体外肿瘤细胞再攻击用于预测性评估嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤功能

本方案提供了一种长期、体外的功能性方法，通过反复的肿瘤细胞攻击来评估嵌合抗原受体（CAR）T细胞。与体内评估CAR T细胞功能的方法相比，该技术耗时更短、劳动强度更低，同时仍能准确反映CAR T细胞真实的抗肿瘤效果。这种体外技术可实现对CAR T细胞抗肿瘤效力的高通量筛选与区分。

这有可能用于评估CAR T细胞产品的临床有效性。首先，用1毫升冷的Accutase溶液和30至60秒的吹打，从胶质母细胞瘤肿瘤球培养物中解离胶质母细胞瘤肿瘤球。

当肿瘤球被充分解离后，加入五毫升预热的共培养基终止反应。通过离心收集肿瘤细胞悬液。将胶质母细胞瘤细胞重悬于新鲜共培养基中，调整细胞浓度至每毫升含1.6 × 10⁵个肿瘤细胞，并将从CAR T细胞培养物中收获的T细胞稀释至每毫升共培养基中含有适当比例的CAR阳性T细胞。

接下来，将100 µL稀释后的肿瘤细胞加入96孔平底组织培养板的每孔中。再向每孔肿瘤细胞中加入100 µL CAR T细胞，并轻轻混匀。然后将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。

在培养的第2、4、6天，根据表格，从肿瘤细胞与T细胞共培养板中计划进行再次刺激的每个孔中，小心移除50 µL培养基。随后，加入50 µL新鲜的胶质母细胞瘤细胞悬液（制备方法如前所述），细胞数量为初始共培养时的两倍，加样后轻轻混匀。然后将培养板放回细胞培养箱中继续培养。

共培养的第1、3、5和7天，根据表格将每孔的上清液转移至新的96孔圆底板中用于收集，并向每孔中已去除培养基的孔加入50 µL预热的0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液。在37°C孵育5分钟后，通过光学显微镜确认细胞已从各孔底部脱落，并轻轻吹打每孔底部，使酶溶液充分重悬细胞。随后将脱落的细胞悬液转移至新的96孔板中对应的相应孔内。

通过离心沉淀细胞，并用 200 微升荧光激活细胞分选缓冲液（FSS）洗涤每孔细胞，再次离心。将细胞沉淀重悬于 100 微升含有所需抗体混合物的 100 微升 SSS 中，每孔孵育 30 分钟，温度为 4 摄氏度。孵育结束后，依次使用 100 微升和 200 微升 FSS 洗涤，去除未结合的抗体，然后将细胞重悬于 100 至 200 微升含 DAPI 核染色剂的 FSS 中。

然后，根据标准的流式细胞术分析方案对细胞进行分析。在CAR T细胞与肿瘤细胞共培养后，如需进行功能和表型分析，需从流式细胞仪中调取数据文件，并圈选所有活的DAPI阴性细胞。为定量分析肿瘤细胞，需圈选CD45阴性细胞群。

为了定量CAR T细胞，圈定CD45阳性且CAR阳性的细胞群体。随后绘制实验时间过程中肿瘤细胞和CAR T细胞的数量变化，通过41BB和CD69的共表达来识别T细胞的活化状态，通过PD1、LAG3和TIM3的表达来评估T细胞耗竭状态，并通过CD45RO和CD62配体的表达来判断T细胞的记忆状态。

通过CD45RO和CD62配体表达进行鉴定。CD4阳性与CD8阳性的CAR T细胞在针对表达靶抗原的胶质母细胞瘤细胞时，均表现出相当的活化水平，这由其CD107a表达及细胞内细胞因子表达所证实。然而，通过反复肿瘤攻击实验（SA）评估发现，CD4阳性的CAR T细胞能够进行多轮杀伤，而CD8阳性的CAR T细胞则不具备该能力。

CD4阳性CAR T细胞还能实现更显著的扩增。当CD4阳性与CD8阳性CAR T细胞以1:1比例混合时，该细胞组合在长期细胞毒性方面优于CD8阳性CAR T细胞，但不及CD4阳性CAR T细胞。此外，CD8阳性CAR T细胞的扩增可由CD4阳性T细胞的加入而诱导。

尽管在CDa阳性细胞存在的情况下，CD4阳性CAR T细胞的扩增受到抑制，但在初次共培养24小时后，CD4阳性与CD8阳性CAR T细胞均表现出相似的活化水平。在反复的肿瘤刺激过程中，CD4阳性和CD8阳性CAR T细胞均呈现出从CD45RO阳性、CD62配体阳性中枢记忆表型向CD45RO阳性、CD62配体阴性效应记忆表型的转变。

与CD4阳性CAR T细胞相比，CD8阳性CAR T细胞在共培养三天后通过PD1、LAG3和TIM3的表达评估显示更容易发生耗竭。此外，在有或无CD4阳性T细胞存在的情况下，CD8阳性CAR T细胞的耗竭程度未观察到差异，表明CD4介导的CD8阳性CAR T细胞扩增与更优的效应功能无关。该实验还可结合从共培养体系中分选T细胞，以进一步对转录组、蛋白质组及特定目的基因进行分析。

这种重复的肿瘤攻击模型也可作为研究CAR T细胞识别肿瘤后生物学事件的平台。