Name: 脑肿瘤细胞行为的纵向生命成像,以响应侵入性手术活检 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 了解高分辨率双光子时间推移成像技术，用于研究活体小鼠脑肿瘤细胞在侵入性手术前后的迁移、侵袭和增殖行为变化。该方法为肿瘤生物学和治疗反应研究提供了重要的纵向观察数据。

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作者感谢 Anko de Graaff 和 Hubrecht 成像中心提供的成像支持，以及 Ellen Wehrens 和 Hannah Johnson 对手稿的校对和编辑工作。

所有实验均按照荷兰皇家艺术与科学学院动物福利委员会的指南进行。本手稿中使用的实验方案已获得荷兰中央动物实验委员会（Centrale Commissie Dierproeven，CCD）和动物福利机构（Instantie voor Dierenwelzijn，IvD）的批准。
1. 肿瘤细胞植入与颅窗成像准备
<ol>
	<li>手术准备
	<ol>
		<li>使用任何品系或性别的成年小鼠（&#62;6周龄）。通过注射（氟阿尼酮[神经安定剂] + 芬太尼[阿片类]）(0.4 mL/kg) 与苯二氮䓬类镇静剂（2 mg/kg）按1:1:2比例溶于无菌水中进行镇静。通过夹趾反应评估动物的镇静状态。 
		注：在本实验方案中，由于所用肿瘤细胞系（GL261）具有相同的遗传背景，因此同时使用了雌性和雄性C57BL/6小鼠。小鼠将保持完全镇静约1.5小时。也可使用吸入麻醉，例如异氟烷（1.5%–2%异氟烷/O2混合气体）。</li>
		<li>将小鼠固定于立体定位仪上，并使用鼻夹和两个耳杆固定头部。</li>
		<li>使用加热灯维持小鼠体温。&#160;使用加热灯时应谨慎，也可选择循环水加热垫。</li>
		<li>涂抹眼膏以防止小鼠角膜干燥。</li>
		<li>使用锋利剪刀剃除颅骨表面的毛发（从眼睛至颅底的背侧区域），并用70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。&#160;</li>
		<li>用锋利剪刀环形切开皮肤，并用棉签刮除下方的骨膜。局部滴加1%利多卡因+1:100,000肾上腺素溶液，作用5分钟，随后用棉签去除多余液体。</li>
		<li>使用氰基丙烯酸酯胶水将皮肤边缘粘附于颅骨上。</li>
		<li>将立体定位仪置于解剖显微镜下，设置4倍放大倍率。</li>
		<li>通过解剖显微镜观察颅骨，在右侧顶骨区域钻出一个直径为5 mm的环形凹槽。操作时需格外小心，仅进行浅层处理，避免对颅骨施加压力。</li>
		<li>滴加一滴皮质缓冲液（125 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES缓冲液、2 mM MgSO4和2 mM CaCl2 [pH 7.4]），然后用细镊子轻轻抬起骨瓣。</li>
		<li>在后续步骤中，除非另有说明，应始终保持脑表面覆盖皮质缓冲液。</li>
		<li>在解剖显微镜下观察脑表面，使用弯曲、锥形、极细尖头镊子去除硬脑膜。若此阶段发生出血，可使用可吸收明胶海绵止血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤细胞注射
	<ol>
		<li>将所需数量的荧光标记肿瘤细胞重悬于约3 μL PBS中（例如，在本方案所示实验中，注射了1 × 105个GL261细胞）。 
		注：虽然可使用任何荧光标记，但强烈建议使用核定位标记，以便在分析过程中追踪单个肿瘤细胞。此外，可使用组蛋白连接的荧光标记（如H2B），以观察染色体凝集情况，从而监测细胞分裂。使用光可转换标记（如Dendra2），可在数天内对肿瘤细胞进行光标记并追踪4,13。</li>
		<li>将肿瘤细胞悬液装入带有2号针头的10 μL气密注射器，并将其固定在立体定位操作臂上。</li>
		<li>去除皮质缓冲液。将注射器尖端置于颅骨开窗中央，插入深度为距颅骨表面0.5 mm。可选操作：在脑组织内创建微小空间以容纳肿瘤细胞悬液。具体方法为：先将注射器插入至1 mm深度，再回撤至距表面0.5 mm处，然后进行注射。</li>
		<li>滴加一滴皮质缓冲液。</li>
		<li>使用微量注射泵缓慢注入细胞悬液（250–400 nL/min）。注射完成后拔出注射器，必要时使用可吸收明胶海绵止血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颅窗成像准备
	<ol>
		<li>去除皮质缓冲液，并在颅骨开窗处滴加一滴硅油，以避免成像窗口下方产生气泡。</li>
		<li>用6 mm盖玻片密封暴露的脑组织。在盖玻片与颅骨之间涂抹氰基丙烯酸酯胶水。借助细镊子轻压盖玻片，使其紧贴颅骨，确保脑组织与盖玻片之间的距离最小化。</li>
		<li>在颅骨表面涂布牙科丙烯酸树脂水泥，覆盖盖玻片边缘。在颅骨开窗周围放置一个薄壁不锈钢环（外径1.5 mm，内径1 mm），待牙科水泥干燥。可选操作：可在边缘添加少量胶水，以进一步固定头部的金属环。 
		注：该头部固定系统适用于倒置显微镜成像：成像盒中嵌入的小磁铁有助于颅窗（CIW）的固定。在本方案所示实验中使用了倒置显微镜。对于直立式显微镜，可通过带凹槽的固定杆或环实现固定，该装置可通过螺丝或适配环的平板连接至显微镜。</li>
		<li>为缓解疼痛，皮下注射单剂量100 μg/kg的丁丙诺啡，并将动物置于加热垫上恢复。</li>
		<li>将小鼠单独饲养于笼中，并提供碎纸作为环境丰富材料。在术后最初几天内每日密切观察，之后每周观察两次，重点关注其行为、反应性和外观是否正常。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 活体成像
