Name: 利用 dna 折纸模板将金纳米产物组装成手性质浆细胞分裂体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学习利用DNA折纸模板将金纳米棒组装成手性等离子体超分子结构的方法。该方法使用caDNAno设计工具和常见生化实验设备，可构建具有强手性光学响应的三维纳米结构，为复杂金属纳米结构的自组装研究提供可靠方案。

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作者感谢 S. Voutilainen 在圆二色光谱仪使用方面提供的帮助。作者感谢阿尔托大学 OtaNano - 纳米显微中心（Aalto-NMC）提供的设施与技术支持。本研究工作由芬兰科学院（资助号 308992）以及欧盟“地平线 2020”研究与创新计划下的玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议 No. 71364 资助。

1. DNA 折纸结构的设计
<ol>
	<li>确定金纳米棒（AuNRs）所需的相对空间排列方式以及合适的DNA折纸模板形状（图1A）。估算AuNRs和DNA折纸模板的结构参数。定位需要进一步修饰的短链（staples）的大致位置（图1B）。</li>
	<li>下载并安装caDNAno18以设计DNA折纸模板。在caDNAno中，根据模板的预期形状布设支架链和短链，并点击Seq Tool生成短链序列。点击Paint Tool，标记出需要进一步修饰的短链（图1C）。</li>
	<li>点击Export Tool，将DNA短链序列导出为.csv文件（图1C）。</li>
	<li>设计双链锁结构以固定两个DNA折纸束之间的夹角Θ。根据两个束的相对取向，该DNA折纸结构可形成左手或右手（LH/RH）手性空间构型（图1B）。</li>
	<li>将短链的.csv文件导入电子表格应用程序。在用于AuNR组装的短链（手柄）末端添加polyA10序列。在设计的锁定位点处，用锁序列对短链进行修饰。 
	注意：代表性结果中的组装结构包含36个从短链3'端伸出的手柄，每个DNA折纸束上各18个，均匀分布在两条平行螺旋上，每隔21 nt一个。第一个和最后一个手柄位置之间的距离为168 nt，约57 nm（见附带的caDNAno文件）。</li>
</ol>
2. DNA折纸模板的组装
<ol>
	<li>制备包含带有手柄和锁链的链段在内的 staple 链工作液（SM），方法是等量混合浓度归一化的 staple 寡核苷酸（例如, 100 µM 
	注意：折纸结构通常包含数百条短链DNA（staple strands）。这些短链一般从专门从事DNA寡核苷酸化学合成的供应商处购买，通常以多孔板（如96孔板）形式提供。</li>
	<li>对于500 µL的10 nM折纸结构，混合50 µL Tris-EDTA（TE，10×）、100 µL MgCl₂（1 M）、347.5 µL无核酸酶水和2.5 µL的折纸原液。2 (100 mM)，25 µL NaCl (100 mM)，175 µL H2O，100 µL SM（0.5 µM）、5 µL 封锁链（5 µM）和 50 µL 支架链（100 nM）。</li>
	<li>在热循环仪中将混合物从 80 °C 降温至 20 °C 进行退火，具体步骤如所述 表1.</li>
</ol>
3. DNA 折纸纯化
注意：本节描述了琼脂糖凝胶纯化方案。DNA折纸模板也可使用其他方法进行纯化38,39。
<ol>
	<li>对于1%凝胶，将1 g琼脂糖加入100 mL 0.5×TBE（Tris-硼酸-EDTA）缓冲液中，通过微波炉加热溶解。根据染料说明书，加入10 µL 10,000×DNA染料。为在提取步骤（步骤3.6）中尽量减少对紫外光的暴露，应使用可在蓝光激发下观察的DNA染料。</li>
	<li>将溶液冷却至约 40 °C，缓慢加入 1 mL MgCl2 (1.3 M)，同时振荡。倒入凝胶，室温孵育30分钟。</li>
	<li>设置电泳装置，并倒入冷的（4 °C）电泳缓冲液（0.5x TBE 含 11 mM MgCl₂）2) 加入凝胶电泳槽中。将电泳槽置于冰水浴中。</li>
	<li>向折纸样品中加入上样缓冲液（6×上样缓冲液含有15%聚蔗糖400和0.25%溴酚蓝，溶于水）。根据所使用的梳子规格，将样品以适当的体积上样至凝胶孔中（例如, 50 µL，适用于厚度为1.5 mm的8孔梳</li>
	<li>以80 V电压电泳运行2小时。 
	注意：为了表征折纸结构并分离开放与闭合构型，应使用2%凝胶替代1%凝胶，并将电泳时间延长至4小时。</li>
