Name: 研究使用细胞外基体水凝胶的正常组织辐射效应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 了解小鼠乳腺脂肪垫脱细胞化及水凝胶形成方法，用于研究辐射对细胞外基质特性的影响。该技术采用温和化学洗涤步骤，有助于揭示乳腺癌复发机制。

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作者感谢 Laura L. Bronsart 博士提供 GFP 和荧光素酶标记的 4T1 细胞，Edward L. LaGory 博士在 1-([4-(二甲苯偶氮)苯基]偶氮)-2-萘酚染色方面的建议，Craig L. Duvall 博士在 IVIS 和冻干机使用方面的支持，以及 Scott A. Guelcher 博士在流变仪使用方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院资助项目 #R00CA201304 提供经费支持。

动物实验均遵循范德堡大学机构动物护理和使用委员会批准的机构指南和方案进行。
1. MFP 的制备与离体照射
<ol>
	<li>使用 CO&#173;2 窒息法处死裸鼠（Nu/Nu，8–10 周龄），随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>用 70% 乙醇清洁皮肤。</li>
	<li>使用预先灭菌的剪刀和镊子从处死的小鼠中采集乳腺脂肪垫（MFP），放入含有完全 RPMI 培养基（RPMI 添加 1% 青霉素-链霉素和 10% 胎牛血清）的 15 mL 圆底离心管中（参见材料表）。</li>
	<li>使用铯源对样品进行 20 Gy 的辐照。</li>
	<li>将辐照后的 MFP 和完全 RPMI 培养基转移至生物安全柜中。培养基的选择取决于最终水凝胶中要培养的细胞系。向 6 cm 或 10 cm 培养皿中加入足量培养基以完全浸没 MFP。对于 6 cm 培养皿，使用 8 mL 培养基；对于 10 cm 培养皿，使用 20 mL 培养基。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育两天。孵育时间可根据需要调整。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织，吸去多余液体，将 MFP 置于 15 mL 圆底离心管中，于 -80 °C 保存直至进行脱细胞处理。此冷冻步骤有助于后续脱细胞过程，即使下一步操作已准备就绪，样品也应进行冷冻。</li>
</ol>
2. 脱细胞化（改编自参考文献12,16,17）
注意：本方案改编自先前发表的脂肪脱细胞方法，该方法采用离子型去污剂脱氧胆酸钠而非十二烷基硫酸钠，以有效去除DNA12，16，17。
<ol>
	<li>在第1天，从-80 °C取出冷冻的MFPs，在室温下解冻。</li>
	<li>解冻后，用精细擦拭纸短暂吸干MFPs表面水分，并使用分析天平称重。</li>
	<li>使用带剪刀的镊子或手术刀，将组织切成3 mm × 3 mm × 3 mm的样本，用于完整细胞外基质（ECM）的研究，其余组织用于水凝胶制备。 
	注意：样本数量取决于检测方法的数量，例如下文描述采集两个样本：一个用于石蜡包埋（步骤2.5），另一个（如需要）用于在冷冻切片包埋介质中冷冻（参见材料表和步骤2.6）。</li>
	<li>称量组织。若需进行石蜡包埋切片，请继续进行步骤2.5；若需在冷冻切片包埋介质中冷冻切片，请继续进行步骤2.6。</li>
	<li>在化学通风橱中，将组织浸入10%中性缓冲福尔马林（NBF）（参见材料表）中，于4 °C固定24小时。用PBS洗涤3次，每次5分钟。再将组织浸入30%蔗糖溶液中，于4 °C孵育48小时。
	<ol>
		<li>在该组织块被移除后立即称重。继续进行步骤2.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在化学通风橱中，将MFP组织块放入已标记并装有冷冻切片包埋介质的包埋盒中，加入足量包埋介质以完全覆盖组织。
	<ol>
		<li>将包埋盒放入盛有2-甲基丁烷（参见材料表）的烧杯中，该烧杯需预先用液氮冷却。烧杯中应有足够2-甲基丁烷覆盖底部，但不足以淹没包埋盒，以确保冷冻切片包埋介质不与2-甲基丁烷直接接触。待包埋盒在2-甲基丁烷中静置至包埋介质完全冻结并变为不透明。</li>
		<li>用铝箔包裹包埋盒，标记后于-80 °C保存，直至用于切片。 
		注意：直接放入冷冻切片包埋介质的组织切片厚度为5 μm，而经蔗糖孵育的组织切片厚度为30 μm，以保持脂肪细胞形态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子手动揉捏剩余组织。 