注意：肿瘤细胞注射与首次活体成像之间的时间间隔取决于所使用的肿瘤细胞系类型。在本方案所示实验中，注射 1×105 个 GL261 细胞，并在 10 天后进行成像。
<ol>
	<li>成像准备
	<ol>
		<li>通过面罩吸入麻醉剂（1.5%–2% 异氟烷/O2 混合气体）对小鼠进行镇静。</li>
		<li>皮下注射 100 µL 生理盐水以防止脱水。 
		注意：对于长期成像，可通过皮下输液泵为小鼠补充水分。</li>
		<li>将小鼠仰卧放置于成像盒中。使用带有直径 1 mm 孔洞且在孔周围嵌入小磁铁的金属板，将颅窗（CIW）固定至成像盒。通过面罩引入异氟烷，并通过盒子另一侧的出口进行通风（0.8%–1.5% 异氟烷/O2 混合气体）。可选地，使用胶带固定小鼠身体。 
		注意：此时可静脉注射用于血管可视化或其他用途的荧光标记葡聚糖或其他染料。</li>
		<li>可选地，使用脉搏血氧仪和加热探头监测小鼠生命体征。 
		注意：本实验中无需使用脉搏血氧仪和加热探头，因为在整个成像期间（2–3 小时）小鼠状态稳定。但对于更长时间的成像，可能需要更全面的监测。</li>
		<li>将 25 倍水镜（例如 HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm）调至最低 z 位置，并滴加一大滴水。 
		注意：对于长期实验，强烈建议使用水浸式微量加样器，因为它允许在实验过程中添加水。也可选用干镜。</li>
		<li>将成像盒转移至配备黑暗气候室的显微镜上，气候室温度维持在 37 °C。移动物镜接近颅窗盖玻片，直至水滴接触盖玻片。</li>
		<li>使用落射荧光模式，通过目镜观察肿瘤，并将细胞调至清晰对焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>延时图像采集
	<ol>
		<li>选择多个感兴趣的成像位置，并在软件中记录其坐标。确保所选位置能代表肿瘤不同区域的典型部位（每个肿瘤可能不同，但为保证一致性，应在所有小鼠中选择相同数量的位于肿瘤核心及边缘的成像点）。 
		注意：可对肿瘤部分区域或整个可见肿瘤进行拼接扫描；但如果肿瘤较大，该方法会增加图像间的延时间隔。此外，若肿瘤细胞移动较快，可能难以在长时间内追踪同一细胞群。</li>
		<li>切换至多光子模式，并将激光调至合适的波长。注意，为避免光损伤，应优先选用较长波长。 
		注意：在 Dendra2 成像中使用了 960 nm 波长。结合本实验所用物镜，1.3 倍缩放即可获得良好的肿瘤细胞核分辨率，并扫描具有代表性的肿瘤区域。</li>
		<li>进入实时成像模式，为每个位置定义 z 轴层扫范围，以在不牺牲肿瘤细胞分辨率的前提下获取最大体积的肿瘤细胞图像。设定图像间步进距离为 3 µm。</li>
		<li>使用双向扫描模式以提高扫描速度。图像分辨率应至少达到 512 × 512 像素。</li>
		<li>每 20 分钟对不同位置的肿瘤体积进行一次图像采集，持续 2 小时。每次图像采集前向物镜添加水。 
		注意：可通过软件设置正确的延时参数实现自动图像采集。然而，小鼠可能发生移动，导致成像位置或 z 层扫随时间偏移，造成数据丢失。因此，建议手动执行延时成像，并在每次采集之间检查和校正 xyz 方向的位移。</li>
		<li>在此步骤中，可选地对 Dendra2 荧光标记进行光转换。 
		注意：与延时成像（可用于研究单个肿瘤细胞特性及其随时间的变化）不同，此操作可用于研究数天内肿瘤细胞在脑组织中的浸润范围4。Gligorijevic 等人13对此步骤有详细说明。</li>
		<li>完成最后一次图像采集后，将小鼠从显微镜载物台上移除，并置于加热垫上使其恢复。为防止脱水，可皮下注射 100 µL 生理盐水。将小鼠放回笼中，直至进行类似活检的取材操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 活检样损伤与CIW置换
<ol>
	<li>在首次成像后的第1天，在肿瘤部位制造一个类似活检的损伤。 
	注意：也可采用其他操作，例如部分切除肿瘤。
	<ol>
		<li>使用异氟烷吸入麻醉剂对小鼠进行麻醉，操作方法如步骤2.1.1中所述。 
		注意：虽然可以使用注射麻醉剂，但该操作比CIW植入术更短，而吸入麻醉可更精确地控制并缩短小鼠的麻醉时间。</li>
		<li>将小鼠固定于立体定位仪上，用两个耳杆和一个鼻夹固定其头部。通过检查足底反射是否消失来确认麻醉深度。在手术过程中使用立体定位手术麻醉面罩以维持小鼠的麻醉状态。</li>
		<li>将棉签浸入丙酮，在盖玻片边缘周围涂抹，以软化将盖玻片粘附于脑组织的胶水。</li>
		<li>将细尖镊子插入盖玻片下方并轻轻抬起。若盖玻片在此过程中破裂，使用镊子将玻璃碎片取出。</li>
		<li>滴加皮层缓冲液以保持脑组织湿润。</li>
		<li>将25 G针头插入肿瘤内，深度达1 mm。必要时，使用无菌明胶海绵压迫止血。 
		注意：此步骤可在荧光体视显微镜下进行，以便更准确地识别肿瘤区域（当肿瘤过小时尤为适用）。此外，可在穿刺时注入1 µL浓度为1 µm的荧光聚苯乙烯微球溶液，以标记活检区域。</li>
		<li>用硅油封闭脑表面，并在其上方用胶水粘附一个直径6 mm的盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 重复成像
<ol>
	<li>在造成活检样损伤后一天（如需要，可连续多天重复），按照上述第2步所述方法重复进行活体成像，以评估肿瘤细胞行为随时间的变化。选择肿瘤的多个位置，以代表整个肿瘤区域。 
	注意：如果使用了荧光微球来识别活检区域，请定位这些微球，以便比较活检区域与非活检区域中肿瘤细胞的行为。</li>
</ol>
5. 图像分析
<ol>
	<li>如果延时图像为手动采集，请将其合并到一个文件夹中。
	<ol>
