Name: 测量大鼠传染性偏航的实验室方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 了解大鼠传染性偏航的非侵入性实验方法，通过视觉和嗅觉刺激研究社会行为神经机制。该方法使用透明或半透明隔板控制感官暴露，便于行为学观察与数据分析。

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A. M. 的研究部分由普埃布拉自治大学教学副校长办公室资助。我们特别感谢“Claude Bernard”动物实验中心的工作人员，为我们拍摄提供了大鼠。&#160;我们感谢匿名审稿人对本稿件早期版本提出的宝贵意见。由于他们富有见地的建议，本文的表述更为平实、均衡。

实验方案和动物饲养均按照机构指南进行。
1. 材料
<ol>
	<li>在材料表中查找实施本方法所用材料的完整列表。参考图1并咨询专家建议，以构建倒T形桌、观察笼和笼子隔板。遵循使用锋利工具和潜在危险材料的安全操作规范。</li>
	<li>将两条类似轨道的木条（长45 cm，间距0.6 cm）粘合在一块木板（100 cm × 45 cm × 1.5 cm）的顶部中央，制成倒T形桌。然后将第二块木板（50 cm × 45 cm × 0.6 cm）垂直插入两条轨道状木条之间。确保这块垂直木板能防止一侧的大鼠看到另一侧的大鼠（图1）。</li>
	<li>使用玻璃和有机玻璃制作八个观察笼。确保每个笼子（宽19 cm，长19 cm，高10 cm，厚3 mm）在其一侧的中部有24个等距分布的孔（直径5 mm），排列成三行。该侧使用厚3 mm的有机玻璃制作，并将相对一侧的高度缩短0.7 cm，以便大鼠呼吸。
	<ol>
		<li>确保每个观察笼配备一个可滑动的有机玻璃盖，以防止大鼠在60分钟观察期间直立并分散注意力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用有机玻璃制作四个隔板（宽19 cm，高30 cm，厚3 mm）。在每块透明隔板和每块不透明隔板上钻出24个直径为5 mm的孔，孔的位置需与观察笼上的孔相匹配。</li>
	<li>提前准备数据记录表，用于记录打哈欠行为的发生情况。在每张数据表的表头部分注明观察者姓名、实验条件（即熟悉或不熟悉的大鼠）、相关测试情境（OC、VC、VOC、NVOC）、日期以及观察的起止时间。将数据表其余部分分为两列，每列上方标注大鼠编号，用于记录大鼠的打哈欠行为。</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>从断奶开始至2.5月龄期间，将144只雄性大鼠每4只一组饲养在塑料笼（家居笼）中。不要使用雌性大鼠，因为其行为变异较大，可能与激素周期有关，这种变异易与实验情境的影响相混淆。确保每个笼中的大鼠之间无同胞关系。 
	注意：可能难以同时获得全部大鼠。在此情况下，应建立至少包含8只熟悉大鼠和8只陌生大鼠的区组，以确保每种测试情境在每个实验条件下均至少出现一次30.</li>
	<li>使用商用标记笔在大鼠尾巴上用符号数字进行标记以作区分。例如，通过圆点和线条的组合来表示数字1至4（如，用一个圆点代表数字1，一条线代表数字4）。使用不同颜色区分熟悉的和陌生的大鼠。 
	注意：应按照动物设施工作人员提供的安全指南操作大鼠，并遵守实验所在机构关于正确使用实验动物的建议。</li>
	<li>随机选择哪些饲养笼用于饲养熟悉的实验大鼠组，哪些用于饲养不熟悉的实验大鼠组。例如，假设有16只可用的大鼠，分别饲养在4个饲养笼中：将饲养笼编号为1至4，然后使用R（可从其官网下载）&#160;http://cran.r-project.org/) 如下所示［在提示符之后（&#62;)]: 
	&#62; 样本(4,4) 
	[1] 4 3 2 1
	<ol>
		<li>将熟悉的（或不熟悉的）大鼠分组置于 4 号和 3 号家养笼中，将不熟悉的（或熟悉的）大鼠分组置于 2 号和 1 号家养笼中。确保动物饲养室工作人员保留每只笼子的身份标识，并以与其他大鼠相同的方式进行操作和管理。</li>
		<li>使用R程序再次随机选择大鼠，为每种实验条件下形成配对。确保每对熟悉大鼠来自同一个饲养笼，而陌生大鼠组中的配对则相反，必须来自不同的饲养笼。在每种实验条件下，为每种测试情境随机选择大鼠配对。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天进行两次测试，每次测试包含八种可能测试情境中的两种（每种情境分别用于熟悉的和不熟悉的大鼠，各四次）., 60分钟观察期）。在3小时内连续进行两次测试。 
