利用成熟的细胞隔离试剂盒快速分离脂滴器
2019年4月19日
该方案建立了一种新的方法, 从小鼠肝脏脂滴分离和纯化, 使用一个完善的内质网隔离试剂盒。
脂滴生物学研究因纯化困难而受阻。此外，研究细胞脂质通量需要同时纯化多个细胞器，目前没有简单的协议。该技术的主要优点是使脂滴纯化更容易获得。
我们改进了一个市售套件，以同时从单个样品中分离脂质液滴、内质液和利索索姆。肝脂液滴积累容易使肥胖和酗酒患者患渐进性肝病。这已经把脂质液滴的视野从惰性储物室转移到了动态的生物重要细胞器上。
首先，使用无菌钳子和解剖器将安乐死小鼠腹部的皮肤和肌肉层切在后前轴上，露出肝脏。切开连接肝脏和肠道的韧带。使用钳子，将肠子从肝脏中拉离，朝后体拉去。
切断连接肝脏和隔膜的韧带。然后，在肝脏和背肋之间切开，从前到后，直到肝脏被解放。将肝脏转移到一个冷的五厘米培养皿中，用10毫升的冷1x PBS，在10毫升的1x PBS的摇杆上洗两次肝脏，在4摄氏度下洗涤5分钟。
最后洗涤后，倒掉1x PBS，并使用大小为10的无菌手术刀片将肝脏切成三到五毫米的菜内碎片。然后，用10毫升的冷1x PBS洗两次切碎的肝脏，在4摄氏度下洗涤5分钟。去功能化 1x PBS，将切碎的肝脏片转移到冷的 45 毫升 Dounce 均质器中，确保所有碎片都在底部。
加入7毫升的冷1x IE缓冲液。通过上下移动害虫 20 次，在冰上均质，确保害虫在每笔行程中均质器的底部。将均质转移到冷的15毫升离心管。
用一毫升的冷1x IE缓冲液冲洗均质器，并将其添加到其他均质液中。为了去除核，在1000倍g的高容量离心机中，在4摄氏度下将同质质离心10分钟。确保重新暂停在 15 毫升管顶部收集的任何脂质，以防止 LD 损失。
确保管底的核颗粒不受干扰，将含脂后核上清液转移到新鲜冷的 50 毫升离心管中。将核后上清液的100微升等分转移到冰上1.7毫升的冷微离心管中，供以后进行纯度分析。为了去除线粒体，在4摄氏度下将核后上上提样品以12，000倍g的冷冻高速离心机中离心15分钟。
确保重新在管顶部收集的任何脂质，以防止LD损失，然后将线粒体后全权上看经剂转移到13毫升超离心管。将线粒体后上清液的100微升等分转移到冰上的冷1.7毫升微离心管中，用于以后的纯度分析。用后线粒体上清液填充超离心管，用冷 1x IE 缓冲液填充边缘，以防止它在超离心过程中崩溃。
平衡样品，然后在10万次g的超离心机中离心，在4摄氏度下60分钟。要去除 LD 层，请以 45 度角倾斜管，然后用玻璃移液器吸气。将颗粒转移到冷1.7毫升微离心管后，在脂质层下收集100微升后ER上清液进行纯度分析。
要对任何细胞碎片进行颗粒，以最高速度在微离心机中离心，在摄氏四度时进行五分钟。然后，用手轻轻加热管，帮助重新暂停LD层，并转移上流液，包括脂质层，到一个新的1.7毫升微离心管。重复这些洗涤步骤，加热管两到三次，直到颗粒不再可见。
然后，清洗无颗粒LD上流液，在1.5毫升的最终体积中加入1x PBS，并在最高速度的微离心机中以最高速度离心5分钟，温度为4摄氏度。使用玻璃移液器去除脂层下方的 1x PBS 毫升，而不会干扰脂层。重复 LD 洗涤四到五次，直到 1x PBS 在视觉上透明，无浊度。
然后，使用玻璃移液器去除脂层下方的所有 1x PBS，并使用生成的纯 LD 分数进行下游分析。当从ER套件LD隔离和蔗糖LD分离方法中拍摄出具有代表性的20倍荧光和亮场LD图像时，他们揭示了相似的颗粒物水平，表明使用两种不同协议具有相似的纯化程度。纯化后，使用色度测定法测量LD甘油三酯和蛋白质水平，数据与肝脏重量进行规范化，表明当起始材料正常化时，使用ER试剂盒和蔗糖法，LD甘油三酯和蛋白质产量相似。
使用图像分析软件对LD直径进行量化，表明ER套件LD隔离和蔗糖LD隔离产生了类似尺寸的LD。为了评估LD纯度，通过免疫印迹对样品进行检测，表明从ER试剂盒LD分离和蔗糖梯度协议中提取的LD均具有同等纯度。除 ER 套件 LD 隔离 PER 和蔗糖的 PNS 外，所有样品均检测到 PLIN2，这是 LD 标记。
使用免疫球蛋白对ER分数的纯度分析表明，它们不含LD标记PLIN2，但具有显著的ER SEC61A蛋白水平。还评估了使用利索索姆富集基对利索索姆进行进一步纯化后，糖体部分的纯度。发现是目前我们协议最有用的应用程序。
我们在纯化的细胞器中进行脂质多，并表明脂质毒素在酒精性肝病中的脂质液滴中特别增加。
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概述
本研究建立了一种新的方法来从小鼠肝脏中分离和纯化脂滴，解决了脂滴生物学中面临的挑战。通过修改商业内质网分离试剂盒，该技术能够同时纯化多个细胞器，提高了脂滴研究的可及性。
关键研究组成部分
研究领域
- 脂滴生物学
- 细胞器纯化
- 肝脏疾病研究
背景
- 脂滴从惰性储存转变为动态细胞器。
- 纯化脂滴的挑战阻碍了研究进展。
- 同时纯化细胞器通常不可用。
使用的方法
- 修改内质网分离试剂盒
- 小鼠肝脏作为生物模型
- 超速离心和比色分析用于分析
主要结果
- 使用新方法和传统蔗糖梯度方法得到的脂滴纯度和产率相似。
- 荧光成像和免疫印迹确认了纯度水平。
- 甘油三酯和蛋白质水平的趋势显示产率没有显著差异。
结论
- 新协议使脂滴纯化更易于研究。