		<li>在与显微镜配套的商业软件（例如 LasX 或 LAS AF）中打开延时 LIF 文件。选择标签页 Process &#62; Process Tools &#62; Merge。选择时间序列的第一幅图像，点击 First；选择时间序列的第二幅图像，点击 Second。在 Merge Dimensions 中选择 t 表示时间维度。点击 Apply，将生成一个包含两个时间点的新文件。对所有时间点重复此过程，每次均将新生成的文件作为序列中的第一幅图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对采集的 z-层图像进行 xyz 位移校正。 
	注：本实验方案中所描述的实验使用了自行设计的 Visual Basic 软件程序进行校正。也可使用其他可用软件，例如 ImageJ 或 Imaris。
	<ol>
		<li>通过右键单击合并后的延时文件导出 TIFF 文件，选择 Save RAW Data。导出的文件将保存至一个以通道、时间和 z 位置命名的文件夹中。</li>
		<li>在自行设计的 Visual Basic 软件程序中打开这些 TIFF 文件。</li>
		<li>定义时间点数量、z-层堆栈数和通道数。</li>
		<li>根据各通道出现的顺序为其分配颜色。</li>
		<li>在 Form Show 面板中，针对每个时间点，通过点击向上（U）或向下（D）按钮来校正 z 方向的位移。</li>
		<li>在 Intravital image building 面板中，选择用于校正 xy 位移的通道。根据肿瘤细胞信号选择绿色通道进行校正，然后点击 Automatic 以执行 xy 校正。</li>
		<li>将校正后的图像导出为连续三个 z-层的最大投影图像。在 Selection 面板中输入要导出的第一个（Begin）和最后一个（End）z 层编号，选择 Max，并勾选 Separate folders for Z，然后点击 Do。每组三个 z-层的延时图像将被分别导出到独立的文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选步骤：对组织弹性形变进行校正。 
	注：对于组织弹性形变实验，使用了匹配运动补偿软件程序来校正刚性和弹性组织形变14。</li>
	<li>在延时视频的完整 z-层堆栈中追踪单个细胞。 
	注：可使用 ImageJ 插件（如 MTrackJ）手动追踪肿瘤细胞。虽然该方法准确，但仅限于 xy 平面，且耗时较长。另一种方法是使用肿瘤细胞分割技术（例如 Imaris 软件）在整个 z 体积范围内自动追踪肿瘤细胞。然而，在高度密集的肿瘤中，自动追踪的准确性较低，可能产生更多的追踪错误。
	<ol>
		<li>分别打开并追踪每组延时序列（针对连续三个 z-层）。将包含延时图像的文件夹拖拽至 ImageJ 中。</li>
		<li>选择标签页 Plugins &#62; Tracking &#62; MtrackJ。通过选择 Add 并在每个时间点点击各个细胞，逐个追踪单个细胞。</li>
		<li>点击 Measure 提取轨迹数据，并保存文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在活体动物脑内研究肿瘤细胞在单细胞水平上对侵入性外科手术（如活检）产生反应时行为变化的方法。通过将纵向多光子成像与慢性颅窗（chronic CIW）的外科植入相结合，可在同一动物体内定量分析活检前后肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖情况4。与其他用于肿瘤多日监测的技术（如生物发光成像12、MRI10或PET/CT11）相比，该方法能够以单细胞分辨率对肿瘤进行可视化，从而揭示肿瘤进展过程中细胞行为的动态变化。
要成功实施本方法，需掌握若干操作步骤。本方案中最关键的步骤是颅窗（CIW）的植入与更换。这些步骤技术上较为复杂，需要精确性和手术技巧，可通过持续训练获得。在CIW手术过程中可能出现并发症，例如出血覆盖脑表面，这将给后续成像带来困难。缺乏无菌器械或无菌环境，以及未能完全封闭脑表面，可能导致脑表面感染（盖玻片下出现白色液体），从而影响成像效果，并严重干扰结果的解读。本方案另一个常见问题是延时成像期间动物发生移动。尽管实验后可通过软件校正任何xyz方向的位移，但仍建议在每个时间点成像前校正各位置坐标，以避免信息丢失。在倒置显微镜上成像时，组织形变是另一个常见问题。当小鼠处于仰卧位时，脑组织会受到压迫而发生形变。根据组织形变程度的不同，肿瘤细胞追踪可能导致细胞位移量的错误量化。为避免此问题，可使用针对刚性和弹性形变的校正软件14。
尽管该方法在研究肿瘤行为变化方面具有广泛的应用前景，但仍需考虑某些局限性。该方法允许科学家进行成像的最大深度为1.6 mm（使用光学参量振荡器时）；然而，这意味着成像仅限于大脑皮层的浅表区域15。因此，位于深部脑结构中的一些脑肿瘤，包括位于脑干区域的弥漫性内生性桥脑胶质瘤，无法利用本方案在其原始脑环境中进行研究。本方案的另一个局限性是可成像的肿瘤体积。尽管理想情况下应扫描整个肿瘤体积以获取最大信息量，但肿瘤大小和细胞迁移速度常常成为限制因素。对于每种肿瘤类型，都需要确定最佳的成像时间间隔。如果图像之间的时间间隔过长，则可能难以追踪肿瘤细胞。使用共振扫描器可显著缩短扫描时间，从而实现对较大肿瘤的成像16。最后，本方案的手动图像分析可能非常耗时，因此可改用自动化三维追踪程序。然而，追踪结果必须始终进行视觉监督，因为自动化细胞追踪算法很少能够精确再现目标细胞的实际迁移过程。
对本方案进行轻微调整后，可进一步拓展其应用范围。除活检外，还可实施其他（外科）干预措施，例如部分肿瘤切除或植入化疗药片。通过手术植入的微管递送化合物，可与本方案结合使用，以实现对特定目标分子的药理学干预。我们预计，该模型将有助于研究特定干预措施对肿瘤细胞行为的影响。在同一只动物体内进行多次测量，不仅能够更准确地获取肿瘤变化的数据，还可显著减少每项研究所需的实验动物数量。

