Name: 乳腺辐照有机体的生长与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 了解小鼠乳腺类器官的培养与辐照表征方法，用于研究电离辐射对肿瘤细胞募集的影响。该模型有助于揭示三阴性乳腺癌复发机制及肿瘤免疫相互作用。

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感谢 Laura L. Bronsart 博士提供表达 GFP 和 dTomato 的 RAW 264.7 巨噬细胞。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 #R00CA201304 提供经费支持。

动物实验均遵循范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准的机构指南和方案进行。
1. 小鼠准备与细胞获取（改编自 Nguyen-Ngoc 等人11）
<ol>
	<li>使用 CO2 窒息法处死裸鼠（Nu/Nu，8-10 周龄），随后进行颈椎脱位。用 70% 乙醇清洁皮肤。</li>
	<li>使用预先灭菌的剪刀和镊子切除小鼠的腹部和腹股沟乳腺组织。在切除前去除淋巴结。用无菌的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织（图 1A）。</li>
	<li>将组织放入含 10 mL DMEM/F12 培养基的 15 mL 离心管中用于运输。样品可在 4 °C 保存过夜，或立即处理。处理过程中保持冰上操作。</li>
	<li>使用铯源对样品进行 20 Gy 的照射（图 1B）。</li>
	<li>照射后 45 分钟，将乳腺组织置于 35 mm 无菌细胞培养皿中，用手术刀切碎（图 1C,D）。大约切 40 次，直至组织松散，获得面积不超过约 1 mm2 的组织碎片。</li>
	<li>将组织转移至含胶原酶溶液的 50 mL 离心管中。胶原酶溶液由 2 mg/mL 胶原酶（见 材料表）、2 mg/mL 胰蛋白酶、5% v/v 胎牛血清（FBS）、5 μg/mL 胰岛素和 50 μg/mL 庆大霉素溶于 DMEM/F12 培养基中组成。每只小鼠使用 10 mL 胶原酶溶液。</li>
	<li>将离心管置于 37 °C 水浴中，每 10 分钟涡旋震荡一次，持续 30-60 分钟。当胶原酶溶液变浑浊时，表明消化完成（图 1E,F）。</li>
	<li>在室温（RT）下以 450 × g 离心 10 分钟。可见三层结构：上层为脂肪，中层为水相溶液，下层为沉淀。沉淀呈红色，为上皮细胞、单个基质细胞和红细胞的混合物（图 1G）。</li>
	<li>在接触前，使用牛血清白蛋白（BSA）溶液预包被所有移液管、移液枪头和离心管。BSA 溶液由 2.5 w/v % BSA 溶于杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中组成。预包被时，只需将 BSA 溶液加入移液枪头和离心管内壁，随后吸出即可。BSA 溶液可重复使用，但每次实验前应进行无菌过滤。</li>
	<li>为提高回收率，将上清液转移至新的经 BSA 包被的 15 mL 离心管中。剧烈吹打以分散脂肪层。在室温下以 450 × g 离心 10 分钟。吸走上清液，管内保留少量培养基，避免吸走细胞沉淀。</li>
	<li>从含有原始沉淀的离心管中吸除水相层。</li>
	<li>向含有原始沉淀的离心管中加入 10 mL DMEM/F12 培养基，并转移至第二个离心管中。剧烈吹打以混合并重悬两个沉淀。</li>
	<li>在室温下以 450 × g 离心 10 分钟。吸走上清液，向管中加入 4 mL DMEM/F12 培养基。</li>
	<li>向悬浮液中加入 40 μL 脱氧核糖核酸酶（DNase），在室温下手动轻轻摇晃 2-5 分钟。DNase 溶液由 4 U/mL DNase 溶于 DMEM/F12 培养基中组成。</li>
	<li>加入 6 mL DMEM/F12 培养基并充分吹打。在室温下以 450 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液吸至 0.5 mL 刻度线处。用 10 mL DMEM/F12 培养基重悬沉淀，并充分吹打。</li>
	<li>短暂离心至 450 × g，达到该转速后 4 秒停止。</li>
	<li>重复步骤 1.16–1.17 三次，通过离心差速分离法进一步纯化类器官。此时沉淀应呈乳白色，仅由上皮类器官组成（图 1H）。 
	注意：也可使用无菌 40 μm 网格滤器过滤类器官。在完成步骤 1.16 后，将含有类器官的培养基通过滤器吹入离心管，再用 5 至 10 mL DMEM/F12 培养基冲洗。将滤器翻转至新的 50 mL 离心管上方，从反方向加入 10 mL DMEM/F12 培养基冲洗，以回收截留物。截留物应为类器官，而滤过液主要含基质细胞，可根据需要丢弃或保留。</li>
</ol>
2. 确定类器官的密度并进行铺板
<ol>
	<li>用 10 mL DMEM/F12 重悬沉淀，充分吹打以形成均一溶液。</li>
	<li>取 50 µL 转移至 30 mm 培养皿中，在 20 倍相差显微镜下观察，使用计数器统计类器官数量。 
	注意：此处所用移液器吸头的最小直径始终为 457 μm，约为接种类器官直径的 5–10 倍。当转移体积为 2 mL 或更大时（例如步骤 1.16 和 2.1），应使用尖端直径超过 1,500 μm 的刻度移液管。</li>
	<li>使用以下公式计算类器官密度： 