	注意：组织块也可置于10% NBF中固定24–48小时，用PBS冲洗后转移至70%乙醇中保存，直至进行石蜡包埋。包埋后可切取5 μm切片用于苏木精-伊红（H &amp;#38; E）染色（见下文第7节）。</li>
	<li>将MFPs放入6 cm培养皿中，加入5 mL 0.02%胰蛋白酶/0.05% EDTA溶液，于37 °C孵育1小时。放入培养箱前，用70%乙醇喷洒并擦拭培养皿表面。</li>
	<li>使用0.7 mm滤网，将去离子水（DI）倾倒在组织上清洗三次。每次清洗之间使用镊子手动揉捏组织。</li>
	<li>用精细擦拭纸短暂吸干组织表面水分并称重。将组织和适当大小的搅拌子放入已预先高压灭菌的烧杯中。每1 g组织加入60 mL 3% t-辛基苯基聚氧乙烯醚（参见材料表），室温搅拌1小时。最少使用20 mL。</li>
	<li>将组织及溶液倒入滤网中。用&#160;DI&#160;水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上，重复两次。每次冲洗之间使用镊子手动揉捏组织。</li>
	<li>用精细擦拭纸短暂吸干组织表面水分并称重。将组织和搅拌子放回原烧杯中，每1 g组织加入60 mL 4%脱氧胆酸钠溶液，室温搅拌1小时。最少使用20 mL。</li>
	<li>将组织及溶液倒入网筛中。用DI水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上，重复两次。每次冲洗之间使用镊子手动揉捏组织。</li>
	<li>用精细擦拭纸短暂吸干组织表面水分并称重。</li>
	<li>将组织放入同一烧杯中，加入新鲜DI水并补充1%青霉素-链霉素。用封口膜严密封闭，于4 °C过夜孵育。</li>
	<li>清洗滤网和烧杯，以备次日使用。</li>
	<li>在第2天，将烧杯内容物倒入滤网中。用精细擦拭纸短暂吸干组织表面水分并称重。</li>
	<li>将MFPs放回同一烧杯中，加入适当大小的搅拌子。每1 g组织加入60 mL 4%乙醇/0.1%过氧乙酸溶液，最少使用20 mL，室温搅拌2小时。</li>
	<li>将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中。使用镊子手动揉捏组织。将内容物倒回烧杯中。每1 g组织加入60 mL 1× PBS覆盖组织，最少使用20 mL，室温搅拌15分钟。重复一次。</li>
	<li>将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中。使用镊子手动揉捏组织。将内容物倒回烧杯中。每1 g组织加入60 mL DI水覆盖组织，最少使用20 mL，室温搅拌15分钟。重复一次。</li>
	<li>用精细擦拭纸短暂吸干组织表面水分并称重。将组织及溶液倒入滤网中。使用镊子手动揉捏组织。</li>
	<li>将内容物倒回烧杯中。每1 g组织加入60 mL 100%正丙醇覆盖组织，最少使用20 mL，室温搅拌1小时。</li>
	<li>用精细擦拭纸短暂吸干组织表面水分并称重。将组织及溶液倒入0.7 mm滤网中。使用镊子手动揉捏组织。</li>
	<li>将内容物倒回烧杯中。每1 g组织加入60 mL DI水覆盖组织，最少使用20 mL，室温搅拌15分钟。重复三次。</li>
	<li>将组织及溶液倒入滤网中。重复步骤2.3–2.6，以收集用于蔗糖孵育及在冷冻切片包埋介质中冷冻的组织块。</li>
	<li>用精细擦拭纸短暂吸干组织表面水分并称重。将组织放入已标记的15 mL离心管中，于-80 °C冷冻过夜。</li>
</ol>
3. 冷冻干燥
<ol>
	<li>从 -80 °C 取出 15 mL 离心管，置于干冰上。在转移至冻干机前，始终保持样品在干冰上冷冻状态。</li>
	<li>取下管盖。使用橡皮筋将一块精细擦拭纸固定在管口上方以覆盖开口。将样品放入冻干机中，冻干至少 2 天。</li>
	<li>从冻干机中取出样品，将离心管放回干冰上。移除精细擦拭纸，用分析天平称量每个样品。盖上管盖，于 -80 °C 保存过夜。</li>
</ol>
4. 研磨
<ol>
	<li>用液氮填充一个浅容器。从 -80 °C 冰箱中取出样品。称量每份冻干的 MFP。</li>
	<li>将一份样品放入研钵中。使用低温手套将研钵固定在液氮中。</li>
	<li>使用连接在手持电钻上的研杵研磨样品。每隔 1 分钟研磨一次以检查进度，并将戴着手套的手从液氮中取出。每份样品至少研磨 5 分钟。</li>
	<li>对所有样品重复上述步骤。每次处理完一个样品后，用乙醇喷洒并擦拭研钵和研杵。</li>
	<li>将粉末状样品储存于 15 mL 离心管中，置于 -80 °C 冰箱中，直至使用。 
	注意：样品可立即使用，也可过夜储存。</li>
</ol>
5. 水凝胶的形成
<ol>
	<li>若在 -80 °C 下保存过夜，则取出并在室温下解冻。解冻过程中，计算每个样品所需的胃蛋白酶质量（见材料表）以及盐酸（HCl）体积，以配制含 1% w/v 样品粉末和 0.1% w/v 胃蛋白酶的 0.01 M HCl 溶液。将胃蛋白酶加入 HCl 中，形成胃蛋白酶-HCl 溶液。</li>