大多数实体瘤的标准诊疗方案包括通过组织活检进行诊断、预后评估以及制定个体化治疗方案1,2。总体而言，这些操作具有临床获益，但近期证据表明，活检及其他更具侵入性的操作（如肿瘤切除术）也可能对肿瘤进展产生不利影响3,4,5,6。尽管这些操作在患者诊疗中仍不可或缺，且其益处远大于潜在风险，但为了最大限度地保障患者安全，增强这些操作的积极效应，并进一步提升其临床价值，有必要全面了解这些不利影响背后的机制。
活检引起的对肿瘤进展的不良影响是由组织损伤后引发的全身性改变及肿瘤微环境变化所触发的4,5。因此，有必要在活体动物中研究这一过程。然而，这些微创操作的细微后果常常被个体间的较大差异所掩盖。基于免疫组织化学或转录表达分析的传统方法可能忽略这些影响，或需要大量动物才能识别出此类效应。此外，这些静态方法无法检测肿瘤细胞行为的变化，例如迁移和侵袭——这些动态过程与肿瘤恶性程度密切相关。对于胶质母细胞瘤（GBM）等高度侵袭性的脑肿瘤而言，肿瘤细胞的这些特性尤为重要，因为肿瘤细胞的局部扩散会限制手术切除并降低患者生存率7。为了全面理解活检如何影响GBM细胞的行为，需要采用一种纵向研究方法，能够在活体生物的生理环境中实现对这些细胞的可视化观察。
近期，高分辨率活体成像技术与外科植入的慢性成像窗口相结合的发展，使科学家能够在活体小鼠中连续多天观察肿瘤细胞的动态行为8,9。利用这一强大方法，我们可以在同一只小鼠中研究肿瘤细胞在经历活检后，其增殖、迁移和浸润行为在数天内的变化。与其他可在活体小鼠中实现多日肿瘤监测的技术（如磁共振成像（MRI）10、正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）11或生物发光成像12）相比，该方法独特地提供了在单细胞水平上研究肿瘤细胞行为的能力，并揭示肿瘤内部发生的细微变化。
本文介绍了一种对荷瘤小鼠脑部进行类似活检损伤以及活体状态下活检前后纵向成像的详细方法。该方法有望应用于研究其他外科干预手段，例如部分肿瘤切除或化疗药片的植入。