	注意：为避免混杂因素，所有测试阶段（每天四对大鼠）均需在上午或下午固定时段进行。实验需连续进行两天，每天完成一个完整重复（共八个测试情境）。
	<ol>
		<li>确保在每次实验重复中以随机顺序使用测试情境。例如，使用数字1到8标识每种测试情境，然后按如下方式使用R： 
		&#62;样本(8,8) 
		[1] &#8203;8 7 4 6 5 1 2 3</li>
		<li>将测试情境8和7分配至测试会话1，测试情境4和6分配至测试会话2，依此类推。随后，随机选择每对大鼠（测试情境）所放置的倒T形桌的一侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复相同的步骤（2.3 至 2.4.2）进行第二次重复实验（即., 实验的阻断部分 
	注意：如果研究目的是检验社会条件（即两只相互作用的大鼠）对打哈欠频率的影响，应将一只大鼠置于观察笼中，旁边放置一个空的观察笼，作为四种测试情境中每一种的对照。每种测试情境重复进行2次，共设置八只大鼠作为对照组。</li>
	<li>将前四只大鼠从动物房转移到观察室，以准备测试阶段，让它们在观察室停留15分钟以适应新环境。运输过程中应使用单独的笼具，并在运输及观察室停留期间保持彼此隔离。 
	注意：请遵循动物设施工作人员提供的动物运输安全指南，并穿戴指定的服装在实验室中进行动物操作。大鼠在观察室期间将无法获得食物和水。</li>
	<li>在适应期结束后，将倒T形桌放置在一个较大的矩形桌面上。确保房间内有足够照明的天花板灯，以便进行观察。</li>
	<li>在每个观察笼底部放置滤纸，并将观察笼成对放置于倒T形桌的两侧。在每对观察笼之间放置相应的分隔板。 
	注意：滤纸有助于清理笼子，并提供粗糙的表面，使大鼠移动时不易打滑。</li>
	<li>在两只数码摄像机的架设位置上进行合理布局，确保每台摄像机分别记录一对大鼠的打哈欠行为。务必使摄像机牢固固定于三脚架上，并正确对准观察笼。将两台摄像机连接至台式计算机，以同步监测大鼠的行为。 
	注意：将数字信息存储在U盘上，以永久归档实验会话。使用高存储容量的U盘。</li>
	<li>经过适应期后，将大鼠按照预先确定的分组方案放入观察笼中。调整摄像机的自动对焦，并在启动秒表的同时开始录像。在60分钟观察期结束时，停止录像。 
	注意：尽管实验人员可在测试期间位于房间外并进行远程观察，但仍建议安排一名人员在观察室内（尽可能远离实验区域）实时监控大鼠的行为，以确保测试过程不受干扰地顺利进行。</li>
	<li>观察结束后，将大鼠送回动物房的饲养笼中。请动物房工作人员确保大鼠恢复食物和饮水供应。使用无毒清洁剂彻底清洗观察笼，并准备实验装置，以进行当天的第二次也是最后一次测试阶段。 
	注意：将大鼠放入观察笼后，需清洁木块以去除其留下的任何气味，以免影响后续测试的大鼠的行为。</li>
	<li>安排一至两名对分配的处理方案部分盲化的志愿者，采用全事件记录法识别并记录哈欠行为。确保观察者使用引言部分所述的哈欠定义。</li>
	<li>使用任何标准播放系统在计算机屏幕上回放并投影每个视频。要求观察者观看每个视频，并使用预先准备好的数据表观察和记录哈欠行为，然后允许其以较慢速度重新回放视频，以提高观察和测量哈欠行为的能力。
	<ol>
		<li>请观察者使用类似于以下的记号系统对哈欠进行评分：用竖线表示哈欠的发生，并在竖线上方以分钟数作为上标（例如., |3 ||6 |9，表示第3分钟打1次哈欠，第6分钟打2次哈欠，第9分钟打1次哈欠）。将哈欠行为记为序列形式（例如：1.2、2.2、3.2、5.0、5.8），以更高精度记录（时间精确到小数点后一位）。</li>
		<li>或者，使用标准的数据采集程序将视频中的数据直接输入计算机。确保观察者熟悉此类程序。 
		注意：如有必要，允许观察者在多个时段内分次观看视频。确保同一观察者负责观看对应于同一批实验的所有视频。若由两名不同的观察者分别观看这些视频，则可能因他们在观察和记录哈欠行为能力上的差异，干扰测试情境效应的判断。应对10%–20%的视频进行不同观察者之间的组内信度评分，以确保哈欠行为的标注方式一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据处理
<ol>
	<li>将每只大鼠的哈欠时间序列从数据表转录到电子表格中。确保每只大鼠对应一列，并使用简短的标题（例如., fr1.l 和 fr1.r 分别表示左侧和右侧的第一对熟悉大鼠。通过在空单元格中填入 0，确保所有列的长度相同&#160;或 NA（见下文）。 
