Name: 等温滴定量计测定酶稳定性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习使用等温滴定量热法（ITC）测定酶活性热稳定性，该方法比传统检测更省时，适用于多种酶反应。通过直接测量反应热变化，可快速评估酶修饰和环境条件对稳定性的影响，助力工业酶开发。

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1. 样品制备
<ol>
	<li>1,000 mL 0.1 M 醋酸钠缓冲液，pH 4.6
	<ol>
		<li>用量筒量取 800 mL 去离子水，倒入 1,000 mL 烧杯中。</li>
		<li>称取 8.2 g 无水醋酸钠，加入烧杯中。</li>
		<li>将烧杯置于磁力搅拌器上，放入搅拌子，开启搅拌器，搅拌至完全溶解。</li>
		<li>待无水醋酸钠完全溶解后，使用校准后的 pH 计测量溶液 pH。</li>
		<li>根据需要加入 1 M HCl 或 NaOH，调节至目标 pH 4.6。</li>
		<li>加入去离子水，定容至总体积为 1,000 mL。</li>
		<li>室温保存，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶溶液
	<ol>
		<li>首先用量筒量取 8 mL 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 4.6），置于 15 mL 量筒中，配制 10 mL 酶溶液，使酶浓度处于 10–30 mg/mL 范围内。&#160;</li>
		<li>将缓冲液转移至含有酶的 15 mL 锥形离心管中，剧烈震荡，直至酶完全溶解。</li>
		<li>继续加入缓冲液，定容至总体积为 10 mL。</li>
		<li>将酶溶液置于 4 °C 保存，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>底物溶液
	<ol>
		<li>为配制浓度在 300–600 mM 范围内的底物溶液，计算所需底物的质量（单位：克），以达到目标浓度。</li>
		<li>称取相应质量的底物，置于 100 mL 玻璃烧杯中。</li>
		<li>使用 25 mL 量筒量取 20 mL 缓冲液，加入玻璃烧杯中。</li>
		<li>将烧杯置于磁力搅拌器上，放入磁力搅拌子，开启加热功能，并调节搅拌速度。</li>
		<li>持续搅拌，直至底物完全溶解。</li>
		<li>将底物溶液转移至 50 mL 锥形离心管中，加入 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 4.6），定容至总体积为 45 mL。通过震荡混匀。</li>
		<li>底物溶液室温保存，待用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验操作
<ol>
	<li>准备等温滴定量热仪（ITC）仪器&#160;
	<ol>
		<li>确保参比池中已加入350 µL蒸馏水。在将酶液加入样品池之前，确认样品池已清洗干净。</li>
		<li>清洗步骤——用移液器吸取500 µL的2%清洗液（材料表），小心将针头插入样品池，注满液体后，再用同一移液器缓慢抽出液体，将废液排入烧杯中。用2%清洗液（材料表）重复此步骤两次，再用70%乙醇重复三次，最后用蒸馏水冲洗十次。</li>
		<li>用移液器吸取450 µL酶溶液，小心将针头完全插入样品池底部，缓慢推动活塞至100 µL刻度线处，以防止产生气泡。</li>
		<li>将50 µL滴定用移液器的针尖浸入蒸馏水中，缓慢吸入蒸馏水，再排入废液容器中，重复此操作三次，以清洗滴定移液器。</li>
		<li>用底物溶液冲洗三次，以去除残留水分。</li>
		<li>将滴定移液器插入底物溶液中，缓慢吸入溶液直至完全充满移液器，确保无气泡产生。&#160;</li>
		<li>保持移液器仍浸在底物溶液中，拔出活塞，使约2 µL空气进入移液器顶部，然后重新插入活塞。</li>
		<li>取下ITC仪器上的滴定管手柄，将移液器放入手柄内，旋紧固定。&#160;</li>
		<li>用无尘纸擦拭搅拌子顶端，然后小心将滴定管手柄插入ITC仪器中，并锁定到位。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设置 ITCrun&#160;
<ol>
	<li>在计算机上，打开ITCrun，然后点击Set up。</li>
	<li>点击Stirring rate，将转速设置为 350 RPM。检查注射器体积（µL），确保其为 50 µL。</li>
	<li>设置温度，然后点击Update。建议在准备 ITC 实验前至少 1 小时执行此步骤，以便仪器有足够时间根据需要进行升温或降温。</li>
	<li>在实验设置中，选择逐步滴定模式。</li>
	<li>点击Insert以设置注射参数。将注射间隔调整为 5,400 秒，注射体积（µL）设为 4，注射次数设为 4。点击OK确认设置。</li>
	<li>在Equilibration box中，选择Auto-equilibrate和Large expected heats。（如果预期热效应较小，可在“expected heats”下选择Small；但这将延长平衡时间。）</li>
	<li>将初始基线设置为 300 秒。</li>
	<li>要开始运行，先点击位于Stirring rate旁边的Start符号，然后点击位于扳手符号旁边的Start按钮。</li>
	<li>保存文件，并让仪器开始运行。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>在 NanoAnalyze 中打开文件。点击 数据，然后选择 数据列。</li>
	<li>选中所有数据，复制后将其粘贴到 Microsoft Excel 中。</li>
	<li>通过在 300 秒处添加所需数值使基线归零，调整零基线。将此校正应用于整个热释放速率值的数据列。&#160;</li>
	<li>使用公式：=MIN(单元格:单元格) 或 MAX(单元格:单元格)，找出每次注射对应的热释放速率的最小值或最大值。每个数据点代表每次注射时酶的峰值酶活性。</li>
	<li>绘制滴定过程中各次注射对应的最小值或最大值随其发生时间变化的曲线图。</li>
</ol>