	<li>将样品粉末和胃蛋白酶-HCl 溶液加入 15 mL 离心管中。加入一个小的搅拌子，搅拌 48 小时。</li>
	<li>将离心管置于冰上 5 分钟。计算每个样品所需的 10x PBS 体积，使最终溶液中 PBS 浓度为 1x。向每根离心管中加入相应体积的 10x PBS。</li>
	<li>向每种溶液中加入 10% v/v 的 0.1 M NaOH，调节 pH 至 7.4。使用 pH 试纸&#160;分别检测。 
	注意：凝胶溶液可在 4 °C 下保存一周。</li>
</ol>
6. 将细胞包埋于水凝胶中
<ol>
	<li>使用GFP和荧光素酶标记的细胞
	<ol>
		<li>使用pH 7.4的凝胶溶液，将离心后的GFP和荧光素酶标记的4T1细胞重悬至凝胶溶液中，细胞浓度为500,000或1,000,000个细胞/mL。每孔加入16 µL凝胶-细胞混合液至16孔腔室载玻片的各孔中。在37 °C下孵育30分钟。</li>
		<li>向每孔加入100 µL完全RPMI培养基。继续在37 °C下孵育48小时。可在凝胶化后0小时、24小时和48小时通过荧光显微镜观察GFP和荧光素酶标记的细胞。 
		注意：可通过向各孔中加入(S)-4,5-二氢-2-(6-羟基-2-苯并噻唑基)-4-噻唑羧酸钾盐（参见材料表），孵育10分钟，然后使用生物发光成像系统（参见材料表）进行生物发光成像，以测定此处所用GFP和荧光素酶标记4T1细胞的细胞增殖情况。完成生物发光成像后，可对细胞骨架进行观察（参见第10节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用未标记细胞
	<ol>
		<li>使用pH 7.4的凝胶溶液，将离心后的未标记4T1细胞重悬至凝胶溶液中，细胞浓度为500,000或1,000,000个细胞/mL。每孔加入16 µL凝胶-细胞混合液至16孔腔室载玻片和96孔板的各孔中。在37 °C下孵育30分钟。</li>
		<li>向每孔加入100 µL培养基。继续在37 °C下孵育48小时。 
		注意：可测定细胞活力（参见第11节）。16孔腔室载玻片可用于成像，96孔板可用于定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. H&E 染色
<ol>
	<li>对于福尔马林固定、石蜡包埋的组织，将含有5 μm切片的载玻片先后两次浸入100%二甲苯中（每次5–10分钟）以脱蜡。随后依次浸入100%、95%、85%和70%乙醇中各5分钟进行水化，再用去离子水冲洗5分钟。继续进行步骤7.6。</li>
	<li>对于冷冻组织切片，立即从冰箱中取出切片，并浸入10%中性缓冲福尔马林（NBF）中固定10分钟。用1× PBS洗涤三次，每次5分钟。再用蒸馏水冲洗5分钟。</li>
	<li>用苏木精染色细胞核3分钟。用流动的自来水冲洗。</li>
	<li>用0.3%酸性乙醇（含0.3% HCl的70%乙醇）浸洗1–2次进行分化。再用流动的自来水冲洗5分钟。</li>
	<li>加入蓝化剂处理30秒。用流动的自来水冲洗5分钟。随后浸入95%乙醇中30秒。</li>
	<li>室温下用伊红染色90秒。在三份不同的100%乙醇中脱水，每次5分钟。</li>
	<li>先后两次浸入100%二甲苯中，每次5分钟。在载玻片上滴加二甲苯-塑料剂-苯乙烯（DPX）封片介质，加盖盖玻片。室温静置过夜固化后进行成像。</li>
</ol>
8. 1-([4-(二甲苯基偶氮)亚苯基偶氮])-2-萘酚染色
<ol>
	<li>配制1-([4-(二甲苯偶氮)苯基]偶氮)-2-萘酚溶液。
	<ol>
		<li>将0.5 g 1-([4-(二甲苯偶氮)苯基]偶氮)-2-萘酚粉末加入含有100 mL丙二醇的烧杯中。在搅拌条件下加热至95–100 °C，持续至少30分钟。注意温度不得超过100 °C。</li>
		<li>将烧杯移离热源，稍作冷却。将溶液通过4号定性滤纸过滤，以去除任何残留的不溶物。 
		注意：该溶液可在室温下保存，但在染色前应立即使用0.45 µm注射器滤器过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对冷冻组织切片进行染色。
	<ol>
		<li>从-80 °C冰箱中取出载玻片，在空气中干燥30分钟。将10%中性缓冲福尔马林（NBF）预冷至-20 °C，置于Coplin染色缸中冷却30分钟。室温下固定载玻片10分钟。用去离子水洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>用精细擦拭纸去除载玻片上多余的水分，然后将其浸入丙二醇中2次，每次5分钟。从丙二醇中取出载玻片，不要冲洗。</li>
		<li>将载玻片放入经注射器滤器过滤的油红O染色液中，室温下染色3小时。</li>