<table><tbody><tr><td>25g × 16 mm 皮下注射针头</td><td>BD Microlance</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>701 RN 10 µL 无针筒注射器</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>可吸收明胶海绵</td><td>Pfizer</td><td>Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片，直径 6 mm</td><td>VWR international</td><td>631-0168</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Pattex</td><td>Pattex Ultra gel</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>Vertex Dental</td><td>Vertex Self-Curing</td><td></td></tr><tr><td>钻孔机</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000（使用牙科钻可能更方便）+ 105 雕刻刀头</td><td></td></tr><tr><td>精细弯头镊子</td><td>Dumont</td><td>AGT508</td><td></td></tr><tr><td>芬太尼-氟哌利多合剂（Hypnorm）</td><td>VetaPharma Ltd</td><td>Hypnorm（柠檬酸芬太尼 0.315 mg/mL + 氟哌利多 10 mg/mL）</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Actavis</td><td>Midazolam Actavis 5 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>眼用软膏</td><td>Kela Veterinaria</td><td>Duodrops veter kela 10 m</td><td></td></tr><tr><td>精准立体定位注射仪（QSI）</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>硅油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181838</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪框架</td><td>Stoelting</td><td>Lab standard stereotaxic, rat and mouse</td><td></td></tr><tr><td>手术用体视显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡（Temgesic，0.3 mg/mL）</td><td>BD Pharmaceuticals</td><td>283732</td><td></td></tr><tr><td>Vannas T&amp;uuml;bingen 弹簧剪</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8508</td><td></td></tr><tr><td>利多卡因肾上腺素局部麻醉剂（Xylocaine，1% 利多卡因 + 1:100,000 肾上腺素）</td><td>Astrazeneca</td><td>Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000)</td><td></td></tr></tbody></table>