<ol><li>Anastas, P., Eghbali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+chemistry%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Green chemistry: principles and practice.</a> Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).</li>
<li>Jin, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Recombinant+Glucose+Isomerase+for+Efficient+Production+of+High+Fructose+Corn+Syrup%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+Biotechnoiogy%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup.</a> Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).</li>
<li>Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudak%2C+%C5%9E%C3%96+%22Microbial+Cultures+and+Enzymes+Dairy+Technology%22">Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology</a>. , 182-203 (2018).</li>
<li>van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+enzymes+for+beer+brewing%3A+Thermodynamic+comparison+on+resource+use%5BTitle%5D)+AND+%22Energy%22%5BJournal%5D)">The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use.</a> Energy. 115, 519-527 (2016).</li>
<li>Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactooligosaccharides+formation+during+enzymatic+hydrolysis+of+lactose%3A+Towards+a+prebiotic-enriched+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk.</a> Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).</li>
<li>Lawrence, P. B., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+PEGylation+influences+protein+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How PEGylation influences protein conformational stability.</a> Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).</li>
<li>Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+enzyme+immobilization+and+protein+engineering%3A+An+alternative+path+for+the+development+of+novel+and+improved+industrial+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts.</a> Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).</li>
<li>Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Engineering+of+thermostable+enzymes+for+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Bioengeneering%22%5BJournal%5D)">Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications.</a> Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).</li>
<li>Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+model+of+thermal+deactivation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Transient model of thermal deactivation of enzymes.</a> Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).</li>
<li>Mason, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+Methods+for+Measuring+Stability+and+Reusability+of+Membrane+Immobilized+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes.</a> Jounal of Food Science. , (2017).</li>
<li>Leksmono, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lactase+Enzymatic+Activity+in+the+Teaching+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.</a> Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).</li>
</ol>

本文所述的ITC酶稳定性测定法的一个主要优势是其自动化程度高。一旦配制好所有适当的缓冲液和溶液，每次测定的设置时间仅需约15分钟。相比之下，传统的转化酶和乳糖酶活性测定方法需要约2小时，并且实验人员需持续参与，而许多其他酶活性测定所耗费的人工时间更长。在之前的一项研究中，我们已证明ITC方法所得数据与传统的分光光度法测定转化酶活性的结果具有可比性11。
ITC 测定法的另一个优势在于其几乎适用于任何酶12因此，在特定条件下测试不同酶的稳定性时，无需建立多种不同的检测方法。此外，等温滴定量热法（ITC）可用于测定新型酶或缺乏合适比色检测方法的酶的活性稳定性。&#160; ITC 测定还可用于不透明介质，这在食品科学中具有显著优势。由于大多数先前的酶活性测定方法依赖分光光度法、荧光法或发光法来检测酶活性，因而无法适用于不透明或高色素的介质。尽管本研究仅展示了温度对酶活性稳定性的影响，但 ITC 方法同样适用于影响酶稳定性的大多数其他条件（如 pH、盐类、非水溶剂和变性剂）。
<p c...