	<li>使用凝胶成像仪对凝胶进行成像（图2). 使用蓝光透射仪观察条带，切下折纸条带，在Parafilm上压碎凝胶并收集液体。回收率约为40%。</li>
	<li>将液体移入离心过滤装置中，以3,000 x g 5分钟。使用紫外-可见（UV-VIS）分光光度计在260 nm处测定折纸结构溶液的吸光度。利用消光系数1.3 × 108 M-1·cm-1. 
	注意：DNA折纸溶液在琼脂糖凝胶纯化后的典型浓度为1-2 nM。</li>
	<li>将纯化的折纸模板于 4 °C 保存以备后续使用。</li>
</ol>
4. 金纳米棒的合成
注意：金纳米棒（AuNR）合成方案改编自先前文献40，并进行了少量修改。
<ol>
	<li>所有玻璃器皿均需用王水清洗5分钟，然后用水冲洗，再用超纯水超声处理，并在使用前干燥。</li>
	<li>配制0.2 M十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、1 mM HAuCl4、4 mM AgNO3、64 mM L(+)-抗坏血酸和6 mM NaBH4。使用4 °C的冷水溶解NaBH4，并将其保存在4 °C冰箱中。抗坏血酸溶液需现配现用。 
	注意：CTAB在皮肤接触（刺激性）、眼睛接触（刺激性）、摄入和吸入情况下具有危害性。操作时应穿戴适当的防护服。若通风不足，应佩戴合适的呼吸防护设备。NaBH4在皮肤接触（刺激性）、眼睛接触（刺激性）、摄入和吸入情况下具有极高危害性。操作时应佩戴防溅护目镜、实验服、手套以及防蒸气和粉尘的呼吸器。务必使用经批准/认证的呼吸器或同等防护设备。</li>
	<li>制备金种子（Au seeds）。
	<ol>
		<li>向玻璃小瓶中加入500 µL CTAB（0.2 M）、250 µL超纯水和250 µL HAuCl4（1 mM），在室温下以450 rpm转速搅拌5分钟。</li>
		<li>将搅拌速度提高至1,200 rpm，加入100 µL冷的NaBH4溶液（6 mM，4 °C）。2分钟后停止搅拌，将溶液置于30 °C水浴中孵育30分钟，备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备金纳米棒（AuNRs）。
	<ol>
		<li>在圆底烧瓶中，将0.55 g CTAB和0.037 g 2,6-二羟基苯甲酸溶于15 mL温水（60–65 °C）中。将溶液冷却至30 °C，加入600 µL AgNO3（4 mM），以450 rpm转速搅拌2分钟，随后在30 °C静置15分钟。</li>
		<li>向上述溶液中加入15 mL HAuCl4（1 mM），以450 rpm转速搅拌15分钟。然后加入120 µL L(+)-抗坏血酸（64 mM），立即以1,200 rpm转速搅拌30秒。接着加入12 µL金种子溶液，继续以1,200 rpm转速搅拌30秒。</li>
		<li>将溶液在30 °C水浴中孵育18小时。孵育期间避免扰动溶液，并用瓶盖密封烧瓶。</li>
		<li>将所得溶液转移至离心管中，在20 °C以9,500 × g离心12分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于20 mL超纯水中，再进行一次离心。</li>
		<li>将最终沉淀重悬于3 mL蒸馏水中。通过紫外-可见吸收光谱测定，利用纵向等离子体共振的消光系数估算AuNRs的浓度。该消光系数可根据AuNR的形貌参数预测41。将AuNRs储存于4 °C以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 用单链DNA功能化金纳米棒
注意：本节描述了采用文献中报道的低pH法对金纳米棒（AuNR）进行单链DNA（ssDNA）功能化的实验方案42。经DNA包被的金纳米棒通过离心法进行纯化； alternatively，也可使用琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
<ol>
	<li>将20 µL巯基功能化的polyT DNA链（1 mM）与20 µL新配制的三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP，14 mM）在室温下孵育1小时，以还原二硫键。 
	注意：巯基可与金纳米棒（AuNRs）形成化学键，而polyT序列则与DNA折纸结构上的polyA10手柄发生杂交，若碱基对数量过多或过少，可能导致功能异常或组装不稳定。 
	警告：TCEP可引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。操作时需佩戴防护手套、防护服、眼部及面部防护装备。</li>