对侵入性手术活检后脑肿瘤细胞行为的纵向活体成像

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

活检是癌症治疗的标准护理手段，在临床上具有重要意义，因其能够实现实体瘤的诊断、预后评估以及个体化治疗方案的制定。然而，活检及其他侵入性操作对肿瘤结构的扰动可能对肿瘤进展产生不良影响，这些影响需要深入研究，以进一步提高这些操作的临床获益。传统的静态研究方法仅能提供肿瘤的某一时刻快照，在揭示活检对肿瘤细胞行为（如迁移）影响方面存在局限，而细胞迁移与肿瘤恶性程度密切相关。尤其在高度侵袭性的脑肿瘤中，肿瘤细胞的迁移是导致局部扩散的关键因素，使得完全切除肿瘤几乎不可能。多光子成像技术与慢性成像窗的发展使科学家能够在活体动物中长期动态观察这一过程。本文描述了一种在同一活体动物中对脑肿瘤细胞进行活检前后高分辨率纵向成像的方法。该方法使得研究该操作对肿瘤细胞行为（迁移、侵袭和增殖）的影响成为可能。此外，我们还讨论了该技术的优势与局限性，以及该方法学用于研究其他外科干预措施（包括肿瘤切除或化疗药片植入）对癌细胞行为改变的能力。