酶是一类能够催化多种有机反应的蛋白质。大多数酶在接近中性的水溶液中发挥作用，从而避免了使用苛刻的溶剂。由于具有高度选择性，与酸、碱等非选择性催化剂相比，酶催化反应产生的副产物更少（在某些情况下甚至没有副产物）1。这一点在食品制造中尤为重要，因为所有化学反应都必须确保最终产品对人体安全可食用。目前，酶已被用于生产高果糖玉米糖浆2、奶酪3、啤酒4、无乳糖牛奶5以及其他重要的食品。尽管本文重点讨论酶在食品工业中的应用，但酶还有许多其他用途，包括在绿色化学和药物合成中的应用。&#160;
酶的应用受到酶活性稳定性的限制，而酶活性的稳定性取决于酶三维结构的维持。可通过聚乙二醇化修饰6、在固体载体上固定化7、基因改造8以及配方优化等方法来稳定酶的结构。目前，通常采用差示扫描量热法（DSC）和终点酶活性检测法来测定酶的稳定性9。DSC 可测量酶发生解折叠时的温度；该温度越高，说明酶结构越稳定。然而，酶活性的丧失往往发生在低于酶整体或其结构域解折叠所需温度的条件下10。因此，仅依靠 DSC 无法确定某种酶的修饰是否提高了其活性稳定性。终点酶活性检测通常耗时较长，需要多个样品，且常涉及偶联的比色反应，因而不适用于颜色较深或不透明的溶液或悬浮液。
本研究展示了一种利用等温滴定 calorimetry（ITC）直接测定酶活性稳定性的方法。ITC 可测量反应过程中释放或吸收热量的速率。由于几乎所有的反应都会产生或吸收热量，因此 ITC 可用于大多数酶催化反应，包括那些没有偶联反应或发生在不透明介质（如牛奶）中的反应。ITC 已被用于测量多种反应的化学动力学参数数十年，但本文所介绍的实验方案重点在于利用 ITC 测定酶催化反应的峰值产热速率，并证明酶活性与峰值产热速率呈线性相关。对峰值产热速率的 ITC 测定基本为自动化操作，设置和数据分析所需的人工时间极少。&#160;

<table><tbody><tr><td>α-乳糖</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>未知（过期）</td><td>500g</td></tr><tr><td>乙酸钠，无水，纯度≥99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184-30</td><td>250g</td></tr><tr><td>乳糖酶&amp;nbsp;</td><td>MP Bio</td><td>100780</td><td>5g</td></tr><tr><td>盐酸溶液，1N&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SA48-500</td><td>500mL</td></tr><tr><td>台式pH计</td><td>VWR</td><td>89231-622</td><td></td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP8231GAL</td><td>1加仑</td></tr><tr><td>Micro-90</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>NC024628</td><td>1L（清洗液）</td></tr></tbody></table>

通过等温滴定 calorimetry 测定酶的稳定性

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

本研究展示了一种利用等温滴定量热法（ITC）测定酶活性稳定性的新方法。在将底物溶液单次注入酶溶液后，所观察到的峰值热速率与酶活性相关。通过在一段时间内将底物多次注入同一酶溶液，可监测酶活性的下降。该检测方法具有自主性，所需人工操作时间极少，且适用于大多数培养基和酶。&#160; &#160;