	注意：使用所提供的通用指南作为参考 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59289/Supplemental_Material.zip" target="_blank">补充文档</a> 为了充分理解后续的数据处理步骤、测量传染性打哈欠行为以及获得传染性打哈欠曲线。
	<ol>
		<li>如果打哈欠的时间记录精确到分钟，则在每个相应分钟输入打哈欠的次数，并在某分钟内未发生打哈欠时用 0（无打哈欠）填充对应单元格。将工作表保存为文本文件（.txt）。</li>
		<li>如果打哈欠的记录精确到分钟的十分位，则按从上到下的顺序输入序列并使用 &#34;NA&#34; 用于填补列（大鼠）中空缺的位置，其中打哈欠次数（行）少于记录到打哈欠次数（行）最多的大鼠所在列的最大值。将工作表保存为文本文件（.txt）。 
		注意：由于 R 能够处理空单元格，因此工作表可以保存为不同长度的列。请使用 R 提供的帮助选项来处理缺失数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动 R。从数据先前所在的文件中导入数据。</li>
	<li>将程序代码以扩展名保存 &#34;.&#34; （提供为 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59289/Supplemental_Material.zip" target="_blank">补充材料</a>），然后根据哈欠记录为整数或小数的情况，下载相应的程序代码（参见通用指南）。对每对大鼠及所需的时间帧数量运行该程序。
	<ol>
		<li>再次运行程序，此次使用每只大鼠打哈欠次数的随机分布（参见通用指南）。对所有实验条件（即熟悉与不熟悉的大鼠）和/或所有测试情境，均按照相同步骤（步骤3.3至3.3.1）进行操作。依照通用指南中的指示进行，并将结果导出至Excel。 
		注意：无需导入之前保存的程序（如上文建议使用文本编辑器操作），可直接将程序复制并粘贴到 R 的工作空间中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为绘制传染性哈欠曲线，使用先前保存在电子表格中的数据。针对每一对大鼠、每个时间窗口及每种测试情境，用传染率减去非传染率。分别对观测数据和人工（随机分布）数据进行分析。
	<ol>
		<li>接下来，使用自举法（bootstrap procedure）计算每个时间窗口和测试情境下的置信区间（CI）（参见通用指南）。分别对熟悉和不熟悉的实验大鼠进行分析。然后，将每种实验条件下四种测试情境的人工数据合并，并使用自举法计算每个时间窗口的置信区间。</li>
		<li>接下来，为每种测试情况和实验条件创建图表（参见 图2 和 图3最后，进行多元回归分析，以比较不同测试情境下哈欠传染强度的差异（见下文）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cézilly, F. A. History of Behavioural Ecology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aC%C3%A9zilly%2C+FA+%22Behavioural+Ecology%22">Behavioural Ecology</a>. Danchin, E., Giraldeau, L. A., Cézilly, F. , Oxford University Press. 3-27 (2008).</li>
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<li>Provine, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faces+as+releasers+of+contagious+yawning%3A+An+approach+to+face+detection+using+normal+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Psychonomic+Society%22%5BJournal%5D)">Faces as releasers of contagious yawning: An approach to face detection using normal human subjects.</a> Bulletin of the Psychonomic Society. 27 (3), 211-214 (1989).</li>