	<li>将150 µL金纳米棒（AuNRs，10 nM）与40 µL经TCEP处理的巯基-DNA（0.5 mM）混合。向AuNR溶液中加入1%十二烷基硫酸钠（SDS），使最终SDS浓度达到0.05%。用约1 µL的HCl（1 M）调节pH至2.5–3.0。</li>
	<li>在70 rpm振荡条件下孵育2小时。 
	注意：AuNR与DNA的摩尔比应控制在1:5,000–15,000之间，具体比例取决于纳米棒的尺寸。对于按照第4节所述方法制备的AuNRs（70 nm × 30 nm），建议使用13,000倍过量的巯基-DNA。</li>
	<li>加入NaCl使最终NaCl浓度达到0.5 M，并在室温下以70 rpm振荡孵育4小时。 
	注意：此步骤中若出现明显的颜色变化，可能提示DNA功能化失败。</li>
	<li>用TBE缓冲液（10×）调节pH至约8.5，并过夜孵育。</li>
	<li>通过将样品与1 mL洗涤缓冲液（0.5× TBE含0.1% SDS）混合，对DNA-AuNR复合物进行4次洗涤，每次在7,000 × g离心30分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于残留液体中（约40 µL）。根据步骤4.4.5所述方法，通过紫外-可见吸收光谱测定估算DNA-AuNR的浓度。 
	注意：在步骤5.3–5.4过程中，由于巯基-DNA取代了AuNR表面的CTAB，溶液可能略微变“浑浊”。将溶液在约35 °C加热5分钟后，应恢复澄清。</li>
</ol>
6. 在DNA折纸模板上组装金纳米棒
<ol>
	<li>向纯化的 DNA-AuNR 溶液中加入 MgCl2，使其终浓度为 10 mM。将纯化的 DNA-AuNR 与折纸结构按 10:1 的比例混合。 
	注意：较低的比例可能会降低产物产率43。</li>
	<li>将混合物置于带有温度控制的混匀仪中，按照 表 2 中的程序，从 40 °C 逐步降温至 20 °C，同时以 400 rpm 振荡进行退火。 
	注意：对于圆二色性（CD）表征，样品在此步骤后可直接测量，无需进一步纯化。</li>
	<li>采用 0.7% 琼脂糖凝胶电泳（80 V 条件下电泳 3.5 小时）纯化最终的折纸-AuNR 结构。</li>
	<li>使用白光透射仪成像，切下产物条带（折纸-AuNR 二聚体）（图 3），在 Parafilm 膜上压碎凝胶并收集液体。将液体转移至离心过滤装置中，以 3,000 × g 离心 5 分钟。将折纸-AuNR 重新悬浮于溶液中。从凝胶中回收的产率约为 50%。</li>
	<li>根据步骤 4.4.5 所述方法，通过紫外-可见（UV-VIS）吸收测定估算折纸-AuNR 结构的浓度。</li>
</ol>
7. 透射电子显微镜成像
注意：本乙酸铀（UFo）染色方案改编自以往文献44。
<ol>
	<li>将200 µL UFo溶液（0.75%）与1 µL NaOH（5 M）混合，并立即涡旋振荡2-3分钟。将染色液在14,000 × g 条件下离心3-4分钟。避免染色液暴露于光线下（例如用铝箔包裹）。 
	注意：UFo若被吸入或吞咽具有毒性，可引起眼部刺激。若发生短暂暴露或低浓度污染，请使用呼吸过滤装置；若发生高强度或长时间暴露，请使用自给式呼吸防护设备。佩戴手套，手套材料必须对UFo及其溶液具有不渗透性和耐受性。佩戴密封严实的护目镜。</li>
	<li>使用前对碳/火棉胶包被的透射电镜载网进行6秒的辉光放电处理，以增强其亲水性并促进结构附着。用移液器将5 µL样品液滴加至电镜载网上，孵育5-8分钟，然后用滤纸边缘轻轻接触载网边缘以去除液滴。</li>
	<li>在石蜡膜上分别滴加一大滴（约20 µL）和一小滴（约10 µL）染色液。将载网置于小染色液滴上，立即用滤纸边缘接触载网边缘使其干燥，随后将其转移至大染色液滴上染色30秒。</li>
	<li>用滤纸边缘接触载网边缘以去除载网上的液体，将载网放入载网盒中。静置至少10分钟，待其完全干燥。</li>
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）对折纸结构样品（图4）、金纳米棒（AuNRs）（图5）以及折纸-金纳米棒复合物（origami-AuNRs）（图6）进行表征。</li>
</ol>
8. 圆二色性测量
<ol>
	<li>用 N2 对圆二色光谱仪吹扫 20 分钟。 
	注意：大多数圆二色光谱仪在灯点燃前需要使用 N2 吹扫。请查阅圆二色光谱仪的使用手册。</li>
	<li>设置带宽、扫描范围和采集步长。 
	注意：扫描范围取决于金纳米棒（AuNRs）的光学性质，而光学性质与金纳米棒的尺寸有关。</li>
