Name: 富德瑞迪蒂菲洛波迪亚成分的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学习利用TLCN与vitronectin亲和性从培养海马神经元中纯化树突丝状伪足富集组分的方法。该技术可识别未成熟突触相关活性蛋白，助力神经可塑性及突触发育机制研究。

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我们感谢Shigeo Okabe和Hitomi Matsuno提供的海马神经元低密度培养，Masayoshi Mishina提供的TLCN缺陷型小鼠，Sachiko Mitsui和Momoko Shiozaki提供的技术协助，以及Yoshihara实验室成员的有益讨论。本研究由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（Grant Nos. JP20700307、JP22700354 和 JP24500392）以及文部科学省（MEXT）科学研究费补助金（Grant Nos. JP23123525 资助YF，JP20022046、JP18H04683 和 JP18H05146 资助YY）提供支持。

本文所描述的所有方法均已获得理化学研究所和光分所机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 海马神经元的培养
<ol>
	<li>培养基的制备
	<ol>
		<li>200倍维生素混合液的制备。使用磁力搅拌器将100 mg D-泛酸钙半钙盐、100 mg 氯化胆碱、100 mg 叶酸、180 mg 肌醇（i-inositol）、100 mg 烟酰胺、100 mg 盐酸吡哆醛和100 mg 盐酸硫胺素溶解于500 mL超纯水中。溶液不会完全溶解。小心混匀后，分装至50 mL离心管中，于-20 °C保存。</li>
		<li>核黄素溶液的制备。使用磁力搅拌器将100 mg核黄素溶解于500 mL超纯水中。溶液不会完全溶解。小心混匀后，分装至50 mL离心管中，于-20 °C保存。</li>
		<li>1 M CaCl2溶液的制备。使用磁力搅拌器将7.35 g CaCl2·2H2O溶解于50 mL超纯水中。</li>
		<li>最低必需培养基（Minimum essential medium, MEM）的制备。使用磁力搅拌器将400 mg KCl、6800 mg NaCl、2200 mg NaHCO3、158 mg NaH2PO4·2H2O、7000 mg D-葡萄糖和200 mg MgSO4·7H2O溶解于950 mL超纯水中。</li>
		<li>使用1 mL移液器，在磁力搅拌下逐滴向MEM中加入1.8 mL 1 M CaCl2。用1 mol/L HCl将MEM的pH调节至7.25。</li>
		<li>向MEM中加入5 mL 200倍维生素混合液和200 μL核黄素溶液。用超纯水定容至1000 mL。使用0.22 μm滤器系统过滤溶液，并于4 °C保存。</li>
		<li>10倍DNase-I储备液的制备。将100 mg DNase-I溶解于12.5 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，经0.22 μm滤器过滤后，分装至1.5 mL离心管中，于-20 °C保存。</li>
		<li>阿糖胞苷（cytosine β-D-arabinofuranoside, Ara-C）储备液的制备。将25 mg Ara-C溶解于8.93 mL超纯水中（终浓度为10 mM），经0.22 μm滤器过滤后，分装至1.5 mL离心管中，于-20 °C保存。</li>
		<li>铺板培养基的制备。在50 mL离心管中混合1 mL MEM氨基酸溶液、750 μL 1 M HEPES、1 mL B27、125 μL 200 mM谷氨酰胺、250 μL青霉素/链霉素和2.5 mL胎牛血清（FBS），并用MEM补足至44.375 mL。</li>
		<li>终止培养基（Stop medium）的制备。在50 mL离心管中混合1 mL MEM氨基酸溶液、750 μL 1 M HEPES、5 mL FBS（终浓度10%），并用MEM补足至43.25 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多聚-L-赖氨酸包被培养皿的制备
	<ol>
		<li>在25 °C条件下，用0.2 mg/mL多聚-L-赖氨酸氢溴化物包被35 mm塑料细胞培养皿，孵育1天。 