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<li>Smith, M. L., Hostetler, C. M., Heinricher, M. M., Ryabinin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+transfer+of+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Social transfer of pain in mice.</a> Science Advances. 2, e1600855(2016).</li>
<li>Joly-Mascheroni, R. M., Senju, A., Shepherd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+catch+human+yawns%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dogs catch human yawns.</a> Biology Letters. 4 (5), 446-448 (2008).</li>
<li>Barthalmus, G. T., Zielinski, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+skin+mucus+induces+oral+dyskinesias+that+promote+escape+from+snakes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Xenopus skin mucus induces oral dyskinesias that promote escape from snakes.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 30 (4), 957-959 (1988).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

该方法中有一些关键步骤需要注意，以获得成功的结果。熟悉的实验大鼠在断奶后必须在同一饲养笼中共同生活至少1.5个月，然后才能开始实验。然而，不熟悉的实验大鼠则必须分别饲养在不同的笼中。在两种情况下，配对的大鼠必须来自不同的窝，但年龄应尽可能相近。关于观察笼，其上的孔洞应与隔板上的孔洞对齐，因为这是确保大鼠之间嗅觉接触的唯一方式。另一方面，隔板应足够透明以确保视觉接触，或足够不透明以确保无任何视觉接触。每对大鼠之间的木质隔板必须足够高，以防止一侧的大鼠看到另一侧的大鼠。另一个关键方面是实验的合理设计。一旦怀疑某个过程可能存在偏差，就应采用随机化程序30。
该方法对使用者不应造成严重问题。在玻璃上打孔是面临的主要技术难题，因此改用丙烯酸材料。尽管如此，若获得专业建议，仍可使用玻璃制作完整的观察笼。应确保将孔的边缘打磨光滑，以避免玻璃碎片划伤大鼠。但不建议对主要方法进行修改（例如，将孔扩大）。此外，使用雄性和雌性混合群体可能会增加检测哈欠传染的难度。
此处使用的隔板可能不足以阻止大鼠利用...

传统上，交流行为的研究主要从两个角度展开。一方面，动物行为学家在自然环境中观察并记录动物的行为，试图认识其适应性价值1。这些研究的主要关注点通常并非所涉及的特定感觉或多种感觉。另一方面，生理学家更关注揭示动物交流的机制1；因此，实验室研究提供了探讨感觉模态在交流中所起作用的方法2,3。这两种研究视角实际上是互补的，因为只有同时了解行为的适应性价值和即时机制，才能全面理解动物社会生活中的交流行为。
打哈欠行为是多种脊椎动物行为模式中一个显著的组成部分4，从鱼类到灵长类动物均有表现5。该行为可描述为缓慢张大嘴巴并保持张开状态，随后较快地闭合嘴巴5。整个过程的持续时间因物种而异；例如，灵长类动物打哈欠的持续时间通常长于非灵长类物种6。在许多物种中，雄性打哈欠的频率往往高于雌性，人类除外7。这一特征可能支持打哈欠具有潜在的交流功能，但打哈欠的规律性模式及其每日发生频率也可能提示其具有生理功能。在大鼠中，自发性打哈欠呈现昼夜节律，频率高峰出现在上午和下午8,9。