	<li>使用缓冲液测量空白圆二色光谱。</li>
	<li>测量折纸结构-金纳米棒样品的圆二色光谱（图 7）。 
	注意：圆二色光谱测量应使用石英或玻璃比色皿。塑料比色皿不适用于圆二色光谱分析。此外，大多数圆二色光谱仪可同时采集吸收光谱和圆二色光谱数据。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了基于DNA折纸术的金纳米棒手性组装体的设计、组装、纯化和表征的完整工作流程。本方案中使用的DNA折纸模板特别适用于构建响应性刺激的组装体。多种类型的响应元件和功能化基团可被整合到锁定链中，以定义折纸模板的手性状态（图1B）24,25,26,31。对于静态组装体，通常使用较简单的块状模板即可满足需求14,45,46,47。
基于DNA折纸技术的等离激元纳米结构制备方法继承了DNA折纸技术的局限性48。折纸模板的尺寸通常受限于支架链的长度。在低盐条件下，DNA结构的稳定性降低。合成订书钉链的成本仍然较高。然而，结构DNA纳米技术领域的最新进展有望克服这些局限性49,50,51,52,53,54,55。
与其他基于分子的方法相比，DNA折纸技术在构建金纳米棒（AuNRs）手性组装方面具有更高的空间精确性和可编程性34,35,36,37。
为了获得可靠且可重复的螺旋结构光学响应，我们强烈建议采用文中提供的金纳米棒（AuNR）合成方案40，因为商业产品的质量和光学性质可能在不同批次之间存在差异。额外的退火步骤（步骤6.2）对于确保金纳米棒（AuNRs）正确地连接到DNA折纸模板上通常至关重要（图6）。
最后，此处描述的方案不仅限于手性组装结构。DNA折纸技术为复杂等离激元纳米结构的构建提供了一个高度灵活的平台9,10。

DNA纳米结构，尤其是DNA折纸技术，已被广泛用于以纳米级精度将分子及其他纳米尺度组分（如蛋白质和纳米颗粒[NPs]）排列成几乎任意的几何构型1,2,3,4,5。在DNA折纸模板上高产率、高精度地排列金属纳米颗粒，使得构建具有新颖光学特性的等离激元结构成为可能6,7,8,9,10。DNA折纸技术在构建手性等离激元结构方面尤为有用，因为这类结构需要真正三维的架构11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。
本方案详细描述了以DNA折纸为模板的金纳米棒手性组装结构的完整制备过程。用于DNA折纸结构设计21和结构预测22,23的软件直观且可免费获取。DNA折纸的制备与金纳米棒的合成均使用常规的生物化学实验设备（如PCR仪、凝胶电泳装置、加热板、离心机）。所获得的结构通过标准的透射电子显微镜（TEM）和圆二色光谱（CD）进行表征。
使用自上而下的方法（例如电子束光刻）制备类似的等离激元纳米结构需要相当复杂且昂贵的设备。此外，DNA折纸模板使得在等离激元组装体中引入结构可重构性成为可能24,25,26,27,28,29,30,31,32,33，而采用光刻技术制备的结构实现这一特性极具挑战性。与其他基于分子的方法34,35,36,37相比，基于DNA折纸的制备方法具有高度的空间精确性和可编程性。

<table><tbody><tr><td>2,6-二羟基苯甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D109606-25</td><td>98+%</td></tr><tr><td>AgNO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA1141414</td><td>99.90%</td></tr><tr><td>蓝光透射仪&amp;nbsp;</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-06</td><td>FastGene LED透射式紫外仪</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Acros Organics</td><td>403160050</td><td>用于琼脂糖凝胶&amp;nbsp; 上样缓冲液</td></tr><tr><td>离心过滤装置</td><td>默克密理博</td><td>42600</td><td>从琼脂糖中提取DNA</td></tr><tr><td>Chirascan CD 圆二色光谱仪&amp;nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>比色皿&amp;nbsp;</td><td>赫尔马&amp;nbsp;</td><td>105-202-85-40</td><td>石英 