- 研究结果对于理解脂滴在肝脏健康和疾病中的功能具有重要贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Lipid droplet isolation remains a bottleneck in studying hepatic steatosis and related metabolic diseases, limiting target validation in liver pathophysiology. This protocol enables simultaneous isolation of lipid droplets, endoplasmic reticulum, and lysosomes from a single mouse liver, supporting mechanistic de-risking in preclinical models. By improving accessibility and reproducibility, it enhances predictive confidence in lipid flux studies relevant to NAFLD and ALD therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid droplet-associated proteins like PLIN2 to validate targets in hepatic lipid metabolism.
- Operational Value: Reduces reagent preparation time using commercially available kits, increasing throughput for target screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides purified organelles for quantitative lipid and protein assays, supporting assay standardization.
- Operational Value: Allows parallel isolation of ER and lysosomes, enabling multiplexed readouts from a single sample.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by linking lipid droplet composition to alcoholic liver disease models.
- Operational Value: Facilitates longitudinal studies of lipid flux and organelle crosstalk in preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling lipid droplet purification prior to lead identification and mechanistic profiling in liver disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lipid droplet protein composition and functional validation of targets like PLIN2.
- Screening: Delivers reproducible organelle isolates suitable for biochemical and imaging-based assays.
- Analytics: Enables triglyceride, protein, and lipidomic readouts that help compare conditions across disease models.
- Translational Research: Connects isolation to preclinical continuity by linking lipid droplet purity to hepatic steatosis phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multi-organelle isolation across liver-focused discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity in lipid droplet isolation.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through use of a validated commercial kit.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by enabling early de-risking of lipid-mediated toxicity.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of compounds affecting lipid homeostasis in liver disease.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization and differential centrifugation.
- Depends on access to ultracentrifugation and microcentrifuge equipment.
- Necessitates standardization of washing steps to ensure lipid droplet purity across users.
- Must account for tissue-specific adaptations when applying to non-liver models.
- Limited by the need for careful handling to prevent lipid loss during resuspension steps.