		<li>用85%丙二醇分化5分钟。用PBS冲洗样品2次，每次5分钟。</li>
		<li>用苏木精染色30秒。流水冲洗5分钟，然后将载玻片放入去离子水中。</li>
		<li>使用水溶性封片介质封片，并在成像前让封片介质过夜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 流变学
<ol>
	<li>将步骤5.4中的预凝胶溶液置于冰上，转移至流变仪。</li>
	<li>将25 mm的转子臂和测量板安装到流变仪上。打开连接流变仪的计算机上的流变学软件。</li>
	<li>执行旋转定位并确定零间隙。完成后升起转子臂。</li>
	<li>用移液器将500 μL预凝胶溶液加到测量板上。降低转子臂，直至预凝胶溶液完全充满测量板与转子臂之间的间隙。操作时应谨慎，若转子臂下降过度，会导致预凝胶溶液从侧面溢出。</li>
	<li>待预凝胶溶液在37 °C下保持30分钟后，对其执行0.1–100 Hz的频率扫描。</li>
	<li>测试完成后升起流变仪转子臂。用无尘擦拭纸轻轻擦去液体，用去离子水冲洗后再次用无尘擦拭纸擦干。对其他样品重复步骤9.4–9.6。</li>
</ol>
10. F-肌动蛋白的鬼笔环肽缀合物染色
<ol>
	<li>将鬼笔环肽偶联液恢复至室温。打开前短暂低速离心。分装足够用于实验的溶液，其余部分储存于 -20 °C。</li>
	<li>通过将 1 μL 1000 倍浓缩的鬼笔环肽偶联原液加入 1 mL 1× PBS + 1% 牛血清白蛋白（BSA）中，稀释为 1× 工作液。此体积足够用于 10 个孔（每孔 100 μL）。 
	注意：可使用单纯的 1× PBS，但推荐使用 1× PBS + BSA 以防止鬼笔环肽偶联物粘附管壁。该工作液在实验后不得保存。可加入 1 μL 蓝色荧光染料（见材料表）工作液以对细胞核进行染色。工作液的配制方法为：将 1 μL 20 mM 蓝色荧光染料与 11.3 μL 1× PBS 混合。</li>
	<li>吸除各孔中的培养基（步骤 6.1）。用 1× PBS 清洗各孔一次。</li>
	<li>加入 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）。室温孵育 20 分钟。去除上清液。用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>加入含 0.1% t-辛基苯基聚乙二醇醚（Triton X-100）的 PBS，孵育 5 分钟。吸除溶液，再用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>向每个孔中加入 100 μL 步骤 10.2 配制的工作液。室温孵育 1 小时。吸除溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。最后将样本置于 PBS 中，并于 4 °C 保存。</li>
	<li>吸除液体，从腔室载玻片的垫片上取下各孔。使用尖头镊子将垫片从载玻片上移除。使用水性封片介质对样本进行封片。静置固化（5 分钟）。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察细胞，激发/发射波长为 590/618 nm。</li>
</ol>
11. 活性检测
<ol>
	<li>用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗细胞。向每孔加入含有1 µM钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calcein AM）和2 µM乙啶同型二聚体（ethidium homodimer）的DPBS溶液100 µL，在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>使用荧光显微镜对16孔腔室载玻片进行成像。钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calcein AM）的激发/发射波长为494/517 nm，乙啶同型二聚体（ethidium homodimer）的激发/发射波长为528/645 nm。</li>
	<li>使用与步骤11.2相同的波长，在酶标仪上读取96孔板的荧光信号。</li>
</ol>

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<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration%3A+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该水凝胶的制备方法在很大程度上取决于起始组织的量。小鼠乳腺脂肪垫（MFP）体积较小，脱细胞过程会导致材料显著减少（表1）。可通过增加MFP的数量重复该过程，以提高最终产量。研磨是另一个可能导致材料损失的重要步骤。已有研究使用低温研磨机获得成功，但本方案采用手持研钵和带杵头附件的电动钻进行研磨8,17。这种方法具有设备成本较低且可最大限度减少材料损失的优点，但可能引入终产品的变异性。