	<img alt="计算管中类器官浓度的公式，以比例图形式显示。" src="/files/ftp_upload/59293/59293eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式"> 
	目标密度为 1,000 个类器官/mL，以便后续稀释。若密度过低，则在 450 × g 离心 5 分钟，吸除培养基，加入适量培养基使浓度达到 1,000 个类器官/mL，并充分吹打形成均一混合液。
	<ol>
		<li>若需在蛋白基质中培养类器官，应将类器官以 1 个/μL 的浓度接种于稀释至 87% 的 I 型胶原或 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤来源的基底膜提取物中。操作过程中样品应始终保持在冰上。</li>
		<li>若需冻存类器官，将所需体积转移至另一离心管中，在 450 × g 离心 5 分钟，吸除培养基后加入等体积的 90% FBS/10% DMSO。重悬类器官后分装至冻存管中，先置于 -80 ˚C，一周内转移至液氮中保存。</li>
		<li>解冻时，于 37 ˚C 水浴中温育 1 分钟。在 450 × g 离心 5 分钟后吸除冻存液，用无菌 DPBS 洗涤一次，再次离心。吸除 DPBS 后加入类器官培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 50 µL（含 50 个类器官）吹打加入低吸附培养板的每孔中（图 1I）。</li>
	<li>每孔加入 150 µL 类器官培养基，使工作总体积达到 200 µL。类器官培养基由含 1% 青霉素-链霉素和 1% 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）的 DMEM/F12 培养基组成。</li>
	<li>每隔 2 天小心更换培养基。 
	注意：低吸附培养板未经组织培养处理，细胞易于脱落。吸除培养基时应倾斜培养板，并将移液器吸头置于每孔边缘缓慢吸取，保留少量培养基于孔底。添加新培养基时应缓慢，避免对类器官施加不必要的剪切力。</li>
</ol>
3. 与巨噬细胞共培养
<ol>
	<li>在补充有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养GFP或dTomato标记的RAW 264.7巨噬细胞。将1 × 104、5 × 104或1 × 105个细胞/mL接种至类器官培养基中。</li>
	<li>利用活细胞相差显微镜和荧光成像技术随时间监测巨噬细胞的浸润情况。</li>
</ol>
4. 类器官的免疫荧光染色
注意：类器官可以在低吸附孔板中进行染色，也可以转移至腔室载玻片。如需转移，需用移液器轻柔吹打，直至类器官从培养板上脱离。将类器官转移至腔室载玻片，并孵育4–8小时，使其贴附于板面。
<ol>
	<li>小心吸除孔中的类器官培养基，加入10%中性缓冲福尔马林，在室温下固定15分钟。</li>
	<li>用1× PBS洗涤3次，每次5分钟。如需要，固定后的样品可在4 °C保存一周，用于后续染色。</li>
	<li>用0.1% 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇处理5分钟进行通透。 
	注意：若需对F-肌动蛋白（F-actin）染色，请将样品在含1:1,000稀释的鬼笔环肽（phalloidin）和1.67 nM双苯并咪唑核染料的1% PBS/BSA溶液中，室温孵育1小时，然后进入步骤4.8。</li>
	<li>用0.5× PBS进行平衡。样品可在4 °C保存，用于后续成像分析，包括明场图像和免疫荧光图像。用含5%正常山羊血清的0.1% PBS/聚山梨酯（PBST）在室温封闭1小时。用PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>在含1% NGS的PBST中，加入抗细胞角蛋白14（Anti-Cytokeratin 14，1:1,000稀释）、E-钙黏蛋白（E-Cadherin，1:200稀释）或紧密连接蛋白1（Tight Junction Protein One，1:100稀释）抗体，室温孵育1小时。用PBST洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入1% NGS/PBST稀释的山羊抗兔二抗（1:200稀释），室温孵育1小时。用铝箔包裹以避免光照。</li>
	<li>用PBS洗涤3次，每次5分钟。使用核染料（见材料表）对细胞核进行染色。</li>
	<li>用PBS洗涤3次，每次5分钟。若使用腔室载玻片，加盖盖玻片封片。用铝箔包裹后于4 °C保存，最长可保存2周。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们建立了一种可重复地培养和表征经辐照的乳腺类器官的方法（图1）。采用20 Gy的辐照剂量，以模拟既往关于肿瘤细胞募集的体内模型5。在乳腺类器官形成前，对乳腺组织进行离体辐照，可单独研究辐射损伤效应，同时避免免疫细胞的继发性浸润。建立体外辐照正常组织模型，可实现实时观察可能参与辐射诱导循环肿瘤细胞（CTC）募集的细胞间相互作用11,12。
严格遵循步骤1.5至1.18对于最大化类器官产量至关重要。我们将浓缩的胶原酶冻存分装液加入消化液中。由于浓缩胶原酶分装液具有高度黏稠性，其加入量可能存在一定差异，从而导致酶活性波动，因此必须密切监测类器官的消化过程，以避免过度消化。使用50 mL离心管进行类器官消化也十分重要，因为这可提供均匀的消化表面积。其他研究曾采用过滤法纯化类器官19,</sup...