		注意：不可使用多聚-L-赖氨酸替代多聚-L-赖氨酸氢溴化物。</li>
		<li>用2 mL超纯水清洗培养皿3次。加入1.5 mL终止培养基，在25 °C孵育直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从小鼠胚胎中分离海马神经元
	<ol>
		<li>海马神经元的组织来源。根据Lu等人的方法19，在胚胎第16-17天从小鼠C57BL6/J野生型及TLCN缺陷型中分离海马组织。</li>
		<li>将分离的海马组织置于含15 mM HEPES（pH 7.2）的HBSS中，加入0.25%胰蛋白酶和1倍浓度DNaseI，在37 °C振荡孵育15分钟（每3分钟振荡一次）。移除溶液。将海马组织转移至10 mL终止培养基中，在4 °C孵育5分钟以灭活胰蛋白酶。</li>
		<li>将海马组织转移至10 mL新鲜终止培养基中，在4 °C孵育5分钟。再次转移至另一份10 mL新鲜终止培养基中，在4 °C再孵育5分钟。随后将海马组织转移至含有900 μL终止培养基和100 μL 10倍DNaseI的15 mL离心管中。使用1 mL移液器吹打20次，使海马组织解离为单个神经元。 
		注意：解离过程中，1 mL移液器的枪头应轻微接触15 mL离心管底部。</li>
		<li>加入9 mL铺板培养基，并通过70 μm细胞筛过滤至50 mL离心管中。使用血细胞计数板计数细胞，并用铺板培养基将细胞浓度调整为3.5 × 104 个/mL。</li>
		<li>吸除多聚-L-赖氨酸包被培养皿中的终止培养基。将细胞以每皿7 × 104 个细胞（2 mL/皿）的密度接种至多聚-L-赖氨酸包被的培养皿中。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育60–64小时后，向神经元中加入2 μL Ara-C储备液（终浓度10 μM），并缓慢摇动培养皿。将培养皿置于湿润培养盒中，在37 °C、5% CO2条件下继续培养，期间不更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 富集树突丝状伪足组分的纯化
<ol>
	<li>体外培养13天（DIV）后，向含有培养神经元的20个培养皿中加入磁性聚苯乙烯微珠（每皿3 × 106个颗粒）。1天后，用1 mL PBS振荡洗涤3次，以去除培养基和未结合的微珠。去除PBS后，每皿加入500 μL裂解缓冲液（含0.01% Triton X-100、无EDTA蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物的PBS）裂解神经元。</li>
	<li>用细胞刮收集裂解液，并转移至低蛋白吸附的微量离心管中（共10管）。将离心管置于磁力分离器上，静置1分钟。收集上清液，作为未结合组分用于银染和Western blot分析。</li>
	<li>将微珠转移至新的低蛋白吸附微量离心管中，置于磁力分离器上，彻底去除上清液。加入500 μL裂解缓冲液，使用涡旋混合器振荡15秒洗涤微珠。将离心管置于磁力分离器上，静置1分钟，去除上清液后再加入500 μL裂解缓冲液。重复洗涤微珠10次，每次均去除上清液。</li>
	<li>通过加入50 μL 1× SDS上样缓冲液（62.5 mM Tris HCl，pH 6.8，2.5% SDS，10%甘油）洗脱结合在微珠上的蛋白质（即结合组分），并将离心管在98 °C下煮沸5分钟。以860&#160;x g离心10秒，然后将离心管置于磁力分离器上静置1分钟。收集上清液，作为结合组分。 
	注意： 此处可暂停实验流程。</li>
	<li>使用BCA蛋白定量法测定未结合组分和结合组分的蛋白浓度。加入溴酚蓝以可视化蛋白溶液，并将浓度调整至5 ng/μL，用于SDS-PAGE分析。</li>
</ol>
3. 银染色与蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>使用5-20%的梯度凝胶通过SDS-PAGE分离结合与未结合组分（50 ng），并对凝胶进行银染。</li>
	<li>采用抗TLCN-C（1/3,000）、抗牛连蛋白（1/5,000）、抗肌动蛋白（1/1,000）和抗α-微管蛋白（1/1,000）作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1/5,000）作为二抗进行Western印迹。使用化学发光Western Blot检测试剂和化学发光成像仪检测抗原。</li>
</ol>