为评估活检对脑肿瘤细胞行为的影响，我们实施了本方案中所述的操作。将表达核荧光蛋白（H2B-Dendra2）的胶质瘤GL261细胞注射至C57BL/6小鼠脑内，并植入慢性颅窗（CIW）。在同一只动物中，对肿瘤进行类似活检的损伤前后，分别进行延时活体成像（图1A，B）。通过在不同条件下随时间追踪单个肿瘤细胞的迁移路径，确定其迁移行为。 xy 平面的 z-堆叠（图1C) 并以前后活检迁移细胞的百分比表示（图1F). 根据有丝分裂过程中H2B标记的Dendra2蛋白的凝聚情况，对肿瘤细胞增殖率进行定量分析（图1D) 并绘制为活检前和活检后分裂细胞的百分比（图1E）。我们比较了同一肿瘤在活检前后迁移速度的分布，发现迁移细胞的数量（速度 &gt; 4 µm/h) 在干预后增加，同时伴随慢速/非迁移细胞数量的减少（速度 &lt; 4 µm/h) (图 2A）。与未进行活检的对照小鼠相比，每个肿瘤中在发生类似活检损伤的情况下，迁移细胞的比例平均增加了1.75倍（标准差 = 0.16）。图2B）。我们对肿瘤细胞行为继续监测了一周，发现尽管在对照组小鼠和活检组小鼠中，迁移性肿瘤细胞的比例最终均有所下降，但活检组小鼠仍表现出高于对照组小鼠的迁移能力（图 2C）。对肿瘤细胞增殖行为的时序分析显示，与未活检的对照小鼠相比，活检后有丝分裂事件的数量增加了1.52倍（标准差 = 0.26）。图 2D).
为了验证活检对肿瘤细胞增殖和迁移行为的影响是否源于CIW置换手术（进行类似活检的损伤所必需的操作）这一人为因素，我们监测了一组仅接受CIW置换但未进行活检的小鼠中肿瘤细胞的行为。在该组小鼠中，我们未观察到肿瘤细胞的迁移或增殖被诱导，表明肿瘤细胞增殖和迁移速率的升高是由类似活检的损伤特异性触发的（图3A，B）。
荧光蛋白 Dendra2 具有稳定的光转化特性，可用于研究肿瘤细胞在数天内的浸润过程。当暴露于紫外/蓝光时，Dendra2 会不可逆地由绿色转变为红色。利用这一特性，我们对肿瘤的一个方形区域进行照射，在活检前对约 200 个表达 Dendra2 的肿瘤细胞进行光标记（图 4）。活检后一天，我们重新定位了发生光转化的区域，并测量了浸润到周围肿瘤组织中的肿瘤细胞体积。我们发现，与未进行活检的对照肿瘤相比，经历类似活检损伤后的肿瘤其浸润区域增大了 1.72 倍（标准差 SD = 0.41）（图 4）。尽管该方法仅能提供关于肿瘤细胞群体浸润行为的信息，而无法达到单细胞水平的分析，但其比延时成像方法更节省时间，对于仅关注浸润行为研究的科学问题而言，可能是更合适的选择。
<img alt="小鼠活体成像；肿瘤细胞追踪；延时显微成像；活检效应；细胞迁移。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：活检对肿瘤细胞行为影响的纵向活体成像实验装置。（A）显示环状结构及磁性固定装置设计的示意图。（B）实验流程的示意图。将肿瘤细胞注射至小鼠脑内，并建立颅窗（CIW）。待肿瘤形成后，进行第一次（活检前）延时成像。次日，实施活检并更换颅窗。活检后次日，进行第二次延时成像。为研究长期效应，可进行后续多次成像。（C）图像展示了对GL261 H2B-Dendra2肿瘤细胞进行追踪的延时录像中的代表性帧。红色线条表示单个肿瘤细胞的运动轨迹。比例尺 = 50 µm。（D）代表性体内延时图像，显示GL261 H2B-Dendra2肿瘤中的分裂细胞。图中标注了有丝分裂的不同阶段：前期（P）、前中期（Pm）、中期（M）、后期（A）和末期（T）。比例尺 = 50 µm。图表显示活检前与活检后（E）迁移细胞和（F）分裂细胞的百分比。每个点代表单只动物所有测量位置中迁移细胞的百分比。数据以六只小鼠的均值 ± 标准误（S.E.M.）表示（**P &lt; 0.01，配对t-检验）。本图经Alieva等4修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移分析；对比图；活检组与对照组；统计学显著性；速度变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：代表性结果展示活检对肿瘤细胞迁移和增殖速率的影响。（A）瀑布图显示了单只小鼠细胞速度分布相对于基础迁移水平的变化。数据以五只小鼠的均值±标准误（S.E.M.）表示。（B）对照组（蓝色）和活检组（红色）动物中迁移细胞数量，标准化为干预前的迁移细胞数量（n = 6只小鼠，***P &lt; 0.0001，Student's t-检验）。（C）对肿瘤细胞行为进行了数天的追踪。图中显示了各小鼠随时间变化的迁移细胞数量（相对于干预前标准化）（每组条件 n &gt; 4只小鼠，***P &lt; 0.0001，双因素方差分析）。（D）对照组（蓝色）和活检组（红色）动物中分裂细胞数量的标准化值。每只动物干预后的数值均标准化为干预前的数值（n = 5只小鼠，**P &lt; 0.01，Student's t-检验）。本图经修改自 Alieva 等人4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="对照、CIW更换及活检条件下迁移细胞与细胞分裂的倍数变化柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：CIW更换对肿瘤细胞行为无影响。 纵向活体成像显示，在未进行活检的情况下更换CIW对细胞迁移和增殖速率无显著影响。（A）不同实验条件下迁移细胞数量的增加情况。每个符号代表一只小鼠的平均值，n≥ 4只小鼠。（B）不同实验条件下增殖细胞数量的增加情况。每个符号代表一只小鼠的平均值（n≥ 4只小鼠，**P &lt; 0.01，***P &lt; 0.001，ns = 无显著性差异，采用Newman-Keuls事后检验的单因素方差分析）。本图经Alieva等4修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠肿瘤中的光转换分析；活检前/后快照、紫外光照、结果图示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：Dendra2光转换实验装置示意图及代表性实验结果。 为监测活检后肿瘤细胞的浸润情况，使用紫外/蓝光照射在正方形区域内对表达Dendra2的肿瘤细胞进行光转换，并在活检前1天进行成像。活检后1天，重新定位光转换区域并再次成像。图中显示的是通过通道减法校正后的代表性Dendra2图像，用于观察肿瘤细胞的浸润情况。白色虚线表示浸润区域。比例尺 = 50 µm。图表展示了活检组（红色）和对照组（蓝色）小鼠光转换区域的增加情况。每个点代表一只小鼠的平均值（n ≥ 5只小鼠，*P &lt; 0.05，Student's t-检验）。本图改编自Alieva等人的研究4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在同一只活体动物体内，对脑肿瘤细胞在侵入性外科手术干预（例如活检）前后进行高分辨率时间序列多光子成像的方法。该方法能够在单细胞水平上研究此类侵入性外科操作对肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖行为的影响。

