Name: 金黄色葡萄球菌生物膜碱性磷酸酶活性的比色法分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: 学习使用96孔板高通量比色法测定金黄色葡萄球菌生物膜中的碱性磷酸酶活性。该方法灵敏可靠，无需蛋白分离，有助于深入理解ALP在生物膜形成中的功能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢威廉·雷尼·哈珀学院和伊利诺伊大学芝加哥分校为我们提供进行这些实验的设施。我们还感谢麦格劳-希尔基金会的慷慨支持。

1. 培养基制备
<ol>
	<li>制备1 L胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）：向1 L蒸馏水中加入15 g酪蛋白胰酶消化物、5 g大豆粉木瓜蛋白酶消化物、3 g氯化钠、2.5 g葡萄糖和2.5 g磷酸氢二钾。使用前进行灭菌。</li>
	<li>对于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），在1 L TSB中加入15 g琼脂，高压灭菌后冷却至室温，然后以每皿（100 mm × 15 mm）20 mL的比例倒入培养皿中。</li>
	<li>生物膜培养基：向1 L经高压灭菌的TSB中加入10 g葡萄糖，使用0.2 µm滤膜过滤除菌。</li>
</ol>
2. 在96孔组织培养板中形成S. aureus 生物膜
注意：S. aureus 生物膜的培养方法如前所述6,21。
<ol>
	<li>从TSA平板上挑取单个金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌落接种于10 mL TSB培养基中，37 °C过夜培养。</li>
	<li>将过夜培养物按1:100（v/v）比例稀释至10 mL含葡萄糖（10 g/L）的TSB培养基中，轻轻涡旋混匀以获得一致的浓度。</li>
	<li>将稀释后的菌液各200 μL转移至一块96孔板中的共计18个孔（若需设置实验组，如非生物膜对照组以评估与碱性磷酸酶活性的关系6，可增加孔数）。每个时间点（0 min、15 min、30 min、45 min、60 min和75 min）设三个复孔。参见步骤3.2。</li>
	<li>将96孔板在37 °C孵育24 h，以形成生物膜6,21。</li>
	<li>通过吸弃去除上清液。</li>
	<li>每孔用1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤一次，15,000 × g 离心5 min，然后通过吸弃去除上清液。</li>
</ol>
3. 碱性磷酸酶活性的测定 S. aureus 生物膜
注意：ALP 活性测定方法如文献6,18所述。
<ol>
	<li>向第2.6步的每个孔中加入75 μL由市售pNPP组成的缓冲ALP底物，并开始计时。每个时间点设三个重复孔进行记录。</li>
	<li>分别在孵育不同时间后：0分钟（对照）、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟和75分钟，向每孔加入75 µL的5 M NaOH以终止反应。</li>
	<li>将板在15,000 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>将100 µL上清液转移至新的96孔板中，用于比色测定。</li>
	<li>使用96孔板读数仪在405 nm处测定各孔的吸光度。以0分钟时间点的孔作为对照，校正405 nm处的背景噪声。</li>
	<li>在整个实验中，使用三个独立的96孔板重复三次。</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
<li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support%5BTitle%5D)+AND+%22Boston+Medical+Center+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).</li>
<li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase%3A+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li>
<li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended%3A+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li>
<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
<li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li>
<li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+and+Research+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li>
<li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li>
<li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li>
<li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li>
<li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在我们的检测中，使用 pNPP 作为碱性磷酸酶（ALP）的底物。这是一种专为 ELISA 设计的工作液，无需稀释。ALP 催化水解后生成黄色产物，可在 405 nm 处测定其吸光度。酶促反应结束后，我们对 96 孔板短暂离心，并将上清液转移至新的 96 孔板中，使用酶标仪测定吸光度。我们发现这一额外的离心步骤至关重要，因为它可提高 405 nm 处吸光度的一致性，可能是通过去除酶促反应过程中可能产生的悬浮细胞所致。
在生物膜形成过程中，我们采用200 μL的过夜培养物按1:100（v/v）比例稀释，如文献报道6,21。与其它稀释比例相比，该稀释度是金黄色葡萄球菌（S. aureus）形成生物膜的最佳条件（数据未显示）。由于本文的目的是测定生物膜中的碱性磷酸酶（ALP）活性，因此维持最佳的生物膜培养条件至关重要。此外，使用10 g/L葡萄糖以促进生物膜最佳生长的选择进一步强调了这一点6。若采用不同的细菌...