在冷冻嵌入冰冻切片机包埋介质中的脂肪组织时，验证脱细胞和去脂化效果存在挑战。图2A展示了未辐照的MFP经石蜡包埋并切片后的H &amp;#38; E染色结果。在脂肪细胞边缘靠近细胞连接处可见清晰的细胞核，且脂肪细胞形态保持良好。图2B、C、E、F展示了将MFP通过包埋并冷冻于冰冻切片机包埋介质中，随后切...

癌症的特征是细胞过度增殖，能够逃避凋亡，并可转移至远处部位1。乳腺癌是美国女性中最常见的癌症类型之一，2018年估计有26.6万例新发病例和4万例死亡2。其中一种特别具有侵袭性且难以治疗的亚型是三阴性乳腺癌（TNBC），其缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER2）。放射治疗常用于乳腺癌患者在乳房肿瘤切除术后清除残留的肿瘤细胞，但仍有超过13%的TNBC患者在原发肿瘤部位出现复发3。
已知放射治疗在抑制转移和复发方面是有效的，因为肿块切除术与放射治疗相结合可获得与乳房切除术相同的长期生存率4。然而，最近的研究表明，在免疫功能低下的情况下，放射治疗与原发肿瘤部位的局部复发相关5,6。此外，众所周知，放射线通过诱导纤维化改变正常组织的细胞外基质（ECM）7。因此，理解放射诱导的ECM变化在决定肿瘤细胞行为中的作用至关重要。
脱细胞组织已被用作体外模型来研究疾病8,9。这些脱细胞组织可保留细胞外基质（ECM）的组成，并重现复杂的体内ECM环境。该脱细胞组织来源的ECM可进一步加工和消化，形成可重建的ECM水凝胶，用于研究细胞生长与功能10,11。例如，来源于脱细胞人脂肪抽吸物和心肌组织的可注射水凝胶已被用作组织工程的非侵入性方法，而来源于猪肺组织的水凝胶则被用作体外检测间充质干细胞黏附性与存活率的方法12,13,14。然而，正常组织在辐射损伤后对ECM特性的影响尚未被研究。
来源于细胞外基质（ECM）的水凝胶在体外研究体内现象方面具有最大的潜力。尽管已有多种其他材料被研究，包括胶原蛋白、纤维蛋白和基质胶（matrigel），但通过合成方法准确重现ECM的组成仍然十分困难13。使用ECM来源水凝胶的一个优势在于，ECM含有特定组织所需的蛋白质和生长因子14,15。保乳手术过程中对正常组织的照射会引起ECM的显著改变，而ECM来源的水凝胶可用于在体外研究这种效应。该方法有望推动构建更复杂、更精确的疾病体外模型。
在本研究中，我们对小鼠乳腺脂肪垫（MFP）进行了离体辐射处理。将MFP去细胞化后制备成预凝胶溶液，并与小鼠三阴性乳腺癌细胞系4T1共同包埋形成水凝胶。检测了水凝胶材料的流变学特性，并评估了肿瘤细胞在水凝胶中的动态行为。结果表明，由辐照后的MFP制备的水凝胶可促进肿瘤细胞增殖。后续研究将引入其他细胞类型，以探讨治疗后癌症复发背景下细胞间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林，带旋塞立方容器</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td>-</td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Alfa Aesar</td><td>19387</td><td>-</td></tr><tr><td>AR 2000ex 流变仪</td><td>TA Instruments</td><td>10D4335</td><td>rheometer</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1933-25G</td><td>-</td></tr><tr><td>钙黄绿素乙酰甲酯（calcein AM）</td><td>Molecular Probes, Inc.</td><td>C1430</td><td>-</td></tr><tr><td>萤火虫D-荧光素钾盐</td><td>Biosynth Chemistry &amp; Biology</td><td>L-8820</td><td>(S)-4,5-二氢-2-(6-羟基-2-苯并噻唑基)-4-噻唑羧酸钾盐</td></tr><tr><td>组织学用DPX封片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522-500ML</td><td>-</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td>-</td></tr><tr><td>伊红Y与品红混合染液</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>71304</td><td>伊红</td></tr><tr><td>溴化乙锭同源二聚体</td><td>Molecular Probes, Inc.