SUPRASIL</td></tr><tr><td>DNA低吸附管</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biospectrometer&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6135000904</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>BP525-10</td><td>聚蔗糖 400（用于琼脂糖凝胶）&amp;nbsp; 上样缓冲液</td></tr><tr><td>凝胶电泳设备套件</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td>Gel Doc XR+ 系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HAuCl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;3H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA3640006</td><td>99.99%</td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>Scharlau</td><td>AC07441000</td><td>1M</td></tr><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9151-100</td><td>BioXtra，98+%</td></tr><tr><td>L(+)-抗坏血酸</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td>99+%</td></tr><tr><td>M13p7560 支架链</td><td>Tilibit 纳米系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500</td><td>BioXtra，99+%</td></tr><tr><td>NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>200050250</td><td>99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-500</td><td>BioXtra，99.5+%以上</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500</td><td>BioXtra，98+%</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668-1EA</td><td>PARAFILM M</td></tr><tr><td>PBS缓冲液（10X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP3991</td><td>分子生物学</td></tr><tr><td>ProFlex PCR 系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255-250</td><td>99+%</td></tr><tr><td>staples链</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sybr Safe</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>S33102</td><td>用于DNA染色</td></tr><tr><td>TBE 缓冲液（10X）</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td>分子生物学</td></tr><tr><td>TE缓冲液（10X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP24771</td><td>分子生物学</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td>FEI Tecnai