研究使用细胞外基体水凝胶的正常组织辐射效应
July 24th, 2019
该协议提出了一种在外体照射后,对母体乳腺脂肪垫进行去细胞化和随后水凝胶形成的方法。
该协议表明，辐射影响乳腺脂肪垫中脂肪组织的细胞外基质特性。在去细胞化模型中添加辐射以前没有做过。此技术使用几个洗涤步骤，每个步骤在去细胞化过程中都具有独特的化学用途。
这种技术的特异性允许更温和的化学洗涤，以更好地保持组织属性。乳腺癌复发发生在治疗后，特别是在三重阴性病例。评估辐照的细胞外基质如何改变肿瘤细胞行为将导致有关复发机制的重要发现。
辐照样品后，使用钚源，将辐照的 MFP 和完整的 RPMI 介质转移到生物安全柜中。将 6 厘米或 10 厘米的盘子装满足够的介质，以淹没 MFP 的介质。在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳孵育两天。
首先，将 MFP 放在六厘米的盘子中，配以五毫升的 Trypsin-EDTA 溶液。用70%乙醇喷洒和擦拭盘子，在37摄氏度下孵育一小时。使用 0.7 毫升过滤器用去压水清洗 MFP 的，将水浇在组织上三次。
使用钳子手动按摩洗涤之间的组织。接下来，在精细的任务上短暂干燥组织，擦拭并称重。将干燥组织放在预 <3>化的烧杯中，内含适当大小的搅拌棒，每克组织用 60 毫升 3%t-00-二氧乙烷醇覆盖组织。
在室温下搅拌一小时。然后将烧杯的内容放入过滤器中。用去维他水的洗杯冲洗，然后倒入纸巾。
再重复此冲洗过程两次，确保使用钳子在冲洗之间手动按摩组织。在此之后，短暂地干燥组织，在一个微妙的任务擦拭和称重。将组织和搅拌棒放回同一个烧杯中，用每克组织 4% 脱氧核酸 60 毫升覆盖它们。
在室温下搅拌一小时。接下来，将烧杯的内容物倒入网状过滤器中，用去维化的水冲洗烧杯，然后倒入组织。再重复此冲洗过程两次，确保使用钳子在冲洗之间手动按摩组织。
在精细的任务擦拭上，将冲洗过的纸巾短暂干燥并称重。将干燥的组织放入同一个烧杯中，以及新鲜的去iond水，辅以1%青霉素链霉素。用石蜡膜将烧杯紧紧盖住，并在4摄氏度下过夜。
第二天，将烧杯内装物排入过滤器中，在精细的任务中短暂干燥组织，擦拭并称重。然后，将 MFP 放在同一个烧杯中，并放置一个适当大小的搅拌棒。用含有4%乙醇和每克组织0.1%的乙酸溶液覆盖组织。
在室温下搅拌两小时。将烧杯内装物放入0.7毫米过滤器中。使用钳子手动按摩组织，将内装物放回烧杯中。
用每克组织 60 毫升 1X PBS 的覆盖来清洗组织。在室温下搅拌15分钟。重复整个洗涤过程一次。
接下来，将烧杯的内容放入0.7毫米过滤器中。使用钳子，手动按摩组织，将内装物放回烧杯中。用每克组织60毫升的去层水覆盖组织来清洗组织。
在室温下搅拌15分钟。重复整个洗涤过程一次。将洗净的组织短暂干燥，然后进行精细的擦拭并称重。
将组织和内装物倾倒到过滤器中，并使用钳子手动按摩组织。将内装物放回烧杯中，用每克组织100%n-丙醇的60毫升覆盖组织。在室温下搅拌一小时。
然后，在精细的任务擦拭和称重上简单干燥组织。将组织和内装物放入0.7毫米过滤器中，并用钳子手动按摩组织。将内装物放回烧杯中，用每克组织60毫升的去维水覆盖，清洗组织。
在室温下搅拌15分钟。重复此洗涤过程三次。在此之后，在精细的任务上短暂干燥组织，擦拭并称重。
将组织转移到标有15毫升的管子中，并在80摄氏度的负温度下冷冻过夜。首先，用液氮填充浅容器。从冰柜中取出样品，称重每个冻干型 MFP。
将一个样品放在砂浆中，用低温手套将砂浆放在液氮中。然后，使用附着在手持钻头上，磨出样品。每隔一分钟磨一次，检查进度，然后从液氮中取下戴手套的手。
对所有样品重复此铣削过程，确保在每个样品之间喷洒和擦拭砂浆和乙醇。将粉末状样品存放在 15 毫升管中，呈负 80 摄氏度，直到准备好使用。首先，从冰柜中取出样品，在室温下解冻。
当样品解冻时，将辣椒混合到盐酸中，形成百事可乐-HCL溶液。接下来，将样品粉和百事可乐-HCL溶液加入15毫升的管子中，加入一个小搅拌棒，搅拌48小时。在此之后，将管子放在冰上五分钟。
在每个样品中添加 10X PBS，使最终溶液的浓度为 1X PBS。然后，将 10%体积/体积、0.1 摩尔氢氧化钠添加到每个溶液中，达到 pH 7.4，使用 pH 纸单独测试每个溶液。使用 pH 7.4 凝胶溶液，将标有 4T1 细胞的颗粒 GFP 和荧光酶重新暂停至每毫升凝胶溶液的浓度为 500，000 或 1，000，000 个细胞。
在16井室滑梯的每个井中加入16微升凝胶细胞溶液，并在37摄氏度下孵育30分钟。在此之后，向每个井添加 100 微升的完整 RPMI 介质。继续在37摄氏度下孵育48小时。
然后，使用荧光显微镜观察519纳米的激发波长和618纳米的发射波长的细胞。本研究利用细胞外基质水凝胶对正常组织辐射效应进行了研究。赤氧树脂素和 eosin 染色用于通过DNA的核和其他痕迹的丧失来确认去细胞化。
而油红O染色用于评估脂质含量，并确认二土石质形态的保留。ECM 水凝胶的流变特性在 37 摄氏度下进行评估。储存模量高于所有条件下的损耗模量，表明水凝胶形成稳定。
标有4T1乳腺癌细胞的GP和荧光酶随后被封装在水凝胶中。细胞增殖通过荧光显微镜、光照测量和活力染色（封装后 48 小时）进行检查。辐照水凝胶在肿瘤细胞增殖方面呈上升趋势。
法罗丁结合用于在封装的细胞中可视化F-Actin。在将组织放入磨机之前，请记住冷却砂浆，温暖的砂浆可能会导致铣削不完整。处理 n-丙烷和辣椒时要小心，仅在化学罩下打开 n-丙烷和其他去细胞剂。
如果可能，在化学罩下称压辣椒，因为存在吸入危险。可以使用质谱法和拉曼光谱法评估辐照和去细胞化后 ECM 成分的变化。此外，还可以通过扫描电子显微镜分析 ECM 水凝胶的纤维结构。
这种方法有可能扩大，以检查辐射对肿瘤细胞的影响，不仅肿瘤细胞，而且免疫细胞，以及组织，体验辐射损伤，由于治疗。这种去细胞化技术将使研究人员能够评估辐射后组织的细胞外基质特性，这是大多数癌症的重要治疗选择。
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概述
本协议介绍了一种方法，用于体外照射后小鼠乳腺脂肪垫的去细胞化和随后的水凝胶形成。该技术允许使用更温和的化学洗涤以更好地保存组织特性，这对于研究辐射对细胞外基质特性的影响至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 肿瘤学
背景
- 辐射影响脂肪组织的细胞外基质特性。
- 去细胞化模型以前没有纳入辐射。
- 乳腺癌复发是一个重大问题，特别是在三阴性病例中。
- 了解受辐射影响的细胞外基质效应可以揭示复发机制。
研究目的
- 评估辐射如何影响小鼠乳腺脂肪垫中的细胞外基质。
- 开发一种保存组织特性的去细胞化方法。
- 研究受辐射影响的细胞外基质对肿瘤细胞行为的影响。
所用方法
- 具有特定洗涤步骤的去细胞化协议。
- 小鼠乳腺脂肪垫的体外照射。
- 从去细胞化组织形成水凝胶。
- 照射后评估细胞外基质特性。
主要结果
- 该协议成功去细胞化小鼠乳腺脂肪垫。
- 辐射改变了细胞外基质的特性。
- 更温和的化学洗涤保存了关键的组织特性。
- 获得的见解可能为解决乳腺癌复发的策略提供信息。
结论
- 本研究介绍了一种研究受辐射影响的脂肪组织的新方法。
- 研究结果可能导致对肿瘤复发机制有更好的理解。