</td><td>E1169</td><td>溴化乙锭同源二聚体-1 (EthD-1)</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926-500ML</td><td>-</td></tr><tr><td>Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. 包埋剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>冷冻切片包埋介质</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>水性封片介质</td></tr><tr><td>FreeZone 4.5</td><td>Labconco</td><td>7751020</td><td>冻干机</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液 (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>蓝色荧光染料</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>-</td></tr><tr><td>IVIS Lumina III</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td>生物发光成像系统</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes 擦拭纸</td><td>Kimberly Clark</td><td></td><td>精细操作擦拭纸</td></tr><tr><td>n-丙醇（无过氧化物/测序级），Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1130-500</td><td>-</td></tr><tr><td>油红O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>1-([4-(二甲苯偶氮)苯甲基]偶氮)-2-萘酚</td></tr><tr><td>OPS Diagnostics CryoGrinder 研磨仪</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td>CG-08-02</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>119-069-151</td><td>磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>-</td></tr><tr><td>来源于猪胃黏膜的胃蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>胃蛋白酶</td></tr><tr><td>过氧乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77240-100ML</td><td>-</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-iFluor 594 试剂 (ab176757)</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>鬼笔环肽偶联物</td></tr><tr><td>丙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W294004-1KG-K</td><td>-</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Signature Series 蓝化试剂</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7301L</td><td>蓝化剂</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Signature Series 苏木精 7211</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td>-</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>-</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠，98%</td><td>Frontier