F12</td></tr><tr><td>巯基功能化&amp;nbsp; ssDNA&amp;nbsp;</td><td>Biomers.net</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸三(2-羧乙基)膦（TCEP-HCl）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PI20491</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>超纯水（1型）</td><td></td><td></td><td>Milli-Q Direct 8 系统</td></tr><tr><td>甲酸铀酰</td><td>Tebu-bio</td><td>24762-1</td><td></td></tr><tr><td>白光透射仪</td><td>UVP</td><td>TW-26</td><td></td></tr></tbody></table>

利用dna折纸模板将金纳米棒组装成手性等离激元超分子

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

DNA折纸结构固有的可寻址性使其成为将金属纳米颗粒排列成复杂等离激元纳米结构的理想模板。利用DNA折纸模板进行组装具有高度的空间精确性，可调控单个颗粒等离激元共振之间的耦合作用，从而定制所构建纳米结构的光学特性。近年来，手性等离激元系统因其等离激元组装体的空间构型与光学响应（例如圆二色性[CD]）之间存在强关联而受到广泛关注。在本实验方案中，我们描述了构建基于DNA折纸的手性金纳米棒（AuNRs）组装体的完整工作流程。该方案包括DNA折纸模板的设计原理和实验制备方法、AuNRs的合成以及折纸-AuNR结构的组装过程的详细说明。此外，还涵盖了利用透射电子显微镜（TEM）和圆二色光谱（CD）对结构进行表征的方法。所述方案不仅限于手性构型，还可推广用于构建多种等离激元结构。

DNA折纸模板、金纳米棒（AuNRs）以及最终的折纸-金纳米棒组装体的透射电子显微镜（TEM）图像分别如图4、图5和图6A所示。由于其对TEM载网的结合偏好，折纸-金纳米棒组装体通常呈现为平行排列的折纸束和棒状结构（图6A）。金纳米棒在折纸模板上的正确排列需要经过热退火处理（图6A,B）。该方案可实现金纳米棒高效组装为具有强等离激元圆二色性（CD）响应的手性超分子结构（图7）。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>温度 (°C)</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>79 - 71</td>
			<td>1 °C / 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 - 66</td>
			<td>1 °C / 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 - 60</td>
			<td>1 °C / 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>59 - 37</td>
			<td>1 °C / 60 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36 - 30</td>
			<td>1 °C / 15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29 - 20</td>
			<td>1 °C / 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>保持</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：DNA折纸模板热退火的温度与速率。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>温度 (°C)</td>
			<td>时间 (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>36</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>保持</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：金纳米棒（AuNRs）与DNA折纸模板退火的温度及保温时间。 各步骤之间的降温速率为0.1 °C/min。DNA折纸-金纳米棒（AuNR）样品在400 rpm振荡条件下进行退火。