打哈欠行为的一个有趣特征是其具有传染性（即某种行为的释放刺激恰好是另一只动物表现出相同行为时）10在多种脊椎动物中11,12,13,14,15,16，包括鸟类17 和啮齿类动物18此外，最近的证据表明，传染性打哈欠可能具有交流作用，因为一只大鼠的打哈欠行为在暴露于嗅觉线索时，可影响另一只大鼠的生理状态19然而，哈欠是否具有交流作用仍存在争议。20,21，分析传染性打哈欠是解决这一问题的关键第一步。
另一方面，传染性打哈欠被认为与动物体察其他个体情绪状态的能力有关；因此，亲缘关系较近的个体更易表现出打哈欠的传染现象4。该假说常在实验室条件下进行检验，即通过视频向动物呈现打哈欠的刺激12,13；因此，传染仅能通过视觉线索发生。其他研究则在更自然的环境中，利用动物群体评估打哈欠的传染性14,15。此类研究的主要问题在于，社会性互动的动物通常会响应多种感觉模态共同传递的信号并进行交流。要从这些综合作用中分离出特定行为所依赖的具体感官，并非总是容易实现的任务。通常，研究人员会通过药理学或手术手段阻断动物的某一特定感官功能，进而推断该感官在相关行为中的作用2,3,18,22。幸运的是，还存在其他方法，仅使用物理屏障来允许或阻碍动物之间的交流23,24,25，从而获得更高的生物学有效性。
本文提出的方法专门用于在社会情境下研究熟悉与不熟悉大鼠中的传染性打哈欠行为。根据共情假说，前一组应更容易受到传染性打哈欠的影响。该方法不需要通过手术或药物手段剥夺动物的任何感官功能，而是通过将大鼠放置在带有孔洞的相邻笼子中，并使用带孔或无孔的透明或不透明隔板物理阻断其交流来实现。因此，可考察四种测试条件：（1）嗅觉交流（OC，带孔的不透明隔板）；（2）视觉交流（VC，无孔的透明隔板）；（3）视觉与嗅觉交流（VOC，带孔的透明隔板）；（4）既无视觉也无嗅觉交流（NVOC，无孔的不透明隔板）。因此，研究人员可以比较嗅觉、视觉以及在一定程度上听觉线索在打哈欠传染中的相对作用。这一方法并非全新，类似的方法已被用于分离某些动物（如蜥蜴23和小鼠26）在交流行为中涉及的感官。事实上，Gallup 及其同事27曾使用类似方法证明了视觉线索在虎皮鹦鹉打哈欠传染中的作用。这些方法的主要特点在于模拟社会情境，并尽可能减少对动物造成的应激。此外，使用相互作用的动物可提高研究结论的生物学有效性。
测量传染性打哈欠的方法有多种25,28。Stephen E. G. Lea 博士（个人交流，2015年）帮助我们从数值上改进了一种先前由灵长类动物学家采用的方法13,14，用于对本文所用数据的早期分析18。本实验方案中介绍的是该方法的改进版本，适用范围更广。该方法的核心是根据在特定时间窗口内和窗口外打哈欠所对应的观察时间比例，对大鼠在该时间窗口内和外的打哈欠总次数进行加权处理。
例如，假设对大鼠 A 和大鼠 B 进行 12 分钟的观察，其打哈欠行为被记录到最接近的分钟，并设定 3 分钟的时间窗口以测量传染性打哈欠。接下来，考虑每只大鼠的以下打哈欠序列：大鼠 A（0,0,0,1,0,0,2,0,0,0,2,1）和大鼠 B（0,1,1,0,1,1,0,0,0,0,0,3）。需要注意的是，每个数字（0–3）对应于每分钟记录的打哈欠次数。对于大鼠 A，在第 1、10 和 11 分钟（粗体数字），大鼠 B 在此前 3 分钟（选定的时间窗口）内或该分钟内均未打哈欠。在这几分钟内，大鼠 A 总共打哈欠 2 次。因此，大鼠 A 在无任何打哈欠刺激情况下的打哈欠率（非打哈欠后打哈欠率）为 2/3（即 0.67 次打哈欠/分钟）。在其余的 9 分钟内，大鼠 B 在相同分钟或此前 3 分钟内至少打哈欠一次。大鼠 A 在这 9 分钟内总共打哈欠 4 次。因此，大鼠 A 对打哈欠刺激的响应打哈欠率（打哈欠后打哈欠率）为 4/9（即， 0.44 次打哈欠/分钟）。将相同程序应用于大鼠 B，得到其非打哈欠后打哈欠率为 2/3（即， 0.66），打哈欠后打哈欠率为 5/9（0.55）。
另一方面，如果哈欠时间记录到最接近的分钟小数位，则哈欠传染将导致调整后的哈欠后时间段。例如，在12分钟的观察期内，记录大鼠A和B的哈欠时间如下：大鼠A（2.3、5.1、5.8、10.4、10.8、11.1），大鼠B（1.2、2.4、4.5、5.1、11.2、11.6、11.8）。对于大鼠A，在过去3分钟内大鼠B未发生哈欠的时间段为0至1.2分钟以及8.1至11.2分钟（即3.1分钟），因此非哈欠后时间总计为4.3分钟。大鼠A在这些时间段内哈欠次数为3次（粗体数字），因此非哈欠后哈欠率为3/4.3（即，0.69），而哈欠后哈欠率为3/7.7（即0.38；分母为12-4.3分钟）。同理，对于大鼠B，在过去3分钟内大鼠A未发生哈欠的时间段为0至2.3分钟以及8.8至10.4分钟，总计为3.9分钟。大鼠B在这些时间段内的哈欠次数为1次，因此非哈欠后哈欠率为1/3.9（即，0.25）。相应地，哈欠后哈欠率为6/8.1（即，0.74）。
