S. aureus 生物膜中碱性磷酸酶活性的比色分析

本方案介绍了一种简便且可靠的检测金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜培养物中碱性磷酸酶活性的方法。该方法将有助于我们理解碱性磷酸酶（ALP）在生物膜形成中的功能。该技术的主要优势在于具有高通量特性。

该方法非常灵敏且易于操作。演示该实验步骤的是哈珀学院前学生 Kevin Danikowski。配制胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）时，将酪蛋白胰酶消化物、大豆粉木瓜蛋白酶消化物、氯化钠、葡萄糖和磷酸氢二钾加入蒸馏水中。

用铝箔覆盖烧瓶，并放入高压灭菌器中灭菌后再使用。制备胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）时，将琼脂加入胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，然后放入高压灭菌器中进行灭菌，随后冷却至室温。

接下来，按每皿20毫升的比例将其倒入培养皿中。为制备生物膜培养基，向已高压灭菌的TSB中加入葡萄糖，使其终浓度为10克/升。使用真空过滤装置，用孔径为0.2微米的滤膜过滤该溶液。

接种时，使用灭菌的接种环从培养皿中挑取一个金黄色葡萄球菌（Staph aureus）单菌落，放入含有10毫升TSB的培养管中。将培养管置于37摄氏度的培养箱中过夜培养。用微量移液器吸取100微升过夜培养物，转移至含有10毫升添加葡萄糖的TSB培养基的培养管中，按1:100的体积比进行稀释。

轻轻涡旋混匀以确保浓度一致。使用微量移液器将稀释后的培养物各200微升转移至一个96孔板中的共计18个孔。将96孔板置于37摄氏度条件下孵育24小时，以形成生物膜。

为了获得最佳的金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜形成效果，建议选用平底或圆底的96孔板。随后，轻轻倾斜平板，从每孔边缘吸出上清液。每孔用1×PBS洗涤一次。

将培养板放入离心机，以每分钟8,000转的速度离心5分钟，然后通过抽吸弃去上清液。向每个孔中加入75 µL含有市售PNPP的缓冲液ALP底物，并使用计时器记录每个时间点的三复孔数据。在每个孵育时间点后，向三个孔中各加入75 µL 5摩尔的氢氧化钠以终止反应。

将培养板在800转/分钟下离心5分钟。使用移液器将100 µL上清液转移至新的96孔板中，用于比色测定。使用96孔板读板仪在405 nm波长下测定各孔的吸光度。

使用30分钟时间点的孔来控制背景噪声。在三块96孔板中重复整个实验。本方案建立了一种快速且可靠的检测方法，用于测定金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜中的碱性磷酸酶（ALP）活性，且无需进行蛋白质分离。

碱性磷酸酶（ALP）活性的代表性结果表明，在75分钟内呈上升趋势；75分钟后，ALP活性未再增加。建立良好的生物膜培养体系至关重要，可能需要多次尝试才能掌握。

可以通过结晶紫染色实验来确认生物膜的形成，该方法此前已被我们及其他研究者报道；或者，也可在接种前用人血浆预处理培养板，以促进生物膜的形成。生物膜形成后，可筛选可能干扰其形成的潜在碱性磷酸酶（ALP）抑制剂。该结果将为医学领域中生物膜的防控提供重要信息。

五摩尔的氢氧化钠在接触时可能具有危险性。操作时务必佩戴个人防护装备。