大约60%的三阴性乳腺癌（TNBC）患者选择保乳治疗（BCT）作为治疗方式1。在这种治疗模式中，含有肿瘤的部分乳腺组织被切除，周围正常组织则接受电离辐射，以杀灭任何残留的肿瘤细胞。该治疗可降低大多数乳腺癌患者的复发风险；然而，约13.5%的TNBC治疗患者会出现局部区域复发2。因此，研究辐射如何招募循环肿瘤细胞（CTCs），将有助于深入理解局部复发的机制3,4。
既往研究表明，正常组织受到辐射会增加多种细胞类型的募集5。在三阴性乳腺癌（TNBC）的临床前模型中，正常组织的照射可促进巨噬细胞以及随后肿瘤细胞向正常组织的募集5。免疫状态影响肿瘤细胞向受照部位的募集，在免疫功能低下个体中可观察到肿瘤细胞的迁移。利用乳腺组织来源的类器官重现这些相互作用，将能够通过显微镜和活细胞成像实时观察细胞迁移及细胞-基质间的相互作用，从而明确辐射损伤在改变肿瘤细胞行为中的作用。
小鼠乳腺类器官有助于阐明乳腺发育过程中的关键步骤。乳腺类器官是由分离的乳腺上皮细胞构成的多细胞三维结构，其尺寸大于50 μm6,7,8,9,10。Simian 等人利用原代上皮类器官评估了乳腺分支发育所必需的因素7。Shamir 等人发现，上皮细胞在未经历上皮-间质转化的情况下仍可发生播散，这一发现为理解转移级联过程提供了新视角8。目前，从乳腺组织中生成和表征类器官的方法已较为成熟6,11,12,13。然而，据我们所知，尚未有报道关于从乳腺组织中培养经辐射处理的类器官的方法。建立一种用于培养和表征经辐射处理类器官的实验方案，将是重现辐射诱导的免疫细胞和肿瘤细胞募集过程的关键步骤。
本文报道了一种在涂有亲水性聚合物的低吸附微孔板中培养和表征经辐照的乳腺上皮类器官的方法，该聚合物可支持球状体的形成。这些类器官与巨噬细胞共培养，以研究免疫细胞浸润的动力学。本研究可进一步扩展，包括将类器官与脂肪细胞共培养以模拟乳腺特性，与乳腺癌细胞共培养以观察肿瘤细胞的募集，以及与CD8+ T细胞共培养以研究肿瘤-免疫细胞相互作用。已有建立的实验方案可用于评估经辐照的类器官。先前的模型通过共培养乳腺类器官与免疫细胞，揭示了转移和扩散的机制。DeNardo等发现，CD4+ T细胞对肿瘤相关巨噬细胞的调控增强了乳腺腺癌的转移表型14。共培养模型还被用于阐明生物学发育的机制。Plaks等阐明了CD4+ T细胞在乳腺器官发生中作为下调调节因子的作用15。然而，我们课题组首次建立了可视化正常组织辐照如何影响免疫细胞行为的实验流程。由于已有研究表明正常组织辐照可增强肿瘤细胞的募集5，本方案可进一步发展为分析正常组织和细胞经辐照后如何改变肿瘤细胞行为，从而加深对癌症复发机制的理解。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白 14 抗体</td><td>abcam</td><td>ab181595</td><td>批号: GR3200524-3</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原蛋白</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>梭状芽孢杆菌来源的胶原酶，VIII 型</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Thermofisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNAse）</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 缓冲液</td><td>Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>E-钙黏蛋白抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>24E10</td><td>批号: 13</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔二抗</td><td>abcam</td><td>ab150077</td><td>绿色&lt;br/&gt; 批号: GR3203000-1</td></tr><tr><td>山羊抗兔二抗</td><td>abcam</td><td>ab150080</td><td>红色&lt;br/&gt; 批号: GR3192711-1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 染料</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>批号: TG2611041</td></tr><tr><td>胰岛素（10 mg/mL）</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒溶液（100 倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜（从小鼠 Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤中提取的基底膜）</td><td>Corning</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclon Sphera 96 孔板</td><td>Thermo</td><td>174927</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>VWR</td><td>10128-856</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗（Pen/strep）</td><td>Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽（Phalloidin）</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>批号: GR3214582-16</td></tr><tr><td>紧密连接蛋白 1 抗体</td><td>Novus</td><td>NBP1-85047</td><td>批号: C115428</td></tr><tr><td>Triton X-100（4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇）</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（Trypsin）</td><td>Gibco</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20（聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯）</td><td>Sigma</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

