAR T细胞共培养与分析时间线、流式细胞术图谱、活细胞数量图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：重复攻击实验的设计与分析策略。 （A）重复肿瘤攻击实验的设计与时间线。每个孔中，CAR T细胞首先与PBT030-2胶质母细胞瘤（GBM）细胞共培养（4,000个CAR+细胞，16,000个肿瘤细胞），之后每隔一天（第2、4、6天）重新加入32,000个肿瘤细胞进行再攻击。在第1、3、5、7天分别分析肿瘤细胞与CAR T细胞数量，以及CAR T细胞表型。（B）共培养开始前用于确定T细胞中CAR阳性比例的设门策略。（C）从重复攻击实验中对活细胞、肿瘤细胞和CAR T细胞进行设门的策略。（D）重复攻击实验中不同时间点的肿瘤细胞数量，与未转导T细胞共培养的结果。误差棒 = ±标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析示意图，CD4+ 和 CD8+ 细胞活性，CD107a，IFN-γ，扩增倍数结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：重复攻击实验揭示CD4+与CD8+ CAR T细胞在杀伤能力和增殖效力上的差异。（A）CD4+和CD8+ CAR T细胞与胶质母细胞瘤（GBM）细胞共培养5小时后（效靶比E:T=1:1）的脱颗粒及细胞内细胞因子染色结果。（B）将CD4+、CD8+或混合型（CD4:CD8=1:1）CAR T细胞用于重复攻击实验，并定量检测存活的肿瘤细胞。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，与CD4+组相比，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Bonferroni多重比较检验。（C）重复肿瘤攻击实验过程中CD4+和CD8+ CAR T细胞的扩增情况。比较内容从左至右依次为：CD4+ 与 CD8+，单一亚群间比较；CD4+ 与 CD8+，在“混合”组内的比较；CD4+，单一与混合组间的比较；CD8+，单一与混合组间的比较。*p &lt; 0.05，**p &lt; 0.01，***p &lt; 0.001，采用非配对Student's t 检验。误差线表示±标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CAR T细胞分析图表；流式细胞术、抑制性受体、CD4+、CD8+、PD1、LAG3、TIM3。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：重复刺激实验中T细胞表型的分析。 （A）实验第1天（D1）CAR T细胞上4-1BB和CD69的染色情况。（B）在进行再刺激实验前（输入样本）、实验第3天（D3）和第7天（D7）CAR T细胞上CD45RO和CD62L的染色情况。（C）实验第3天（D3）CAR T细胞上PD-1、LAG-3和TIM-3的共表达情况。（上图）用于鉴定表达1种、2种或3种抑制性受体的T细胞的设门策略。（下图）CD4+细胞（单一亚群）、CD8+细胞（单一亚群）以及CD8+细胞（“混合”组内）之间的比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CD4+/CD8+ CAR 分析的静态平衡示意图；研究方法。" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="表 1"> 
表 1：再刺激实验设置的代表性孔板布局图。

本文介绍了一种体外共培养方法，用于反复刺激靶向肿瘤的T细胞，从而实现对T细胞抗肿瘤活性的表型和功能分析。

体外肿瘤细胞再攻击用于预测性评估嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤功能

嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗领域正在迅速发展，其进展体现在CAR设计、基因工程方法以及……