尽管行为在时间上接近同步是证明传染现象存在的理想标准，但个体注意力的限制、对刺激的反应时间、行为在时间上的分布（例如，打哈欠可能成簇发生）以及适应实验环境所需的时间等因素均存在物种差异，这使得难以采用统一的时间窗口。这可能是研究人员所使用的时间窗口从数秒5到数分钟11不等的原因，进而导致结果比较时出现困难28。因此，建议对一系列时间窗口重复上述实验步骤，以获得打哈欠传染曲线，并比较不同物种之间的打哈欠传染曲线。
通过将每只大鼠在观察期内观察到的哈欠次数随机分布，可以比较等效的哈欠传染曲线。因此，所提出的测量哈欠传染性的方法提供了两种类型的对照：（1）在时间窗口之外发生的哈欠率（非哈欠后时间）以及（2）通过哈欠次数的随机分布获得的人工哈欠传染曲线。因此，这种分析哈欠传染性的方法相较于其他方法更为先进，例如，以往的方法仅比较单一时间窗口内哈欠发生百分比或频率与该窗口外的差异25，而未考虑实际的时间帧。该方法还辅以基于R语言的程序29，可方便且客观地计算一个或多个时间窗口内传染性哈欠发生的概率。
为了说明该方法的实用性以及基于R语言程序的优势，本文使用了一项先前已发表研究18中的数据集。实验条件包括144只雄性大鼠，被分配至熟悉或陌生环境条件中。每种实验条件下的大鼠进一步分为四组，每组包含九对，并暴露于上述四种测试情境中的任意一种。随后，在60分钟的时间内记录每种实验条件和测试情境下大鼠的打哈欠行为。

<table><tbody><tr><td>亚克力隔板</td><td>手工制作</td><td>不可用</td><td>两个隔板（一个透明，一个不透明）各带有24个孔；另外两个隔板（一个透明，一个不透明）无孔。有关构造细节，请参见正文。</td></tr><tr><td>基于R语言的程序</td><td>Benem&amp;eacute;rita Universidad Aut&amp;oacute;noma de Puebla</td><td>不可用</td><td>该程序用于评估大鼠中哈欠的传染性。有关程序使用方法的信息，请参见正文。</td></tr><tr><td>数据记录表</td><td>用户可自行设计</td><td>不可用</td><td>观察者将使用这些表格通过观看视频记录来记录哈欠行为的发生频率。或者，也可以使用笔记本，但需遵循正文中提供的建议。</td></tr><tr><td>台式计算机</td><td>任意厂商</td><td>不可用</td><td>确保计算机配备能够高效处理哈欠行为视频记录的显卡。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>数码摄像机</td><td>任意厂商</td><td>不可用</td><td>用于录制每对大鼠的哈欠行为视频；每次实验会话包含两对大鼠。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>U盘</td><td>任意厂商</td><td>不可用</td><td>每次实验会话持续60分钟，因此需要足够的存储容量来保存视频记录。</td></tr><tr><td>玻璃笼</td><td>手工制作</td><td>不可用</td><td>每个笼子（19 × 19 × 10 cm 高）在其一侧中部设有24个孔（直径0.5 cm），排列成三行。有关其构造的更多细节，请参见正文。建议额外制作一个备用笼子，以防意外损坏。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>记号笔</td><td>Sharpie 或其他任意品牌</td><td>不可用</td><td>用于永久性标记大鼠编号。参见正文了解一种在大鼠尾巴上使用标记符号的方法。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>铅笔</td><td>任意厂商</td><td>不可用</td><td>观察者使用铅笔记录哈欠发生的频率。重要的是，观察者应事先接受过识别哈欠行为及操作视频播放系统的培训。