用于分离与分析线粒体呼吸链超复合物的混合型透明/蓝色天然电泳

超复合体是由线粒体内膜中呼吸链复合体形成的超分子组装结构。这些超复合体的形成被认为具有多种结构和功能上的优势，包括减少活性氧的产生、稳定并更有效地组装各个呼吸链复合体、调控呼吸链活性，以及防止蛋白质在线粒体内膜这种富含蛋白质的环境中发生聚集。超复合体的组装和组成变化是动态的，越来越多的研究表明，这些变化是生理适应过程中线粒体功能改变的基础，也与多种遗传性和获得性疾病相关。

本视频介绍了一种混合型透明/蓝色天然PAGE技术，可精确且高效地分离和分析超复合物。该混合型透明/蓝色天然PAGE方法的主要优势在于，它充分结合了传统蓝色天然PAGE和透明天然PAGE各自的优势，与已发表的方案相比，可将样品对去垢剂和阴离子化合物的暴露程度降至最低。通过使用大尺寸梯度凝胶，可实现对超复合物的最佳分离与分析。

该操作包含多个精细步骤，需要熟练的手动操作技能和谨慎执行。书面方案所配的视频演示提供了有助于实施该技术的重要提示。本操作由本实验室的博士研究生 Alexandria 进行示范。

首先，在4°C条件下，将从动物组织中分离的线粒体置于1.5毫升离心管中，以16,000 × g离心10分钟。弃去上清液，向沉淀中加入含皂苷（digitonin）的预冷提取缓冲液，体积按计算确定，以重悬线粒体沉淀。将离心管置于微型旋转混合仪上，在4°C、中等转速下孵育30分钟。

将样品在4 °C条件下以20,400 × g离心45分钟，以去除不溶性碎片。将上清液转移至冰上的新离心管中。若当天不进行电泳，请将样品于-80 °C保存。

打开制胶室。将一块20厘米×22厘米的外层玻璃板放入制胶室内。使用对齐卡放置一组1.5毫升的间隔垫片，确保其紧贴制胶室的侧边和角落。

将内层玻璃板放在间隔垫片上以形成凝胶夹心结构，并在玻璃板上方放置一张塑料分隔膜。再组装三个相同的凝胶夹心结构。如有需要，可添加更多丙烯酸块或玻璃板以填满电泳室内的剩余空间。

在将垫圈牢固地放入垫圈凹槽之前，先在凹槽内放置一条Parafilm膜。将顶板放在腔室上，并拧紧全部六个螺丝。竖直放置制胶腔室。

将梯度制备仪放置在搅拌台上，轻混室中放入磁力搅拌子。将灌胶室的管路连接至梯度制备仪，并将管路固定在蠕动泵的卡槽内。确保梯度制备仪的旋塞处于关闭状态。

要制备四块凝胶，需在两个锥形瓶中分别配制 60 毫升 4% 和 60 毫升 12% 的凝胶溶液，并充分混匀。将 4% 的凝胶溶液倒入梯度混合室（轻相混合室），12% 的凝胶溶液倒入梯度形成仪的储液室（重相储液室）。将磁力搅拌器的搅拌速度设定为 350 转/分钟。

然后打开活塞，以 35 rpm 的转速启动泵。当轻相溶液液面低于重相时，暂停泵并打开轻相与重相储液器之间的阀杆。让两相体积达到平衡后，重新启动泵。

确保无气泡进入系统并滞留在玻璃板之间。待梯度胶完全灌注后，停止泵液，并在每块胶板上覆盖一毫升水以防止胶干燥。静置聚合两小时。

在锥形瓶中配制25毫升浓缩胶，轻轻旋转混匀。小心倒置凝胶装置以去除水分，并在每块凝胶夹心中插入15孔梳子。倒入浓缩胶，室温静置聚合2小时。

随后，插入凝胶和夹心夹具，并移除梳子。将短玻璃板朝下，把凝胶夹心插入冷却芯中。另一侧重复相同操作，并将芯体置于电泳槽中。

在电泳槽的内槽中加入 300 毫升蓝色阴极缓冲液。使用移液器和上样吸头，每孔上样 75 至 175 微克蛋白质。在 4 摄氏度的冷室中，将电极连接至电源并开启，设置电压为 150 伏，运行 1.5 小时，或直至所有样品均进入梯度胶中。

将样品的重复样分别上样至不同的孔中，以便平行进行凝胶内活性检测和OXPHOS复合物的免疫印迹分析。用移液器吸除蓝色阴极缓冲液，更换为300毫升考马斯亮蓝-free阴极缓冲液，在4°C条件下于冷室中以200伏电压过夜电泳。

在电泳结束前，根据论文所述配制凝胶内活性缓冲液，并于室温下避光保存。停止电泳并取出凝胶。将塑料袋剪开，使其可像书本一样打开。

切下泳道并将凝胶泳道转移至塑料袋中。使用热封机封住三边中的两边。若进行阴性对照实验，需向检测缓冲液中加入抑制剂。

对于三个实验样品，加入20毫升凝胶内活性缓冲液。去除气泡并密封塑料袋的第四边。将凝胶泳道置于37摄氏度避光孵育，并每15分钟检查一次。

孵育时间根据蛋白质及复合物的量而有所不同。孵育结束后，用清水冲洗凝胶泳道以终止反应，并在白色背景下成像以观察复合物I、复合物II、复合物IV，或在黑色背景下成像以观察复合物V。本示例中，通过凝胶内活性检测复合物IV，以可视化从新鲜小鼠肝脏线粒体中分离的超复合物。该样品中，每克使用4克洋地黄皂苷为最佳用量，因其可良好分辨单体形式的复合物IV以及高分子量的超复合物。

当比例较低时，电泳过程中条带不清晰，会出现拖尾现象；而使用较高比例的皂苷（digitonin）则会导致高分子量超复合体的破坏。从一只小鼠分离的肝脏线粒体经最适浓度的皂苷处理，以提取呼吸链超复合体。由于考马斯亮蓝的用量减少，在杂交透明-蓝色天然PAGE条件下分离蛋白时，OXPHOS复合体的电泳迁移率相较于标准天然PAGE略有降低。

这种迁移率的变化在复合体IV单体中最为显著，其次是复合体V单体和复合体I。与传统的蓝色天然PAGE相比，杂交透明天然/蓝色天然PAGE的蓝色背景较浅。蓝色天然PAGE后较高的背景水平会完全掩盖凝胶中复合体II的活性染色信号，并增强与复合体IV二聚体活性相关的背景噪声。在本实验方案中，使用不同浓度的皂苷（digitonin）对目标样品进行滴定至关重要，以确定能够实现最佳溶解效果同时保持酶活性及生理状态下蛋白质相互作用的条件。

所有与凝胶制备相关的步骤都应仔细操作，以形成最佳梯度，确保样品有效分离。操作这些大而脆弱的凝胶时也需格外小心。应始终用多个手指捏住凝胶的高浓度端进行操作。

通过这种混合型透明/蓝色天然PAGE方法，样品仅在电泳开始时短暂接触阴离子染料考马斯亮蓝，而不接触任何其他去垢剂。该方法能够像传统的蓝色天然PAGE方法一样有效分离和分辨超复合物，同时避免了高浓度考马斯亮蓝对凝胶内活性测定以及超复合物中不稳定蛋白质-蛋白质相互作用产生的负面影响。因此，利用本方案可将精确且快速的凝胶内活性检测与二维电泳、免疫检测和/或蛋白质组学分析等分析技术相结合，用于超复合物的研究。