乳腺组织类器官的培养及辐照后表征

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

由消化组织获得的类器官是多细胞三维（3D）结构，相较于单层细胞培养，能更好地模拟体内环境。尽管它们无法完全重现体内的复杂性，但保留了原始器官的部分功能。在癌症模型中，类器官常用于研究肿瘤细胞的侵袭行为。本方案旨在建立并表征来自正常及经辐照小鼠乳腺组织的类器官，以评估正常组织对辐射的响应。这些类器官可应用于未来的体外癌症研究，用以评价肿瘤细胞与经辐照类器官之间的相互作用。乳腺组织被切除后接受20 Gy辐照，并在胶原酶VIII溶液中进行消化。通过离心分离法获得上皮类器官，并在96孔低吸附微孔板中培养形成3D类器官。类器官表达特征性上皮标志物细胞角蛋白14。在共培养实验中观察到巨噬细胞与类器官之间的相互作用。该模型可能有助于研究在经辐照微环境中肿瘤与间质的相互作用、免疫细胞的浸润以及巨噬细胞的极化现象。

通过小鼠乳腺组织成功获取了经辐照的上皮类器官，并进行了处理，随后在低黏附培养板上进行培养（图1）。通过在不同生长环境中接种，检测了类器官的得率（图2A-G）。将细胞直接接种至经组织培养处理的10 cm细胞培养板时，成纤维细胞出现过度生长。在相差显微镜下，成纤维细胞出现在类器官的同一焦平面或其附近，并在接种后数天内迅速从类器官中迁移生长出来。当将类器官接种于基底膜和胶原蛋白基质中时，也观察到成纤维细胞的过度生长现象（图2E,F）。
在优化辐照类器官生长的实验中，测试了多种条件（图2H）。在类器官消化步骤中，使用了来自clostridium histolyticum的I型和VIII型胶原酶作为消化酶12,16,...

由小鼠乳腺组织开发的类器官经辐射处理后进行表征，以评估上皮特性及其与免疫细胞的相互作用。经辐射的类器官可用于更有效地评估可能引起肿瘤细胞在辐射正常组织中募集的细胞间相互作用。

