混合光/蓝色原生电泳在线粒体呼吸链超综合体分离与分析中的作用

超复杂体是由线粒体膜内呼吸链复合体形成的超分子组件。这些超级复杂体的形成被认为具有若干结构和功能优势，包括活性氧物种的减少、单个呼吸链复合物的稳定和更有效的组装、呼吸链活动调节以及防止内膜蛋白质丰富的环境中的蛋白质聚集。超级复杂体的组装和组成变化是动态的，并日益显示出在生理适应期间观察到的线粒体功能变化以及各种遗传和后天疾病。

本视频提供了混合透明/蓝色本机 PAGE 协议，以精确且具有时间性的方式解析和分析超级复杂。这种混合透明/蓝色原生 PAGE 方法的主要优点是，它以最佳方式结合了传统蓝色和透明原生 PAGE 协议的各个方面，与已发布的协议相比，该方法可将洗涤剂和心电二菜化合物的暴露降至最低。在大型梯度凝胶上实现超复杂的最佳分离和分析。

此过程涉及几个微妙的步骤，需要手动技能和仔细执行。对书面协议的可视化支持提供了促进技术实现的重要提示。演示这个程序的是亚历山大，一个博士学生从我的实验室。

首先，在16，000次-G的1.5毫升管中，将从动物组织分离的线粒体离心，在4摄氏度下10分钟。丢弃上清液，将含有数字素的冰冷萃取缓冲液加入管中，以重新填充线粒。将管子放在迷你管旋转器上，以中等转速在4摄氏度下孵育30分钟。

在20，400-G下将样品在4摄氏度下进行45分钟的离心，以去除不溶解的碎片。将上一液转移到冰上的新管子中。如果在同一天未执行电泳，请将样品存放在零下 80 摄氏度。

打开铸造室。将 20 厘米倍 22 厘米的外玻璃板放在室内。使用对齐卡放置一组 1.5 毫升的分位器，以确保它们牢固地固定在腔室的侧面和角落。

将内玻璃板放在垫片顶部以形成凝胶夹心，并在玻璃板顶部放置塑料分离板。安排三个凝胶三明治组件。如果需要占用室内的剩余空间，请添加更多丙烯酸块或玻璃板。

在垫片槽中牢固地放置垫片之前，先将一带胶卷膜放在凹槽中。将天花板板放在室内并拧紧所有六个螺钉。站立铸造室。

将渐变前一个放在搅拌板上，在轻混合室中用磁力搅拌器。将铸造室的管子连接到梯度前，并固定管在近位泵的盒式。确保渐变前一个的停止已关闭。

要铸造四种凝胶，在两个 Erlenmeyer 烧瓶中准备 60 毫升 4%和 60 毫升 12% 凝胶溶液，并彻底旋转以混合。将 4%凝胶溶液倒入轻混合室中，将 12% 倒入梯度前层重储层室中。在 350 rpm 时设置搅拌板的搅拌速度。

然后打开止速器，然后以 35 rpm 转速打开泵。一旦轻分的溶液液位低于重馏分，暂停泵并打开轻质储层之间的阀杆。让分数体积平衡并重新启动泵。

确保没有气泡进入系统并夹在玻璃板之间。一旦梯度凝胶完全浇注，停止泵，并覆盖一毫升水在每个凝胶三明治上，以防止凝胶干燥。让它聚合两个小时。

在 Erlenmeyer 烧瓶中准备 25 毫升堆叠凝胶，并旋转以彻底混合。巧妙地反转蒙太奇以去除水，并在每个凝胶三明治中插入 15 个井梳。倒注堆积凝胶，让它聚合两个小时。

之后，插入凝胶和夹钳并拆下梳子。短玻璃板朝下，将凝胶夹层插入冷却芯中。在另一侧重复，将芯放在电泳罐中。

将 300 毫升蓝色阴极缓冲液倒入电泳罐内室。使用移液器和装载技巧，每井装载 75 至 175 微克蛋白质。在4摄氏度的冷室，将电极插入电源，将其打开至150伏，然后运行凝胶一个半小时，或直到样品全部进入梯度凝胶。

在单独的孔中对样品进行负载复制，以便并行测定凝胶内活动和 OXPHOS 复合物的免疫布洛特分析。用移液器拆下蓝色阴极缓冲液。更换300毫升的库马西蓝色无自由阴极缓冲液，并在冷室以200伏特运行凝胶过夜。

电泳结束前，根据手稿准备凝胶内活性缓冲液，并在室温下将它们保持在黑暗中。停止电泳并取回凝胶。切塑料袋，这样它就可以像书一样打开。

切割车道，将凝胶通道转移到塑料袋中。使用热封口器密封三面的两面。如果进行阴性控制实验，在测定缓冲液中添加抑制剂。

对于三个实验样品，添加20毫升的凝胶内活性缓冲液。清除气泡并密封塑料袋的第四面。在黑暗中37摄氏度的孵育凝胶通道，每15分钟检查一次。

孵育时间因蛋白质和复合物的含量而异。孵育后，在水中冲洗凝胶通道以停止反应，并在白色背景上为复杂 I、复杂 II、复杂 IV 或黑色背景进行图像，用于复杂 V。该样品的最佳数字素量为每克四克，因为它提供了单体复合IV和高分子量超复杂的复杂分辨率。

在较低的比率下，频带在电泳过程中不清晰，无法解析为涂片，而使用较高的数字素比会导致高分子量超复杂的中断。从一只小鼠分离出的肝脏线粒体用最佳量的位粒体进行治疗，以提取呼吸超复杂。与标准原生 PAGE 相比，当使用混合透明/蓝色原生 PAGE 条件分离蛋白质时，OXPHOS 复合物的电泳流动性略有降低，因为库马西蓝色含量减少。

对于复杂的 IV 单体，这种移动性转移更大，其次是复杂的 V 单体，而复杂的 I.蓝色背景在混合透明本机/蓝色本机 PAGE 中较低，而蓝色本机 PAGE 则较低。蓝色原生 PAGE 后的高背景水平完全掩盖了复杂 II 的凝胶内活性染色，并增强了与复杂 IV 二丁体活动相关的背景噪声。对于此协议，对感兴趣的样品进行不同量的数值的滴定至关重要，以便确定允许最佳溶解的条件，同时保持酶活性和生理蛋白质相互作用。

有关凝胶铸造的所有步骤应一丝不苟地进行，以形成最佳梯度，以进行适当的样品分离。对于这些大而易碎的凝胶的操纵，也应当格外小心。始终使用凝胶的高百分比端用几根手指握住它们。

使用这种混合透明/蓝色原生 PAGE 方法，样品仅在电泳开始时短暂接触心酸染料 Coomassie 蓝色，而不会接触到任何其他洗涤剂。这允许像使用传统的蓝色原生 PAGE 方法一样有效地分离和解决超复杂，同时避免高 Coomassie 蓝色水平对超复杂体内活性测定和实验室蛋白-蛋白质相互作用的负面影响。因此，通过该协议，可以将精确和快速的凝胶活性测量与涉及2D电泳、免疫检测和/或超复杂蛋白质组学参考分析的分析技术相结合。