<ol><li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li>
<li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li>
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<li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin+slows+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li>
<li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li>
<li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li>
<li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin%3A+a+neuronal+area+code+molecule%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Telencephalin: a neuronal area code molecule?</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li>
<li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li>
<li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li>
<li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li>
<li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27(2018).</li>
<li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density%2C+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li>
<li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们开发了一种利用细胞黏附分子TLCN与细胞外基质蛋白vitronectin之间的亲和力来纯化富含树突丝状伪足组分的方法。与突触后密度（PSD）组分相比，通过富含树突丝状伪足的组分可能鉴定出在未成熟突触中发挥作用的突触蛋白。因此，富含树突丝状伪足组分的组成与PSD组分相比有74%的不同。与PSD组分不同，我们使用培养的海马神经元以主动形成吞噬杯，且细胞必须保持活性。为了形成吞噬杯，我们利用了TLCN与vitronectin之间的相互作用。TLCN的表达局限于端脑，因此我们无法使用小脑来源的培养神经元。然而，如果我们用不同的蛋白质包被微珠，则这种依赖于活性的纯化方法也可应用于小脑神经元。例如，当将包被有谷氨酸受体delta2亚基N端结构域的微珠应用于小脑颗粒细胞时，可从结合蛋白中鉴定出突触前蛋白neurexin和cbln1。因此，只要更换包被蛋白，这种依赖于活性的方法即可被应用。由于vitronectin包被的微珠难以有效进入脑切片和脑组织，吞噬杯的形成效率较低。因此，未来的研究任务包括开发从脑切片和脑组织中纯化富含树突丝状伪足组分的方法。
本实验方案中，海马神经元采用低密度培养条件...

树突丝状伪足被认为是树突棘的前体。树突丝状伪足中的肌动蛋白丝调控其延伸与回缩1,2,3。在与轴突接触后，部分树突丝状伪足开始成熟为树突棘，并形成突触4,5。树突棘的组分已通过突触后密度组分的全面分析得以确定6,7，而树突丝状伪足的组分在很大程度上仍不清楚。已有研究表明，端脑蛋白（telencephalin, TLCN）、ERM、SynGAP、Ras、PI3激酶、Akt、mTOR、极光样激酶2（polo-like kinase 2）、CaMKII、syndecan-2、paralemmin-1、ARF6以及EphB可调控树突丝状伪足的形成5,8,9,10,11，但目前尚未建立针对树突丝状伪足中存在分子的全面分析方法。
TLCN（ICAM-5）特异性表达于最前端脑段——端脑的棘状神经元中12。TLCN在其胞外区含有9个类免疫球蛋白结构域，以及一个跨膜区和一个胞质尾区13。TLCN在其胞外区与玻璃粘连蛋白（VN）和LFA-1整合素结合，在跨膜区与早老素结合，在胞质区与磷酸化ERM蛋白和α-辅肌动蛋白结合5,8,14,15,16。TLCN通过树突丝状伪足尖端的磷酸化ERM蛋白以及棘突和树突干中的α-辅肌动蛋白与肌动蛋白细胞骨架结合8,16。
我们发现，TLCN 的过表达可增强树突丝状伪足的形成，并诱导树突棘向丝状伪足逆转10。Ezrin 的组成性活性形式可结合 TLCN 的胞内区，并促进树突丝状伪足的形成8。因此，TLCN 通过肌动蛋白结合蛋白调控树突丝状伪足的形成。Esselens 等人证明，微珠可诱导 TLCN 在培养神经元上的聚集17。我们发现，在 VN 包被的微珠周围，神经元树突上以 TLCN 依赖的方式形成吞噬杯结构15。树突丝状伪足的组成成分与吞噬杯相似。尽管收集树突丝状伪足较为困难，但使用磁性微珠相对更容易收集吞噬杯。因此，我们建立了一种通过纯化吞噬杯来替代纯化树突丝状伪足的方法18。本文中，我们描述了富含树突丝状伪足组分的纯化方法。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 低吸附MCT管</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39640T</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>2530149</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 塑料细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>抗肌动蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5060</td><td></td></tr><tr><td>抗α-辅肌动蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5044</td><td></td></tr><tr><td>抗α-微管蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9026</td><td></td></tr><tr><td>抗Ezrin抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>克隆号3C12, SAB4200806</td><td></td></tr><tr><td>抗Galphaq抗体</td><td>Santacruz</td><td>sc-393</td><td></td></tr><tr><td>抗MAP2抗体</td><td>Chemicon</td><td>克隆号AP20, MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>抗Moesin抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>克隆号38/87, M7060</td><td></td></tr><tr><td>抗PLCbeta1抗体</td><td>Santacuz</td><td>sc-5291</td><td></td></tr><tr><td>抗PSD95抗体</td><td>MA2</td><td>ABR</td><td></td></tr><tr><td>抗血影蛋白β抗体</td><td>Chemicon</td><td>MAB1622</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Merck</td><td>1.08122.0005</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（水合）</td><td>Wako</td><td>038-19735</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>氯化胆碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>完全型无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6645</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>D-泛酸半钙盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2磁力架</td><td>Thermo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime化学发光检测试剂</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE梯度凝胶</td><td>ATTO</td><td>E-T520L</td><td></td></tr><tr><td>叶酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的抗兔IgG抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>LAS-1000 mini</td><td>Fuji Film</td><td>LAS-1000 mini</td><td>用于WB膜发光信号检测</td></tr><tr><td>磁性聚苯乙烯微珠</td><td>Sperotech</td><td>PM-20-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM氨基酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11130-051</td><td>含30 mM盐酸L-精氨酸、5 mM L-胱氨酸、10 mM盐酸L-组氨酸·H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、20 mM L-异亮氨酸、20 mM L-亮氨酸、19.8 mM盐酸L-赖氨酸、5.1 mM L-甲硫氨酸、10 mM L-苯丙氨酸、20 mM L-苏氨酸、2.5 mM L-色氨酸、10 mM L-酪氨酸和20 mM L-缬氨酸</td></tr><tr><td>小型板式电泳系统</td><td>ATTO</td><td>AE-6530</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Nacali</td><td>28360-14</td><td></td></tr><tr><td>盐酸吡哆醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6155</td><td></td></tr><tr><td>核黄素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9504</td><td></td></tr><tr><td>Wako银染试剂盒2</td><td>Wako</td><td>291-5031</td><td></td></tr><tr><td>盐酸硫胺素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD半干转印系统</td><td>Bio-rad</td><td>1703940JA</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>MilliQ</td><td></td><td>用于制备超纯水</td></tr></tbody></table>