活检是癌症治疗的标准护理手段，在临床上具有重要意义，因其可实现实体瘤的诊断、预后评估和个体化……

本方案使研究人员能够研究临床中使用的侵入性外科手术对肿瘤细胞行为（如迁移、侵袭和增殖）的影响。该方法的独特之处在于可对同一肿瘤在侵入性操作前后进行可视化观察，从而提供非纵向研究方法可能遗漏的重要信息。在确认麻醉后的成年小鼠对脚趾夹捏无反应后，将小鼠固定于立体定位仪上，并使用鼻夹和两个耳杆固定头部。使用加热灯维持动物体温，并在其眼睛上涂抹眼膏。用锋利的剪刀将颅骨部位从眼睛至颅底的毛发剪除，然后用70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。以环形方式切开皮肤，并用棉签刮除暴露的骨膜。在去除多余液体前，用棉签蘸取1%利多卡因与1:100,000浓度的肾上腺素，在手术区域处理五分钟。使用氰基丙烯酸酯胶水将皮肤边缘粘附于颅骨上，并将立体定位仪置于4倍放大倍率的解剖体视显微镜下。接着，在右侧顶骨上方小心钻出一个浅表的、直径为五毫米的环形凹槽。在沟槽中加入一滴皮层缓冲液。用细镊子抬起骨瓣以暴露脑表面，并使用弯头、锥形、极细尖的镊子去除硬脑膜。若发生出血，可使用可吸收明胶海绵止血。进行肿瘤细胞注射时，将约三微升细胞悬液吸入一支五微升的气密性注射器中，该注射器配备有2号针头。将针头固定在立体定位仪的操作臂上，并移除暴露组织表面的皮层缓冲液。将注射器针尖置于颅骨开孔的中央位置，并将针头插入颅骨表面下0.5毫米深度处。然后，向颅窗处加入一滴脑皮层缓冲液，并使用微量注射泵以每分钟250至400纳升的速度递送细胞。为制备颅骨成像窗口，将颅窗部位的脑皮层缓冲液替换为一滴硅油，以避免窗口下方产生气泡。用直径六毫米的盖玻片密封暴露的脑组织，并在盖玻片与颅骨之间涂抹氰基丙烯酸酯胶水进行封固。然后使用精细镊子轻轻将盖玻片压向颅骨。在适当的实验时间点，将小鼠仰卧放置于成像盒中，并将25倍水镜调至最低z位置。在物镜上滴加一大滴水，然后将成像盒转移至显微镜的37摄氏度黑暗恒温培养室中。将物镜移至颅骨成像窗的盖玻片处，直至水滴与盖玻片接触。使用落射荧光模式，通过目镜观察肿瘤，调节至细胞清晰对焦。将激光调至正确波长，并选择活体成像模式。选择多个感兴趣的成像位置后，在软件中记录其坐标。为每个位置定义一个z轴层叠（z-stack），以获取最大体积的肿瘤细胞图像，同时不降低肿瘤细胞的分辨率，图像间的步长设置为3 µm。随后，每隔20分钟对不同位置的肿瘤体积进行一次图像采集，持续两小时，每次采集前需在物镜上添加水。获取最后一张图像后，将小鼠转移至带有监测功能的加热垫，直至其完全恢复。首次成像后的第二天，按照示范方法将麻醉后的小鼠固定于立体定位仪框架中，用浸有丙酮的棉签擦拭盖玻片边缘，直至胶水软化。将25号针头插入盖玻片下方，用精细尖头镊子轻轻提起盖玻片，并用新鲜的皮层缓冲液润湿开颅部位。使用25号针头将肿瘤穿刺至1毫米深度，用无菌明胶海绵止血，并用新鲜的硅油封闭脑表面。然后在伤口上粘附一个新的6毫米盖玻片。进行图像分析时，在显微镜软件程序中打开延时LIF文件，选择“Process”（处理）选项卡中的“Process Tools”（处理工具），然后选择“Merge”（合并）。选择时间序列的第一幅图像，然后点击“first”。选择时间序列的第二幅图像，然后点击“second”。在“Merge Dimensions”中，选择 t 作为时间，然后点击“apply”。将生成一个包含两个时间点的新文件。分别对三个连续的 z 层图像序列进行延时追踪后，将包含延时图像的文件夹拖拽至 ImageJ 中。选择插件选项卡中的 Plugins、Tracking 和 MtrackJ。为了追踪每一个单个细胞，选择“添加”并在每个时间点点击每个细胞。然后点击“测量”，并保存文件以提取轨迹的测量数据。通过在z轴堆栈的不同xy平面上随时间追踪肿瘤细胞的迁移路径，可以确定单个肿瘤细胞的迁移情况，并将活检前后迁移细胞的百分比进行绘图分析。可根据有丝分裂过程中H2B标记的Dendra2凝聚情况来定量肿瘤细胞的增殖率，并以活检前后分裂细胞所占百分比的形式进行绘图。通过比较同一肿瘤在活检前后迁移速度的分布，发现干预后迁移细胞数量增加，同时伴随缓慢至非迁移细胞数量的减少。平均每例肿瘤在进行类似活检的损伤后，迁移细胞百分比相较于对照组未活检小鼠增加了1.75倍。尽管在对照组和活检组小鼠中，迁移性肿瘤细胞的比例最终均有所下降，但总体而言，活检组小鼠仍表现出比对照组更高的迁移能力。此外，与未进行活检的对照组小鼠相比，活检组小鼠的肿瘤细胞增殖行为随时间推移显示出有丝分裂事件数量增加1.52倍。值得注意的是，在未进行活检仅更换颅窗的情况下，并未观察到肿瘤细胞迁移或增殖的诱导现象，这表明肿瘤细胞增殖和迁移速率的提升是由类似活检的损伤特异性触发的。在进行颅骨成像、植入和替换操作时，必须以高精度和娴熟的手术技巧进行操作。可能需要大量练习。

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Research

科研

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Cancer Research

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关键词：颅窗植入，小鼠模型，光学成像，玻璃盖片，脑部手术，活体成像

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