- 该方法可以应用于癌症生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding how radiation alters the extracellular matrix in healthy breast tissue provides mechanistic insights into local tumor recurrence, a critical challenge in triple-negative breast cancer therapy. This method enables in vitro modeling of irradiated tissue microenvironments to de-risk target validation and assay development by linking ECM changes to tumor cell proliferation and cytoskeletal reorganization. It supports predictive confidence in preclinical models by capturing stromal contributions to therapy resistance and disease relapse.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how irradiated stromal ECM influences tumor cell behavior to clarify microenvironmental contributions to therapeutic resistance.
- Operational Value: Enables functional validation of stromal targets by assessing tumor cell proliferation and cytoskeleton organization in physiologically relevant hydrogels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible hydrogels with quantifiable rheological and biochemical outputs for compound screening in irradiated microenvironments.
- Operational Value: Supports assay scalability and reuse through lyophilized ECM powder storage and controlled rehydration for consistent experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant stromal-tumor interactions post-radiation to evaluate mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by preserving native ECM architecture and composition after irradiation and decellularization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable stromal platform that connects radiation-induced ECM changes to tumor cell phenotypes, informing lead identification and preclinical progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal-mediated resistance mechanisms by enabling controlled comparison of irradiated versus non-irradiated ECM on tumor cell behavior.
- Screening: Delivers assay-ready hydrogels with measurable proliferation and cytoskeletal readouts for evaluating modulator effects in a standardized microenvironment.
- Analytics: Provides quantitative outputs including fluorescence intensity, luminescence, and rheological parameters to compare conditions and assess stromal impact on tumor phenotypes.
- Translational Research: Models stromal-tumor crosstalk in irradiated tissue to align with preclinical evaluation of agents targeting microenvironmental drivers of recurrence.
- Enterprise Reuse: Enables platform standardization through lyophilized ECM storage, allowing reproducible hydrogel generation across teams and timepoints for longitudinal stromal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling stromal contributions to tumor recurrence and reducing mechanistic ambiguity in irradiated microenvironments.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization, irradiation, and hydrogel formation steps with defined washing and reagent parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying stromal targets that modulate tumor cell behavior post-radiation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutics based on efficacy in irradiated stromal contexts that mimic clinical relapse scenarios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, hydrogel handling, and fluorescence-based cell viability and cytoskeleton assays.
- Depends on access to irradiation equipment (e.g., cesium source), rheometers, and microscopy systems for proliferation and F-actin imaging.
- Necessitates cross-team standardization of tissue sourcing, irradiation dosing, and hydrogel preparation to ensure experimental consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other tissue types or stromal sources beyond murine mammary fat pads.
- Limited by the murine origin of the ECM, which may require validation in human-relevant stromal models for translational extrapolation.