碱性磷酸酶（ALP）在原核细胞和真核细胞中普遍存在1。它能够催化多种分子（如核苷酸、蛋白质、生物碱、磷酸酯以及磷酸的酸酐）中单磷酸基团的水解反应。在人体中，真核生物来源的ALP广泛存在于肝脏、骨骼、肠道和胎盘等多种组织中2。该酶在蛋白质磷酸化、细胞生长、凋亡、干细胞过程以及正常的骨骼矿化过程中发挥重要作用。当其水平升高时，真核生物ALP也是提示骨骼、肝脏及其他组织或器官疾病存在的关键血清指标3,4。
已在多种细菌细胞中检测到原核生物碱性磷酸酶（ALP），包括E. coli5、S. aureus6,7以及土壤中一些常见的瘤胃细菌8。细菌ALP活性已被用作生物传感器，用于检测农药、重金属9和细菌污染10。ALP的组成型表达已被用于鉴定Staphylococci11，并区分Serratia与Enterobacter12。另有研究提示，staphylococci中组成型ALP的产生可能与其致病性相关13。尽管ALP已在不同条件下被广泛研究3,4，但其在生物膜培养中的活性与功能报道仍较少。
与游离生活的细菌细胞相比，生物膜中的细菌生命活动方式已被证实存在差异14。在S. aureus中，生物膜的形成已在多种临床条件下被发现，并与抗生素耐药性和慢性炎症相关15,16。许多分子已被报道存在于生物膜基质中，如多糖、蛋白质、核酸和脂类，但生物膜形成的机制尚未完全阐明14。为了理解碱性磷酸酶（ALP）在生物膜形成中的作用，我们将在96孔组织培养板中培养S. aureus生物膜，并使用对硝基苯磷酸盐（pNPP）测定ALP活性。
分子pNPP是碱性磷酸酶（ALP）的一种即用型底物，已被广泛用于测定ALP活性6,17,18。该比色法检测基于对硝基苯基磷酸盐（pNPP）转化为对硝基苯酚，生成在405 nm处有吸收的有色产物。与其他传统的ALP检测方法（如琼脂糖凝胶电泳19、麦胚凝集素（WGA）沉淀法和WGA-HPLC20）相比，该方法具有高度特异性、高灵敏度、易于重复，且最重要的是可实现高通量检测。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>对硝基苯基磷酸盐（pNPP）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>对硝基苯基磷酸盐（pNPP）液体底物的典型浓度范围通常在 10 至 50 mM 之间，常用于酶联免疫吸附测定（ELISA）。与本实验所用的此类即用型 pNPP 液体底物相似，由于其成分为专有配方，具体浓度未予公开。</td></tr><tr><td>10x PBS，pH 7.4。&lt;br/&gt; 173 mM NaCl，&lt;br/&gt; 2.7 mM KCl，&lt;br/&gt; 8 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，&lt;br/&gt; 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 15 g/L TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤：&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; g/L&lt;br/&gt; 酪蛋白胰酶消化物........................ 15.0&lt;br/&gt; 大豆粉木瓜酶消化物..................... 5.00&lt;br/&gt; 氯化钠........................................ 3.00&lt;br/&gt; 葡萄糖........................................ 2.50&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 磷酸氢二钾.................................. 2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96 孔组织培养板</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>U 型底</td></tr></tbody></table>

s. aureus 生物膜中碱性磷酸酶活性的比色分析

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

碱性磷酸酶（ALP）是一种在原核细胞和真核细胞中均普遍表达的酶。它能在碱性pH条件下催化多种分子上磷酸单酯的水解反应，在磷酸盐代谢中发挥不可或缺的作用。在人体中，真核来源的ALP是诊断多种疾病（如胆汁淤积和佝偻病）时最常用的酶学指标之一。在S. aureus中，ALP仅在细胞膜上被检测到，同时也以分泌形式表达。然而，其在生物膜形成中的功能尚不清楚。
本论文的目的是建立一种快速且可靠的检测方法，用于测定S. aureus生物膜中的碱性磷酸酶（ALP）活性，且无需进行蛋白质分离。以对硝基苯磷酸盐（pNPP）为底物，我们在96孔组织培养板中形成的S. aureus生物膜中测定了ALP活性。该检测基于反应生成的可溶性产物在405 nm处的吸光度进行定量。96孔组织培养板法具有高通量特性，为ALP活性检测提供了一种灵敏且可重复的方法。相同的实验体系还可拓展用于检测其他与生物膜形成相关的胞外分子标志物。