<img alt="具有AuNR结合位点、构型和序列设计示意图的DNA折纸模型图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：基于DNA折纸模板的手性超分子设计。（A）确定金纳米棒（AuNRs）所需的相对空间排列方式以及合适的DNA折纸模板形状。（B）估算AuNRs的结构参数（DAuNR，LAuNR）和折纸模板的参数（Worigami，Lorigami,Θ），并定位需要进一步修饰的短链DNA（staples）的大致位置。（C）使用caDNAno软件设计DNA折纸模板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA折纸的凝胶电泳结果，显示链分离和折叠结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：DNA折纸的琼脂糖凝胶电泳。（A）使用1%琼脂糖凝胶在80 V电压下电泳2小时进行纯化。（B）使用2%琼脂糖凝胶在80 V电压下电泳4小时进行表征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有标记的DNA-AuNR聚集体、二聚体和未结合颗粒的凝胶电泳图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：折纸结构-AuNR的琼脂糖凝胶电泳纯化。 对按照组装程序制备的不同DNA-AuNR与折纸结构比例（20:1、5:1）的样品，以及经或未经退火程序处理的样品（10:1 DNA-AuNR与折纸结构比例），在80 V电压下运行0.7%凝胶3.5小时。有关条带1、2和3中样品的透射电子显微镜（TEM）图像，请参见图6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米结构的电子显微镜图像；比例尺：100 nm；材料研究，纳米技术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：DNA折纸模板的代表性透射电子显微镜（TEM）图像。 折纸结构由两个14螺旋束（80 nm × 16 nm × 8 nm）通过支架链连接而成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于材料科学分析的纳米棒在100 nm尺度下的扫描电子显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：AuNRs的代表性透射电子显微镜（TEM）图像。合成的AuNRs的平均尺寸为70 × 30 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒分布，用于粒径分析的电子显微镜图像，比例尺：100 nm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：DNA折纸-AuNR组装体的透射电子显微镜（TEM）图像。（A）退火后DNA折纸上的AuNR二聚体（对应图3中的条带1）。（B）未经退火处理的DNA折纸上AuNR二聚体（对应图3中的条带2）。（C）DNA折纸-AuNR聚集体（对应图3中的条带3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="圆二色性图谱；开态与闭态的CD光谱分析，波长范围550-750 nm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：DNA折纸-AuNR组装体的CD光谱。 闭合结构（由锁链固定为右旋构型、两个DNA折纸束之间夹角为50°的折纸模板）与开放结构（无锁链的DNA折纸模板）的CD光谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了基于DNA折纸技术将金纳米棒组装成具有强手性光学响应的手性等离激元超分子的详细方案。该方案不仅限于手性构型，还可轻松适用于多种等离激元结构的制备。

利用DNA折纸模板将金纳米棒组装成手性等离激元超分子

DNA折纸结构固有的可寻址性使其成为金属纳米粒子在复杂等离激元结构中排列的理想模板。