富含树突丝状伪足组分的纯化

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

树突丝状伪足是基于肌动蛋白丝的细长突起，它们不断伸长和回缩，仿佛在寻找目标轴突。当树突丝状伪足与目标轴突建立接触后，便开始成熟为树突棘，进而形成突触。端脑蛋白（Telencephalin, TLCN）在树突丝状伪足中高度富集，而在树突棘中则逐渐被排除。在培养的海马神经元中过表达TLCN可诱导树突丝状伪足的形成。我们发现，端脑蛋白能强烈结合细胞外基质分子——玻璃粘连蛋白（vitronectin）。包被有玻璃粘连蛋白的微珠可在神经元树突上诱导吞噬杯结构的形成。在吞噬杯结构中，TLCN、TLCN结合蛋白（如磷酸化的Ezrin/Radixin/Moesin，即phospho-ERM）以及F-肌动蛋白均发生聚集，提示吞噬杯的组成成分与树突丝状伪足相似。因此，我们建立了一种以纯化吞噬杯替代纯化树突丝状伪足的方法。将磁性聚苯乙烯微珠包被玻璃粘连蛋白（该蛋白在海马神经元培养基中含量丰富，并可诱导神经元树突上吞噬杯的形成），在孵育24小时后，用温和的去垢剂溶解吞噬杯结构，并利用磁力分离器进行收集。洗涤微珠后，洗脱结合蛋白，并通过银染和Western印迹分析其成分。在结合组分中，TLCN和肌动蛋白含量丰富。此外，该组分中鉴定出的许多蛋白质均定位于树突丝状伪足；因此，我们将该结合组分命名为树突丝状伪足富集组分。本文详细描述了树突丝状伪足富集组分的纯化方法。

在培养的海马神经元中，TLCN 大量定位于树突丝状伪足、主干和胞体，并与 F-actin 共定位（图1A，B）。当将聚苯乙烯微珠添加到培养的海马神经元中时，微珠会自动包被培养基中胎牛血清（FBS）来源的玻璃粘连蛋白（VN）；微珠主要与树突结合，并诱导吞噬杯的形成（图1B-）。吞噬杯基于树突上微珠周围的片状肌动蛋白丝。TLCN、磷脂酰乙醇胺-ERM 和 PI(4,5)P₂2，这些是树突丝状伪足的标记物，在小珠周围高度聚集（图1D)8,15吞噬杯仅在野生型海马神经元上形成，而不在TLCN缺陷型海马神经元上形成（图 2A-...