图1展示了在96孔组织培养板中培养的S. aureus生物膜中ALP活性的代表性结果。向每个孔中加入75 μL市售的pNPP溶液，并在室温下孵育。在不同孵育时间（分别为0 min、15 min、30 min、45 min、60 min和75 min）后，向各孔中加入75 μL 5 M NaOH以终止反应。随后在96孔板读板仪中于405 nm处测定产物。每个时间点均在单个96孔板内设置三个重复，整个实验在3个独立的96孔板中重复进行。
<img alt="碱性磷酸酶活性图表，显示在405 nm处的吸光度随时间变化的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59285/59285fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：<em...

在本研究中，我们建立了一种高通量方法，用于定量96孔组织培养板中金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜培养物的碱性磷酸酶活性

S. aureus 生物膜中碱性磷酸酶活性的比色分析

碱性磷酸酶（ALP）是一种在原核细胞和真核细胞中均表达的常见酶。它可催化磷酸单酯的水解反应，生成磷酸根离子和相应的醇。

本方案介绍了一种简便且可靠的检测金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜培养物中碱性磷酸酶活性的方法。该方法将有助于我们理解碱性磷酸酶（ALP）在生物膜形成中的功能。该技术的主要优势在于具有高通量特性。该方法非常灵敏且易于操作。演示该实验步骤的是哈珀学院前学生 Kevin Danikowski。配制胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）时，将酪蛋白胰酶消化物、大豆粉木瓜蛋白酶消化物、氯化钠、葡萄糖和磷酸氢二钾加入蒸馏水中。用铝箔覆盖烧瓶，并放入高压灭菌器中灭菌后再使用。制备胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）时，将琼脂加入胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，然后放入高压灭菌器中进行灭菌，随后冷却至室温。接下来，按每皿20毫升的比例将其倒入培养皿中。为制备生物膜培养基，向已高压灭菌的TSB中加入葡萄糖，使其终浓度为10克/升。使用真空过滤装置，用孔径为0.2微米的滤膜过滤该溶液。接种时，使用灭菌的接种环从培养皿中挑取一个金黄色葡萄球菌（Staph aureus）单菌落，放入含有10毫升TSB的培养管中。将培养管置于37摄氏度的培养箱中过夜培养。用微量移液器吸取100微升过夜培养物，转移至含有10毫升添加葡萄糖的TSB培养基的培养管中，按1:100的体积比进行稀释。轻轻涡旋混匀以确保浓度一致。使用微量移液器将稀释后的培养物各200微升转移至一个96孔板中的共计18个孔。将96孔板置于37摄氏度条件下孵育24小时，以形成生物膜。为了获得最佳的金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜形成效果，建议选用平底或圆底的96孔板。随后，轻轻倾斜平板，从每孔边缘吸出上清液。每孔用1×PBS洗涤一次。将培养板放入离心机，以每分钟8,000转的速度离心5分钟，然后通过抽吸弃去上清液。向每个孔中加入75 µL含有市售PNPP的缓冲液ALP底物，并使用计时器记录每个时间点的三复孔数据。在每个孵育时间点后，向三个孔中各加入75 µL 5摩尔的氢氧化钠以终止反应。将培养板在800转/分钟下离心5分钟。使用移液器将100 µL上清液转移至新的96孔板中，用于比色测定。使用96孔板读板仪在405 nm波长下测定各孔的吸光度。使用30分钟时间点的孔来控制背景噪声。在三块96孔板中重复整个实验。本方案建立了一种快速且可靠的检测方法，用于测定金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜中的碱性磷酸酶（ALP）活性，且无需进行蛋白质分离。碱性磷酸酶（ALP）活性的代表性结果表明，在75分钟内呈上升趋势；75分钟后，ALP活性未再增加。建立良好的生物膜培养体系至关重要，可能需要多次尝试才能掌握。可以通过结晶紫染色实验来确认生物膜的形成，该方法此前已被我们及其他研究者报道；或者，也可在接种前用人血浆预处理培养板，以促进生物膜的形成。生物膜形成后，可筛选可能干扰其形成的潜在碱性磷酸酶（ALP）抑制剂。该结果将为医学领域中生物膜的防控提供重要信息。五摩尔的氢氧化钠在接触时可能具有危险性。操作时务必佩戴个人防护装备。