&amp;nbsp;</tr><tr><td>R 软件</td><td>R Development Core Team</td><td>不可用</td><td>可在以下网址下载 R：http://cran.r-project.org/&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>轨道状木条</td><td>手工制作</td><td>不可用</td><td>它们将固定在矩形木板中央，形成一条轨道，用于放置第二块木板。有关构造的附加说明，请参见正文。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>矩形桌</td><td>任意厂商</td><td>不可用</td><td>该桌子（约2 × 1 m）用于放置倒T形桌，以便进行哈欠行为的观察。</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley雄性大鼠</td><td>任一本地实验动物供应商</td><td>不可用</td><td>每组（熟悉与不熟悉大鼠）每种测试情境需要九对雄性大鼠，因为该样本量可确保个体间可能存在的哈欠频率差异不会严重影响对数据进行统计分析所得出的结论。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电子表格软件</td><td>Microsoft</td><td>不可用</td><td>Excel 将用于存储最初记录在数据表上的哈欠记录。请查阅正文，了解推荐的转录方法说明。</td></tr><tr><td>方形滤纸</td><td>任意厂商</td><td>不可用</td><td>用于覆盖笼子底部。</td></tr><tr><td>三脚架</td><td>任意厂商</td><td>不可用</td><td>用于将摄像机固定在每对观察笼前方。</td></tr><tr><td>木质倒T形桌</td><td>手工制作</td><td>不可用</td><td>请阅读正文中的说明以了解其制作方法。如需要，也可使用木材以外的其他材料。请确保所用材料尽可能抵抗超声波的传播，因为大鼠可能利用超声波进行交流。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种测量大鼠传染性打哈欠行为的实验室方法

A Laboratory Method to Measure Contagious Yawning in Rats

交流是动物社会生活中不可或缺的方面。动物之间会相互影响，并聚集成群、 flock 或群体。交流也是两性在求偶期间互动以及竞争个体在不发生打斗的情况下解决争端的方式。然而，对于某些行为模式而言，要检验其是否具有交流功能十分困难，因为这些行为可能涉及多种感觉方式。例如，传染性打哈欠是一种哺乳动物中的交流行为，可能通过视觉、听觉、嗅觉，或这些感官的组合来实现，具体取决于动物之间是否相互熟悉。因此，为了检验此类行为可能具有的交流作用的假设，有必要采用适当的方法来确定所涉及的感觉模态。
本文提出的方法旨在获取熟悉与不熟悉大鼠之间的哈欠传染曲线，并评估视觉和嗅觉感觉模式的相对参与程度。该方法使用低成本材料，稍作调整后也可用于其他啮齿类动物，如小鼠。总体而言，该方法通过将透明隔板（带孔或不带孔）替换为不透明隔板（带孔或不带孔），从而允许或阻止相邻笼具中大鼠之间的交流，相邻笼具的连接侧壁上均设有孔洞。据此可测试四种条件：仅嗅觉交流、仅视觉交流、同时具备视觉与嗅觉交流，以及既无视觉也无嗅觉交流。由于大鼠之间存在社会互动，这些测试条件可模拟自然环境中可能发生的情况。在此方面，本文提出的方法优于依赖视频呈现的传统方法，后者在生物学有效性方面可能存在争议。然而，该方法无法区分听觉、嗅觉和视觉在哈欠传染中可能发挥的不同作用。

实验所用大鼠选自先前建立的Sprague-Dawley大鼠亚系，该亚系经筛选具有频繁打哈欠的特征（平均每小时约22次31）。然而，在每种测试情境中使用的9对陌生雄性大鼠和9对熟悉雄性大鼠（年龄在2.5至3个月之间）平均每小时打哈欠约12次18。因此，用于测量哈欠传染性的测试情境在一定程度上抑制了哈欠行为。
在1至10分钟的不同时间窗口范围内测量了传染性哈欠现象。图2展示了在每个时间窗口和测试情境下，陌生雄性大鼠在传染条件与非传染条件之间哈欠频率的平均差异。这些传染性哈欠曲线表明，只有OC组大鼠（饲养于带有穿孔不透明隔板的笼子中）表现出哈欠传染现象，从第4个时间窗口开始尤为明显，因为其哈欠频率平均值的置信区间（CI）与在60分钟观察期内随机分配的哈欠次数所生成的置信区间无重叠。如预期所示，随机分配每只...