由消化组织获得的类器官是多细胞三维（3D）结构，相较于细胞……，能更真实地模拟体内环境

该方案可用于分析电离辐射如何影响肿瘤细胞的募集，并可进一步开发，从而加深对癌症复发机制的理解。乳腺类器官是功能强大的模型，它们能够模拟体内基本特征，同时便于生物学变量的简单分离。使用低黏附性培养板可避免与蛋白质基质相关的操作流程难题。三阴性乳腺癌患者在治疗后局部区域复发率较高。研究辐射如何影响肿瘤细胞和免疫细胞的行为，将有助于深入理解复发机制。展示类器官共聚焦显微镜技术的是Silvera Batista实验室的研究生Javier Gomez。按照文本方案所述，首先取已处死小鼠的腹部和腹股沟乳腺组织。按照文本方案描述对样品进行照射后45分钟，将乳腺组织置于35毫米无菌细胞培养皿中，并用手术刀剪碎。用约40次切剁，直至组织松散，并得到面积不超过约1平方毫米的组织碎片。现在将组织转移至含有胶原酶溶液的50毫升离心管中。每只小鼠使用10毫升胶原酶溶液。将样本管置于37摄氏度的水浴中孵育30至60分钟，每10分钟涡旋振荡5秒。当胶原酶溶液变浑浊时，消化完成。在室温下以450 × g离心消化后的溶液10分钟。现在可观察到三层结构。上清液为脂肪层，中间层为水溶液，底部为沉淀物。沉淀物呈红色，因为它由上皮细胞、单个基质细胞和红细胞混合而成。在接触样品前，先用 BSA 溶液对所有移液器、移液器吸头和离心管进行预包被，即通过加入并移除 BSA 溶液完成包被。BSA 溶液可重复使用，但在每次实验前应进行无菌过滤。为提高回收率，将上清液转移至新的经 BSA 包被的 15 毫升离心管中。用力吹打以分散脂肪层。在室温下以450 × g离心样品10分钟。吸除上清液，保留少量培养基于管中，避免吸出细胞沉淀。现在用移液器从含有原始沉淀物的离心管中吸去上层水相。向含有原始沉淀物的管中加入10毫升DMEM/F12培养基，并转移至第二支离心管中。用力吹打以充分混合并重悬两种沉淀物。在室温下以450 × g离心10分钟后，吸除上清液，并向管中加入4毫升DMEM/F12。向悬浮液中加入40微升脱氧核糖核酸酶，在室温下轻轻手动振摇2至5分钟。加入6毫升DMEM/F12，并用移液器充分吹打混匀。在室温下以450 × g离心试管10分钟后，吸除上清液至0.5毫升刻度线处。用10毫升DMEM/F12重悬沉淀，并充分吹打混匀。随后通过瞬时离心，使转速达到450 × g后继续运行4秒即停止。重复洗涤步骤三次，通过离心分化纯化类器官。此时沉淀物应为仅含上皮类器官的乳白色。将沉淀物重悬于 10 毫升 DMEM/F12 中。用移液器充分吹打以制成均一溶液。取50 µL转移至30 mm培养皿中，在20倍相差显微镜下观察。使用计数器统计类器官数量。用移液器将50微升类器官加入低吸附培养板的每个孔中。加入150微升类器官培养基，使总体工作体积达到200微升。每两天小心更换一次培养基。将表达GFP或D-番茄红荧光标记的RAW 264.7巨噬细胞维持在添加了10%胎牛血清（FPS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。将细胞以所需密度接种至类器官培养基中。利用活细胞相差显微镜和荧光成像技术随时间监测巨噬细胞的浸润情况。小心吸除孔中的类器官培养基。在室温下，用10%中性缓冲福尔马林固定样品15分钟。用1× PBS将固定的类器官洗涤三次，每次五分钟。如有需要，固定后的样品可在 4 摄氏度保存一周，以备后续染色。洗涤后，将固定类器官在室温下用 0.1% PBST 透化处理 5 分钟。用含 5% 正常山羊血清的 0.1% PBST 在室温下封闭固定类器官 1 小时，然后用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。将固定的类器官与细胞角蛋白-14、E-钙黏蛋白或紧密连接蛋白1抗体在含1% NGS的PBST中室温孵育1小时。然后用PBST洗涤3次，每次5分钟。接着将类器官与含1% NGS的PBST中的山羊抗兔二抗室温孵育1小时。用锡箔纸覆盖以避免光照。按照之前的方法清洗后，使用核染料对细胞核进行染色，时间约为半小时。将染色后的类器官在 PBS 中洗涤，每次五分钟，共洗涤三次。若使用腔室载玻片，请用盖玻片封片。将类器官包裹在铝箔中，于4°C保存，可存放长达两周。经辐照的类器官可在低吸附培养板或基底膜中培养，但在低吸附培养板中生长速度最快。类器官重现了乳腺的特征。观察到形态上类似于导管和小叶的结构。生长趋势表明，在消化和分选后立即接种的类器官中，未辐照的类器官比辐照的类器官生长更快，这很可能归因于DNA损伤修复机制导致的细胞生长停滞。类器官表达了上皮特性，通过免疫荧光染色进行评估。经辐射处理的类器官表达上皮标志物。细胞角蛋白-14（Cytokeratin-14）是肌上皮的标志物，在经辐射处理的类器官表面强烈表达。此外，E-钙黏蛋白和紧密连接蛋白1在类器官的细胞连接处表达。这些蛋白对于正常的细胞黏附至关重要。照射后，类器官仍保持其上皮特性。使用荧光显微镜可在低吸附培养板内观察类器官的荧光染色。然而，最清晰的成像结果通过共聚焦显微镜获得。校正后的总荧光强度通过减去背景信号，并除以类器官面积进行归一化计算得出。在96孔低吸附培养板中培养类器官也简化了共培养实验。当以乳腺中典型的浓度接种时，巨噬细胞与经辐照的类器官共定位增加。进行此操作时，需牢记最重要的两点：一是不要过度消化类器官，二是要恰当地进行离心分化纯化。通过此操作流程，可进一步开展其他共培养实验。类器官可与肿瘤细胞、其他免疫细胞以及基质细胞进行共培养，以重建与复发相关的辐照后微环境。该方法对于评估正常组织损伤如何特异性影响免疫细胞动态变化具有重要意义，并将最终用于解析肿瘤细胞募集机制。乳腺类器官已阐明了乳腺发育的机制，并在体外稳健地重现了乳腺癌的发生过程。我们希望本模型能为辐射诱导的肿瘤细胞招募机制提供新的见解。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