colorimetric-analysis-alkaline-phosphatase-activity-s-aureus

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

金黄色葡萄球菌生物膜碱性磷酸酶活性的比色法分析

在牙面形成的生物膜具有高度复杂性，并持续暴露于各种内在和外源性的环境挑战中，这些挑战会调控其结构、生理状态及转录组。我们开发了一套工具箱，用于研究口腔生物膜的组成、结构组织及基因表达，该工具箱亦可适用于其他生物膜研究领域。...

用于全面分析由变异链球菌介导的口腔生物膜的生化、结构及转录组学评估工具箱

来源： Vidilaseris, K., 等筛选 Thermotoga maritima 膜结合型焦磷酸酶抑制剂 视频实验杂志 (2019)本视频演示了一种比色法检测，通过定量测定正磷酸盐的释放来筛选细菌膜结合型焦磷酸酶（mPPase）的抑制剂。该方法可用于鉴定抑制海栖热袍菌（Thermotoga...

利用比色法筛选细菌膜结合型焦磷酸酶抑制剂

来源：Tay, S. B., et al. 利用工程化群体感应淬灭乳糖酶实现对致病性生物膜的抗毒力破坏。J. Vis. Exp.

量化酶诱导的病原菌生物膜抑制作用

一种用于研究中性粒细胞与生物膜相互作用的体外实验方法

与真核生物不同，目前关于细菌膜去极化及离子浓度变化的研究较少，这主要是由于细菌体积微小，使得传统的测量方法难以实施。本文详细介绍了利用荧光技术监测重要革兰氏阳性病原菌Streptococcus...

使用荧光染料监测Streptococcus pneumoniae中的膜电位变化、膜完整性及细胞内离子浓度

本文介绍了快速筛选和表征具有抗菌活性酶的实验方案。微载玻片扩散法和染料释放法利用目标细菌作为底物，分别对酶活性进行定性和定量评估。...

定性与定量检测及表征蛋白质类抗菌物质的实验方法

大多数细菌感染都会形成生物膜。由于其所处的环境，与生物膜相关的细菌通常在表型上具有耐药性。因此，开发能够杀灭生物膜中细菌的新型抗菌分子成为当务之急。我们建立了一种检测方法，用于快速筛选可有效清除生物膜的抗菌化合物。...

使用基于刃天青的药物敏感性检测靶向生物膜相关Staphylococcus aureus

本文描述了一种研究5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法（ALA-PDT）对微生物抗菌作用的实验方案 金黄色葡萄球菌 生物膜。该方案可用于开发一种 体外...

一个 体外 研究5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法作用的模型 金黄色葡萄球菌 生物膜

本方案描述了由白色念珠菌（Candida albicans）和变异链球菌（Streptococcus...

利用共聚焦显微镜监测跨物种生物膜中的胞外pH

本文详细介绍了一种利用碱性磷酸酶偶联的ScFv...

利用D11 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白和免疫荧光法直接检测组织中的异构左旋前列腺素

本实验方案描述了中性粒细胞与生物膜相互作用的研究方法。 金黄色葡萄球菌 生物膜形成 体外 并与外周血来源的人中性粒细胞共孵育。通过显微镜检测中性粒细胞在生物膜内的定位，并定量其中性粒细胞的氧化爆发反应。...

标准化 体外 可视化和定量分析人中性粒细胞相互作用的实验方法 金黄色葡萄球菌 生物膜

学习使用96孔板高通量比色法测定金黄色葡萄球菌生物膜中的碱性磷酸酶活性。该方法灵敏可靠，无需蛋白分离，有助于深入理解ALP在生物膜形成中的功能。

S. aureus 生物膜中碱性磷酸酶活性的比色分析

探索更多视频