该方法可实现具有强手性光学响应的三维手性等离激元组装体的制备。此方法的主要优势在于，可利用广泛可得的软件工具和常见的生物化学实验室设备来制备复杂的金属纳米结构。本实验操作将由我实验室的博士研究生Yike Huang和博士后Minh-Kha Nguyen进行示范。使用 caDNAno 设计 DNA 折纸模板。根据模板的预期形状，将支架链在短链中进行路径规划。然后通过点击序列工具生成短链序列。单击绘图工具，标记需要进一步修改的短链DNA序列。单击导出工具，将DNA短链序列导出为CSV文件，然后将该CSV文件导入电子表格应用程序中。在用于金纳米棒组装的订书钉序列末端添加一段多聚腺嘌呤序列作为手柄。用锁序列对设计的锁定位点上的订书钉链进行修饰。通过等量混合浓度归一化的订书钉寡核苷酸，制备包含带手柄和锁序列链的工作储备液。然后按照文中的实验方案详细制备折纸混合物。在PCR仪中将混合物从80摄氏度退火至20摄氏度。对于1%的凝胶，将1克琼脂糖溶于100毫升TBE缓冲液中，通过微波炉加热该混合物进行溶解。根据染色剂的说明书，加入10微升10,000倍稀释的DNA染色剂。为在提取步骤中尽量减少紫外线暴露，应使用可在蓝光激发下观察的DNA染色剂。制备凝胶，并在室温下孵育30分钟。然后将电泳槽放入冰水浴中。向折纸样品中加入上样缓冲液，并根据所用的加样孔体积，将样品以适当的体积上样至加样孔中。在80伏电压下电泳运行两小时。使用凝胶成像仪对凝胶进行成像。利用蓝光透射仪观察条带，并切下折纸结构对应的条带。随后将凝胶在帕尔膜（parafilm）上碾碎，提取液体。回收率约为40%。用移液器将液体转移至离心过滤装置中，在3,000 × g条件下离心5分钟。使用紫外-可见分光光度计在260纳米处测定折纸结构溶液的吸光度。制备金纳米棒时，将0.55克CTAB和0.037克2,6-二羟基苯甲酸溶解于15毫升温水中，置于圆底烧瓶中。将溶液冷却至30摄氏度后，加入600微升4毫摩尔的硝酸银溶液，并在450转/分钟下搅拌2分钟。在30摄氏度下静置溶液15分钟。随后，向溶液中加入15毫升1毫摩尔的四氯金酸溶液，并在450转/分钟下搅拌15分钟。同时，加入120微升64毫摩尔的L-抗坏血酸，并立即以1,200转/分钟搅拌30秒。随后，加入12微升金种子，继续以1,200转/分钟搅拌30秒。将溶液在30摄氏度水浴中孵育18小时。不要扰动溶液，并用瓶盖封闭烧瓶。将所得溶液转移至离心管中，在20摄氏度下以9,500 ×g离心12分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于20毫升超纯水中。再进行一次离心步骤，然后将最终沉淀重悬于三毫升蒸馏水中。通过紫外-可见吸收测量，利用纵向表面等离子体共振的消光系数估算金纳米棒的浓度。将150微升10纳摩尔的金纳米棒与40微升0.5毫摩尔的TCEP处理过的巯基DNA混合。向金纳米棒溶液中加入1% SDS，直至SDS终浓度达到0.05%。用约1微升1摩尔HCl将pH值调节至2.5至3之间。在70 RPM条件下振荡孵育2小时。加入氯化钠，使终浓度达到 0.5 摩尔，然后在室温下以 70 转/分钟振荡孵育 4 小时。接着，用 10× TBE 缓冲液将 pH 调整至约 8.5，并过夜孵育。通过将样品与 1 毫升洗涤缓冲液混合，对 DNA 金纳米棒进行 4 次洗涤，并在 7,000 ×g 离心 30 分钟。弃去上清液，并将DNA金纳米棒重悬于剩余液体中。通过紫外-可见吸收光谱测定，如前所述，估算DNA金纳米棒的浓度。向纯化后的DNA金纳米棒溶液中加入氯化镁，使其终浓度为10毫摩尔。将纯化的DNA金纳米棒与折纸结构按10:1的比例混合，并在400 rpm振荡条件下，使用温度控制器将混合物从40摄氏度逐步降温至20摄氏度。采用0.7%琼脂糖凝胶电泳纯化最终的折纸金纳米棒结构。进行透射电子显微镜（TEM）成像前，取200微升0.75%甲酸铀酰溶液与1微升5摩尔氢氧化钠溶液混合。立即涡旋混匀两到三分钟。将染色液在14,000 ×g条件下离心三到四分钟。然后用铝箔包裹染色液，避免光照。按照文本方案中所述增强TEM载网的疏水性后，用移液器将5 µL样品液滴加到TEM载网上。孵育5至8分钟后，用滤纸轻轻接触载网边缘，吸去液滴。现在，在一块Parafilm上分别滴加一滴较大的染色液和一滴较小的染色液。将载网置于小滴染色液上，并立即用滤纸接触载网边缘，使其迅速干燥。然后，将其置于大滴染色液中染色30秒。图中所示为DNA折纸模板的透射电子显微镜（TEM）图像。该折纸结构由两个14螺旋束组成，二者通过支架链连接在一起。此处展示了一张具有代表性的金纳米棒透射电子显微镜（TEM）图像。合成的金纳米棒平均尺寸为 70 × 30 纳米。该图像显示了退火后折纸结构上的金纳米棒二聚体。由于对透射电镜载网具有结合偏好，DNA折纸金纳米棒组装体通常呈现为平行的折纸束和棒状结构。该方案能够高效地将金纳米棒组装成具有强等离激元圆二色性响应的手性超分子。图中显示的是闭合结构和开放结构的光谱。该技术发展之后，为研究人员探索复杂自组装金属纳米结构的等离激元光学特性开辟了道路。如文本方案所述，本方法中使用了多种危险化学品。请仔细查阅材料安全数据表，并采取必要的防护措施。

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