本文所述方法旨在获得熟悉或不熟悉雄性大鼠配对中的传染性呵欠曲线。通过使用带有孔洞的笼子，并以透明或不透明隔板（有孔或无孔）分隔，来检测视觉、嗅觉或这两种感觉线索是否能够诱发呵欠的传染。

交流是动物社会生活中不可或缺的方面。动物之间可能相互影响，并聚集形成鱼群、鸟群和兽群。

本方案的意义在于提供了一种简便的方法，用于探究大鼠中可能参与传染性打哈欠行为的感官机制。该技术的主要优势在于采用非侵入性操作，并配有可加速传染性打哈欠测量计算的应用软件。对于从未操作过该技术的人员而言，只要系统地遵循每一步骤，并在构建观察箱时寻求专业建议，通常不会遇到重大困难。该方法的可视化演示有助于理解实验过程中观察笼的空间排列，从而避免处理指定上的错误。演示该操作流程的将是我实验室的博士后研究员Evelyn Beristain-Castillo。为设置测试阶段，将四只大鼠分别放入单独的笼子中并转移至观察室。在动物适应环境的同时，将一个倒置的 T 形桌放置在一个较大的矩形桌上，并置于可充分照亮房间的天花板灯下方。在每个观察笼底部放置滤纸，并将笼子成对地放置在倒置 T 形桌的两侧。在每对笼子之间放置一个隔板，并战略性地放置两台数码摄像机，使每台摄像机分别记录每对大鼠的打哈欠行为。确认摄像机已牢固固定在三脚架上，并正确对准观察笼后，将摄像机连接到台式计算机，以同步监测大鼠的行为。当动物适应环境15分钟后，按照预先确定的分配方案将其放入观察笼中，并将每台摄像机的自动对焦设置为关闭状态。同时开始视频录制和计时秒表，并在60分钟观察期结束时停止视频录制。观察结束后，将大鼠送回动物房的饲养笼中，正常供应食物和饮水。随后使用无毒清洁剂彻底清洗观察笼，然后准备实验装置，以进行当天后续的测试实验。在最后一次实验结束后，使用任何标准的回放系统在计算机屏幕上回放每个视频，供观察者观看。观察者应首先以正常速度观看每个视频，观察并记录一次哈欠行为到数据表上，随后再以较慢速度重复观看，以便更清晰地观察和测量哈欠行为。在对哈欠行为进行评分时，使用竖线表示哈欠的发生，分钟数以角标形式标注。当完成所有哈欠行为的评分后，将每只大鼠哈欠发生的时间序列转录到电子表格中。如果哈欠行为已记录到最接近的分钟，则在相应分钟处输入该分钟内的哈欠次数，并在某分钟内未发生哈欠时用“0”填充对应单元格。然后将工作表另存为文本文件。如果哈欠的记录精确到分钟的最接近小数位，请按从上到下的顺序输入序列。对于哈欠次数少于列数的大鼠列，请使用 NA 填充空格，行数应以记录到的单只大鼠最大哈欠次数为准。然后将工作表另存为文本文件。当所有数据输入完毕后，将该文本文件导入 R。将程序代码保存为扩展名为 R 的文件，并根据记录的哈欠次数是整数还是小数，下载相应的程序代码。然后针对每一对大鼠以及所需的多个时间帧运行该程序。实验结束后，使用每只大鼠打哈欠次数的随机分布再次运行程序。为了绘制哈欠传染曲线，利用先前保存在电子表格中的数据，针对每对大鼠、时间窗口和测试情境，从传染率中减去非传染率，并分别对观测数据和人工生成的数据进行分析。在此项代表性实验中，测量了陌生雄性大鼠之间在1至10分钟不同时间窗口范围内的哈欠传染情况。这些打哈欠传染曲线表明，只有在笼子之间设有带孔不透明隔板的大鼠之间通过嗅觉交流时，才表现出打哈欠的传染现象。这一点从第四时间窗口开始尤为明显，因为在60分钟观察期内，实际平均值的置信区间与随机分配打哈欠次数的置信区间无重叠。如预期所示，该频带表明，在观察期间对每只大鼠的打哈欠次数进行随机分配时，所产生的打哈欠频率在零值附近波动，且未表现出任何明显模式。在此项以熟悉的雄性大鼠进行的代表性实验中，四种测试情境均未引发哈欠传染，因为它们的置信区间与随机生成的置信区间带重叠。此外，尽管在10个时间窗口内哈欠传染总体呈上升趋势，且该趋势与零斜率存在显著差异，但四种测试情境之间并无差别。请务必记录清楚大鼠之间的熟悉与陌生关系，以便正确解读实验结果，并在每次实验之间清洁观察笼具。可采用药理学方法阻断听觉交流，从而将听觉对传染性打哈欠的影响与其他感官的影响完全分离开来。该技术为比较不同物种间传染性打哈欠提供了途径，既可比较所涉及感官的差异，也可通过比较传染性打哈欠的反应曲线来评估反应强度。请小心操作观察笼，以免其意外破裂造成伤害。

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