在本实验方案中，我们介绍了一种利用树突丝状伪足黏附分子TLCN与细胞外基质分子玻璃粘连蛋白（vitronectin）之间特异且强效的亲和力，从培养的海马神经元上具有吞噬杯样突起结构中纯化富含树突丝状伪足组分的方法。

树突丝状伪足是基于肌动蛋白丝的细长突起，能够伸长和回缩，仿佛在寻找目标轴突。当……

与PSD组分相比，有可能鉴定出在富含树突丝状伪足的组分中作用于未成熟突触的突触蛋白。我们利用活神经元诱导吞噬帽的形成。该技术的主要优势在于，可从富含树突丝状伪足的组分中鉴定出在人工发生过程中具有活性的蛋白质。首先，通过将 100 mg 泛酸（Vitamin B5）、100 mg 氯化胆碱（Choline Chloride）、100 mg 叶酸（Folic Acid）、180 mg 肌醇（I-inositol）、100 mg 烟酰胺（Vitamin B3）、100 mg 盐酸吡哆醇（Vitamin B6 hydrochloride）和 100 mg 盐酸硫胺素（thiamine hydrochloride）溶于 500 ml 超纯水中，并使用磁力搅拌器搅拌，配制 200 倍维生素混合液。将溶液分装至 50 ml 离心管中，混匀后于 20 摄氏度保存。为配制核黄素（riboflavin）溶液，将 100 mg 核黄素溶于 500 ml 超纯水中，并使用磁力搅拌器充分溶解。将分装样品在50 ml离心管中轻轻混匀，并于20摄氏度保存。配制1摩尔氯化钙溶液时，使用磁力搅拌器将7.35克二水合氯化钙溶解于50 ml超纯水中。配制最低必需培养基（Minimum Essential Medium）时，使用磁力搅拌器将400 mg氯化钾、800 mg氯化钠、2,200 mg碳酸氢钠、158 mg一水合磷酸二氢钠、7,000 mg D-葡萄糖、200 mg七水合硫酸镁溶解于950 ml超纯水中。接下来，使用1 ml移液器，在磁力搅拌器持续搅拌的条件下，逐滴将1.8 ml的1摩尔氯化钙加入MEM中。然后加入盐酸，将MEM的pH值调节至7.25。随后，向MEM中加入5 ml的200倍维生素混合液和200微升的核黄素溶液。用超纯水将溶液定容至 1000 ml。使用 0.22 微米滤器系统过滤溶液，并在 4 摄氏度下保存。配制 10 倍浓度 DNase-1 储存液时，将 100 mg DNase-1 溶解于 12.5 ml HBSS 中。使用0.22微米滤器过滤，分装至1.5 ml离心管中，并将离心管置于20摄氏度保存。配制Ara-C储存液时，将25 mg Ara-C溶解于8.93 ml超纯水中。使用0.22微米滤器过滤，分装至1.5 ml离心管中，并于20摄氏度保存。配制铺板培养基时，取1 ml MEM氨基酸溶液、750微升1摩尔HEPES、1 ml B27、125微升200毫摩尔谷氨酰胺、250微升青霉素-链霉素、2.5 ml胎牛血清和44.375 ml MEM，加入50 ml离心管中混合均匀。配制终止培养基时，取1 ml MEM氨基酸溶液、750微升1摩尔HEPES、5 ml胎牛血清和43.25 ml MEM，加入50 ml离心管中混合均匀。配制含15毫摩尔HEPES的HBSS溶

purification-of-the-dendritic-filopodia-rich-fraction

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科研

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Neuroscience

神经科学

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富含树突丝状伪足组分的纯化

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