研究缓症链球菌群在秀丽隐杆线虫中引起的氧化应激

在本实验方案中，我们演示了如何利用自由生活的秀丽隐杆线虫（c. elegans）来阐明由米提斯链球菌群（Mitis Group streptococci）产生的过氧化氢所引起的致病性。该技术的主要优势在于，我们可以利用一种可持续的生物来源活性氧，而非化学来源，来研究线虫中的致病性以及应激反应的激活。配制一升培养基时，向一个2升的锥形瓶（Erlin Myer flask）中加入30 g Todd Hewitt培养基粉末、2 g酵母提取物和20 g琼脂。

向烧瓶中的内容物加入 970 ml 去离子水，并放入一个搅拌子。用铝箔覆盖瓶口。在 121 摄氏度温度和 15 磅每平方英寸压力下，对烧瓶中的培养基进行高压灭菌 30 分钟。

随后将烧瓶置于搅拌器上，轻轻搅拌使其冷却。在超净工作台内，将培养基倒入大小合适且无菌的培养皿中。静置培养基干燥2小时。

此后，将平板储存于 4 摄氏度，可保存长达 1 个月。在准备米提斯链球菌前，将 THY 琼脂平板放入培养箱中升温至 37 摄氏度。然后使用无菌接种环将目标链球菌菌株在平板上划线接种。

然后将平板放入烛缸中，在37摄氏度下培养约18小时，以提供微需氧环境。次日，从烛缸中取出平板，用无菌接种环挑取单个菌落，接种于含有2 ml THY液体培养基的15 ml无菌锥形管中。

盖紧管盖，在37摄氏度下静置培养试管。将THY平板预先在培养箱中温育至37摄氏度，然后在THY平板上加入50微升含有1000单位过氧化氢酶的溶液。使用无菌涂布棒将过氧化氢酶溶液涂布均匀，并将平板置于超净工作台中干燥30分钟。

接种链球菌菌株时，使用移液器将80 µL过夜培养的菌液加入平板中，并用无菌涂布棒将细菌在琼脂表面充分涂布均匀。将平板置于烛缸中，于37 °C培养过夜。作为对照，在两个NGM平板上各加入80 µL过夜培养的大肠杆菌OP-50菌液进行接种。

将平板在37摄氏度下孵育过夜。第二天，从蜡烛罐中取出平板，并让平板冷却至室温。使用无菌线虫挑取工具，将30只L4期幼虫从NGM饲喂平板转移至接种了链球菌的THY平板上。

将培养皿置于 25 摄氏度下孵育。在解剖显微镜下，于多个时间点计数每块培养皿中存活和死亡的 L4 幼虫数量。使用无菌线虫挑取工具轻轻触碰线虫，以判断其存活状态。

最初每30分钟对线虫进行一次存活或死亡评分。当线虫开始快速死亡时，改为每15分钟评分一次。该检测通常需要5至6小时完成。

此后，再重复实验两次。制备琼脂糖垫时，沿两条载玻片的长度方向粘贴实验室胶带。这将决定琼脂糖垫的厚度。

将一块干净的载玻片置于两块用胶带固定的载玻片之间。用去离子水配制2%（重量/体积）的琼脂糖溶液，并在微波炉中加热溶解。使用移液器吸取100 µL熔融琼脂糖，滴加在干净载玻片的中央。

立即在融化的琼脂糖上放置另一张干净的载玻片，并轻轻按压以制成垫片。待琼脂糖凝固后，移去上方的载玻片。琼脂糖垫片即可用于后续实验。

将THY平板预热至37摄氏度。按照之前生存实验的方法，用链球菌菌株接种平板。用大肠杆菌OP50接种3块NGM平板作为对照，并在37摄氏度下过夜培养。

第二天，将培养皿冷却至室温。用 M9W 缓冲液将 L4 期幼虫从 NGM 或 NGM RNAi 诱导培养皿上冲洗至 15 ml 一次性离心管中。在离心机中以 450 × g 离心 1 分钟。

将上清液倾出，向每支试管中加入 10 ml M9W。重复离心步骤三次。用 250 µL M9W 重悬线虫，并取三滴 5 µL 的线虫悬液滴加到洁净的培养皿盖上。

在解剖显微镜下，估算每微升中的线虫数量。使用移液器，将约100条L4期幼虫分别加入THY链球菌接种的平板和NGM大肠杆菌接种的平板中。每种细菌菌株使用三个平板。

将培养板在25摄氏度下孵育2至3小时。随后从孵育箱中取出培养板，用M9W洗涤，并将线虫收集至15 ml锥形管中。

将蠕虫按照之前离心步骤的方法清洗三次。用移液法吸除大部分M9W。然后向蠕虫沉淀中加入500微升含有2毫摩尔叠氮化钠或盐酸四咪唑的M9W，以进行麻醉。

将含有线虫沉淀的离心管在室温下孵育15分钟。随后，取15微升线虫悬浮液滴加到预先制备好的琼脂糖垫上。在荧光显微镜下，使用Fitzy和Dappy滤光片观察skn-1的定位情况。

以10倍和20倍放大倍数对线虫进行成像。根据定位程度分为三个等级进行评分：低水平定位，即未观察到细胞核定位；中等水平定位，表现为SKN-1 BCGFP出现在线虫的前端或后端；高水平定位，即在所有肠细胞中均观察到skn-1 BCGFP的细胞核定位。在本实验中，Mitis组成员迅速杀死了线虫，而与之相反的是，S.mutans、S.salivarius以及非致病性大肠杆菌E.coli OP-50则未表现出此效应。

当在THY培养基中添加过氧化氢酶后，线虫的杀灭作用被消除。与野生型和互补菌株相比，在delta spxB突变株上未观察到线虫死亡。这些数据表明，米提斯群（Mitis Group）产生的过氧化氢介导了线虫的杀灭作用。

与载体对照处理的线虫相比，skn-1 沉默线虫的存活率显著下降。在 skn-1 突变株和 N2 野生型线虫中也观察到类似的杀伤表型。这表明 skn-1 影响线虫在 Mitis Group 上的存活能力。

在暴露于野生型 N-互补菌株的线虫中观察到 skn-1 BCGFP 的定位，而在 S. cordonae 的 Delta spxB 突变菌株处理下未观察到该定位。当敲低 P38 MAP 激酶通路组分后，与载体对照处理的线虫相比，敲低处理的线虫中 skn-1 BCGFP 的定位减少。通过使用链球菌 c.

在线虫系统中，可进一步研究过氧化氢对内质网应激、线粒体损伤、线粒体自噬以及自噬的影响。此外，还可阐明过氧化氢作为促衰老因子通过破坏细胞核心过程来引发免疫反应的作用机制。