图1和图5中的代表性结果展示了两种酶——乳糖酶和转化酶的实验数据。乳糖酶和转化酶分别催化二糖水解为两个单糖，前者为吸热反应，后者为放热反应。这两种酶促反应均在不会使酶达到饱和的浓度下进行。
乳糖酶数据展示了如何利用等温滴定量热法（ITC）数据来评估酶的稳定性。将600 mM乳糖分四次连续滴定，每次注入4 µL（图1），加入到20 mg/mL的乳糖酶溶液中。每次注射之间间隔5,400秒，以确保在每次注射前系统有足够时间恢复至初始基线。上述方案分别在25 °C、35 °C、45 °C和55 °C下进行。此外，在55 °C条件下，将600 mM乳糖滴定至100 mM乙酸钠缓冲液中作为空白对照，以校正混合热效应。每次将底物注入酶溶液时，首先出现初始的放热混合热，随后乳糖酶催化乳糖发生吸热性水解反应，直至反应完成，热释放速率恢复至基线水平。乳糖向乳糖酶溶液中的注射共重复四次，由于酶活性逐渐降低，后续每次注射所引起的...

通过等温滴定 calorimetry（ITC）可方便地测定酶活性的热稳定性。目前使用的大多数蛋白质稳定性检测方法仅测量蛋白质的去折叠过程，而无法提供有关酶活性的信息。ITC 能够直接确定酶修饰对酶活性稳定性的影响。

本研究展示了一种利用等温滴定量热法（ITC）测定酶活性稳定性的新方法。所观察到的峰值热速率……

在反应中使用酶作为催化剂可以降低反应所需的能量，并减少有毒副产物的生成。然而，酶在工业中的应用受到限制，因为酶不稳定且成本较高。本方案可缩短判断反应条件是否对酶活性产生不利影响，或酶的修饰是否提高了其稳定性的所需时间。该技术的主要优势在于，与传统的酶稳定性测定方法相比，它所需的人工时间更少。此外，由于该方案适用于任何放热或吸热反应，因此可广泛用于多种酶。首先，配制 0.1 摩尔的醋酸钠缓冲液。在1,000毫升量筒中量取800毫升蒸馏水。然后称取8.2克无水乙酸钠，加入量筒中。将量筒置于搅拌器上。将搅拌棒放入烧杯中，打开搅拌器搅拌，直至完全溶解。当无水乙酸钠完全溶解后，使用校准过的pH计测量溶液的pH值。根据需要，用移液管逐滴加入1摩尔盐酸或氢氧化钠，调节pH至4.6。向烧杯中加入蒸馏水，直至总体积达到 1,000 毫升。配制酶溶液时，用 15 毫升量筒量取 8 毫升 0.1 摩尔的醋酸钠缓冲液。然后将缓冲液加入含有酶的 15 毫升锥形管中，剧烈振荡，直至酶完全溶解。继续加入缓冲液，直至总体积达到 10 毫升。将酶溶液于 4 摄氏度保存，待用。制备底物溶液时，称取底物并置于 100 毫升玻璃烧杯中。使用量筒量取 20 毫升缓冲液，然后将其加入玻璃烧杯中。将烧杯置于搅拌器上，并将磁力搅拌子放入烧杯中。打开加热功能，并相应调节搅拌速度。继续搅拌直至底物完全溶解。将底物溶液倒入一个15毫升的锥形管中，并加入先前配制的乙酸钠缓冲液，直至总体积达到45毫升。振荡混匀。将底物溶液在室温下保存至使用。在计算机上打开 ITC Run 软件并点击“setup”。点击“stirring rate”，设置为 350 rpm。检查注射器体积是否为50微升。将温度设置为55摄氏度，然后按更新。继续操作前需等待至少一小时，以确保等温滴定量热仪有足够时间升温或降温至设定值。在加载酶之前，确保参比池中已加入350微升蒸馏水。为清洗样品池，先用500微升2%的清洗液填充上样注射器，小心地将针头插入样品池，注满清洗液后，用同一支注射器缓慢将液体抽出。将液体倒入烧杯中。用2%的清洗液重复此步骤两次，用70%乙醇重复三次，然后用蒸馏水洗涤十次。样品池清洁后，用450微升酶溶液填充上样注射器。小心地将针头完全插入样品池底部，然后缓慢推动活塞至100微升刻度线处，以防止产生气泡。接着，用蒸馏水清洗50微升滴定注射器三次：将针头尖端浸入水中，缓慢吸取水至注射器内，然后将水排入废液容器中。再用底物溶液冲洗三次，以去除残留的水分。随后，通过吸取底物溶液将滴定注射器充满，确保注射器内无任何气泡。保持注射器仍浸在底物溶液中，拔出活塞，使约 2 微升空气进入注射器顶部，然后重新插入活塞。取下等温滴定量热仪（ITC）的滴定管手柄，将注射器放入手柄内，旋紧至固定。用无绒布擦拭滴定注射器的尖端，然后小心地将滴定管手柄放入等温滴定量热仪中，并固定到位。在实验设置中，选择逐步滴定模式。单击“插入”以设置加样步骤。将注射间隔调整为 5,400 秒，注射体积调整为 4 微升，注射次数设置为四次。点击“确定”以确认设置。在平衡选项框中，选择自动平衡和预期热量较大。将初始基线设置为 300 秒。要开始运行，请单击搅拌速率旁边的开始符号，然后单击位于扳手符号旁边的“开始”。保存文件，并让仪器运行。为了分析数据，在 Nano Analyze 中打开文件。点击数据，然后选择数据列。选择所有数据，复制，再将数据粘贴到 Microsoft Excel 中。通过在300秒处添加所需数值，将基线调整为0。将此校正值应用于热释放速率整列数据。然后，绘制滴定过程中出现最小值或最大值时的数值随时间变化的曲线图。本方案中展示了乳糖酶活性的等温滴定量热（ITC）数据曲线，即在55°C、45°C、35°C和25°C条件下，将乳糖依次四次注入pH 4.6缓冲液中的乳糖酶溶液。在55°C下进行了无酶对照实验，以测定混合热。每次酶注射后，首先出现初始的放热混合热，随后乳糖酶催化乳糖发生吸热性水解反应，直至反应完成，热速率恢复至基线水平。每次注射后，内源性吸热峰的最小值略低于前一次注射，这是由于酶活性降低所致。正如预期，每次注射的酶稳定性随温度升高而下降。对照实验显示，在25摄氏度下乳糖酶活性在四次注射后因稀释导致酶活性下降了8%。考虑到第四次注射在检测中显示出73%的下降，因此酶活性的实际损失为65%。因此，每次注射导致的乳糖酶稀释对酶活性的影响相对较小，仅为11%。用于配制酶溶液和底物溶液的缓冲液应尽可能匹配。pH 或浓度不匹配可能导致混合热增大，从而掩盖反应热。您可应用本方案研究酶并测定其稳定性，方法是测量反应过程中释放或吸收热量的速率。