本方案提供了一种长期、体外的功能性方法，通过反复的肿瘤细胞攻击来评估嵌合抗原受体（CAR）T细胞。与体内评估CAR T细胞功能的方法相比，该技术耗时更短、劳动强度更低，同时仍能准确反映CAR T细胞真实的抗肿瘤效果。这种体外技术可实现对CAR T细胞抗肿瘤效力的高通量筛选与区分。这有可能用于评估CAR T细胞产品的临床有效性。首先，用1毫升冷的Accutase溶液和30至60秒的吹打，从胶质母细胞瘤肿瘤球培养物中解离胶质母细胞瘤肿瘤球。当肿瘤球被充分解离后，加入五毫升预热的共培养基终止反应。通过离心收集肿瘤细胞悬液。将胶质母细胞瘤细胞重悬于新鲜共培养基中，调整细胞浓度至每毫升含1.6 × 10⁵个肿瘤细胞，并将从CAR T细胞培养物中收获的T细胞稀释至每毫升共培养基中含有适当比例的CAR阳性T细胞。接下来，将100 µL稀释后的肿瘤细胞加入96孔平底组织培养板的每孔中。再向每孔肿瘤细胞中加入100 µL CAR T细胞，并轻轻混匀。然后将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。在培养的第2、4、6天，根据表格，从肿瘤细胞与T细胞共培养板中计划进行再次刺激的每个孔中，小心移除50 µL培养基。随后，加入50 µL新鲜的胶质母细胞瘤细胞悬液（制备方法如前所述），细胞数量为初始共培养时的两倍，加样后轻轻混匀。然后将培养板放回细胞培养箱中继续培养。共培养的第1、3、5和7天，根据表格将每孔的上清液转移至新的96孔圆底板中用于收集，并向每孔中已去除培养基的孔加入50 µL预热的0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液。在37°C孵育5分钟后，通过光学显微镜确认细胞已从各孔底部脱落，并轻轻吹打每孔底部，使酶溶液充分重悬细胞。随后将脱落的细胞悬液转移至新的96孔板中对应的相应孔内。通过离心沉淀细胞，并用 200 微升荧光激活细胞分选缓冲液（FSS）洗涤每孔细胞，再次离心。将细胞沉淀重悬于 100 微升含有所需抗体混合物的 100 微升 SSS 中，每孔孵育 30 分钟，温度为 4 摄氏度。孵育结束后，依次使用 100 微升和 200 微升 FSS 洗涤，去除未结合的抗体，然后将细胞重悬于 100 至 200 微升含 DAPI 核染色剂的 FSS 中。然后，根据标准的流式细胞术分析方案对细胞进行分析。在CAR T细胞与肿瘤细胞共培养后，如需进行功能和表型分析，需从流式细胞仪中调取数据文件，并圈选所有活的DAPI阴性细胞。为定量分析肿瘤细胞，需圈选CD45阴性细胞群。为了定量CAR T细胞，圈定CD45阳性且CAR阳性的细胞群体。随后绘制实验时间过程中肿瘤细胞和CAR T细胞的数量变化，通过41BB和CD69的共表达来识别T细胞的活化状态，通过PD1、LAG3和TIM3的表达来评估T细胞耗竭状态，并通过CD45RO和CD62配体的表达来判断T细胞的记忆状态。通过CD45RO和CD62配体表达进行鉴定。CD4阳性与CD8阳性的CAR T细胞在针对表达靶抗原的胶质母细胞瘤细胞时，均表现出相当的活化水平，这由其CD107a表达及细胞内细胞因子表达所证实。然而，通过反复肿瘤攻击实验（SA）评估发现，CD4阳性的CAR T细胞能够进行多轮杀伤，而CD8阳性的CAR T细胞则不具备该能力。CD4阳性CAR T细胞还能实现更显著的扩增。当CD4阳性与CD8阳性CAR T细胞以1:1比例混合时，该细胞组合在长期细胞毒性方面优于CD8阳性CAR T细胞，但不及CD4阳性CAR T细胞。此外，CD8阳性CAR T细胞的扩增可由CD4阳性T细胞的加入而诱导。尽管在CDa阳性细胞存在的情况下，CD4阳性CAR T细胞的扩增受到抑制，但在初次共培养24小时后，CD4阳性与CD8阳性CAR T细胞均表现出相似的活化水平。在反复的肿瘤刺激过程中，CD4阳性和CD8阳性CAR T细胞均呈现出从CD45RO阳性、CD62配体阳性中枢记忆表型向CD45RO阳性、CD62配体阴性效应记忆表型的转变。与CD4阳性CAR T细胞相比，CD8阳性CAR T细胞在共培养三天后通过PD1、LAG3和TIM3的表达评估显示更容易发生耗竭。此外，在有或无CD4阳性T细胞存在的情况下，CD8阳性CAR T细胞的耗竭程度未观察到差异，表明CD4介导的CD8阳性CAR T细胞扩增与更优的效应功能无关。该实验还可结合从共培养体系中分选T细胞，以进一步对转录组、蛋白质组及特定目的基因进行分析。这种重复的肿瘤攻击模型也可作为研究CAR T细胞识别肿瘤后生物学事件的平台。

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