乳腺辐照有机体的生长与表征

利用完整的组织类器官进行原代细胞培养，提供了一种模拟多细胞体内微环境的模型系统。我们建立了一种无血清的原代乳腺上皮组织培养模型，该模型可在不进行酶解组织解离的情况下长期维持混合细胞谱系，并表现出分化形态。乳腺类器官的存活时间可超过&gt;6个月。...

非侵袭性乳腺病变的非酶解、无血清组织培养以自发生成乳腺球

本文介绍了一种生成人原代子宫内膜类器官的方案，该类器官包含上皮细胞和间质细胞，并保留了天然子宫内膜组织的特性。本方案详细描述了从子宫组织获取到子宫内膜类器官组织学处理的全过程。...

人原代子宫内膜类器官的多细胞生成

乳腺是一种双层结构，由外层的肌上皮细胞和内层的腔面 epithelial...

通过差异性胰蛋白酶消化法生成嵌合型乳腺类器官

本方案介绍了一种通过差速离心法从原代正常及肿瘤乳腺组织中生成上皮类器官的方法。此外，还包括对包埋类器官进行三维培养以及免疫荧光成像的操作说明。...

无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

本方案描述了通过化学致癌方法诱导生成并表征小鼠口腔-食管三维类器官的关键步骤，这些类器官代表了正常、癌前病变及鳞状细胞癌病灶。...

建立三维类器官模型研究口腔-食管鳞状细胞癌

本文提供了一种从患者来源的乳腺肿瘤切除组织或正常乳腺组织建立人乳腺类器官的详细方案。该方案提供了培养、冻存和复苏人源性乳腺类器官的全面分步操作指南。...

建立和培养患者来源的乳腺类器官

在此，我们介绍一种通过培养新鲜黑色素瘤组织解离后的细胞悬液来生成黑色素瘤患者来源类器官的实验方案。这些类器官能够真实地再现患者特异性的肿瘤特征 体外 为研究肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制及癌症监测方法提供了创新途径。...

利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

前列腺癌的异质性和治疗耐药性仍是当前面临的挑战。本文介绍一种用于建立患者来源类器官（PDOs）的实验方案，该类器官可保留亲本肿瘤的关键特征。这一标准化模型有助于药物筛选及精准医学的发展。...

建立和维持患者来源的前列腺癌类器官：一份详细的实验方案

本方案描述了一种基于明确成分水凝胶的方法，可在可控的三维培养系统中生成模拟乳腺形态发生关键特征的人类乳腺类器官。...

一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

开发了一种独特的组织工程技术，通过模拟轴突牵张生长，在培养中实现大量神经纤维的延长；轴突牵张生长是一种神经系统生长形式，神经随之身体的增大而同步伸长。...

轴突拉伸生长：神经元生长的力传导机制

了解小鼠乳腺类器官的培养与辐照表征方法，用于研究电离辐射对肿瘤细胞募集的影响。该模型有助于揭示三阴性乳腺癌复发机制及肿瘤免疫相互作用。

乳腺组织类器官的培养及辐照后表征

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