measuring-enzymatic-stability-by-isothermal-titration-calorimetry

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科研

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Environment

环境

等温滴定量计测定酶稳定性

等温滴定量热法（ITC）是研究配体与其宿主结合的有力工具。然而，在复杂体系中，可能有多个模型对数据的拟合效果相当。本文所述方法提供了一种手段，用于阐明复杂体系中合适的结合模型，并提取相应的热力学参数。...

收集变浓度等温滴定量热法数据集以确定结合机制

本文介绍了一种利用等温滴定 calorimetry...

等温滴定 calorimetry 测定大分子-配体亲和力

对细菌培养物进行连续稀释，并将等分试样加入含有比色培养基的量热小瓶中。将密封的小瓶装入等温微量热仪的多孔板中，以测量代谢产热。该设备保持恒定温度，以确保检测到的热量完全来源于细菌代谢。当细菌代谢营养物质并增殖时，会释放热量，传感器可实时检测到这些热量。同时，将相同的试管放入培养箱中孵育。使用分光光度计测量光密度（OD）以监测细菌生长情况。利用稀释过程中的量热信号，构建热活性曲线，并将其与OD值进行关联。明显的第一个峰表明在指数生长期发生了有氧呼吸。当氧气变得受限时，细胞会转向无氧发酵，产生第二个明显的峰值。进入稳定期后，细菌会分泌酶以降解胞外蛋白质并维持代谢，从而产生一个宽峰。...

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8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的时间进程呈双相特征，表现为产物生成的快速爆发相和线性的稳态相。利用淬灭-流动技术，可分别测定爆发相速率和稳态速率，它们对应于8-氧代鸟嘌呤的切除以及糖基化酶从产物DNA上的释放。...

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