Scientific</td><td>JK559522</td><td>脱氧胆酸</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td>-</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>&lt;em&gt;t&lt;/em&gt;-辛基苯基聚氧乙烯醚</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>-</td></tr><tr><td>Whatman 定性滤纸，4号</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>4号定性滤纸</td></tr><tr><td>二甲苯（ACS认证级），Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5-4</td><td>-</td></tr></tbody></table>

利用细胞外基质水凝胶研究正常组织的辐射效应

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

放射治疗是三阴性乳腺癌患者的治疗手段之一。然而，放射治疗对健康乳腺组织细胞外基质（ECM）的影响及其在原发肿瘤部位局部复发中的作用尚不清楚。本文介绍一种从小鼠乳腺脂肪垫来源的细胞外基质制备脱细胞化、冻干及水凝胶构建的方法。我们展示了脱细胞化过程的有效性结果，并评估了其流变学参数。将表达绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶的乳腺癌细胞包埋于水凝胶中后，发现其在经放射处理的水凝胶中增殖增加。最后，采用鬼笔环肽偶联染料染色以观察包埋肿瘤细胞的细胞骨架结构。本研究旨在建立一种用于体外研究的水凝胶制备方法，以模拟体内乳腺组织微环境及其对放射治疗的响应，从而研究肿瘤细胞的行为特征。

采用 图1A 所示方法，在辐照后对MFPs进行脱细胞处理。图1B 和 图1C 分别展示了脱细胞前和脱细胞后的MFPs。通过苏木精-伊红（H &amp; E）染色确认脱细胞效果，并采用1-([4-(二甲苯偶氮)苯基]偶氮)-2-萘酚染色评估脂质含量（图2）。同时在37 °C下检测了ECM水凝胶的流变特性（图3）。在所有条件下，储能模量均高于损耗模量，表明形成了稳定的水凝胶结构。
将表达GFP和荧光素酶的4T1乳腺癌细胞包埋于水凝胶中。包埋后48小时，通过荧光显微镜观察、生物发光检测及活细胞染色评估细胞增殖情况（图4）。经辐照的水凝胶显示出肿瘤细胞增殖呈上升趋势。使用鬼笔环肽偶联物对包埋细胞中的F-actin进行染色以观察其分布（图5</s...

本方案介绍了一种在体外照射后对小鼠乳腺脂肪垫进行脱细胞处理并进一步形成水凝胶的方法。

放射治疗是三阴性乳腺癌患者的治疗手段之一。放射对健康乳腺组织细胞外基质（ECM）的影响……

本方案表明，辐射会影响小鼠乳腺脂肪垫中脂肪组织的细胞外基质特性。在脱细胞模型中加入辐射处理此前尚未见报道。该技术采用多个洗涤步骤，每个步骤在脱细胞过程中均具有特定的化学作用。该技术的特异性使得可以采用更温和的化学洗涤，从而更好地保持组织特性。乳腺癌在治疗后常出现复发，尤其是在三阴性病例中。评估经照射的细胞外基质如何改变肿瘤细胞行为，将有助于揭示复发机制的重要发现。使用铯源照射样品后，将照射过的MFP和完全RPMI培养基转移至生物安全柜中。用足量培养基填充6厘米或10厘米培养皿，以完全浸没MFP。于37°C、5%二氧化碳条件下孵育两天。首先，将MFP置于六厘米培养皿中，加入五毫升胰蛋白酶-EDTA溶液。用70%乙醇喷洒并擦拭培养皿，于37摄氏度孵育一小时。使用0.7毫升细胞滤网，通过将去离子水倾倒在组织上三次，清洗MFP。使用镊子在每次洗涤间隔手动按压组织。接着，将组织放在精细擦拭纸上短暂吸干后称重。将干燥后的组织放入预先高压灭菌的烧杯中，烧杯内放入适当大小的搅拌子，并按每克组织加入 60 毫升 3% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇覆盖组织。在室温下搅拌一小时。然后将烧杯中的内容物倒入滤网中。用去离子水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上。重复此洗涤过程两次，每次之间务必使用镊子手动按摩组织。之后，将组织在一张精细擦拭纸上短暂吸干并称重。将组织和搅拌子放回原来的烧杯中，并按每克组织加入60毫升4%脱氧胆酸覆盖。室温下搅拌一小时。接着，将烧杯中的内容物倒入网筛中，用去离子水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上。重复此冲洗过程再进行两次，每次冲洗之间务必使用镊子手动揉搓组织。将清洗后的组织在洁净的擦拭纸上短暂吸干并称重。将干燥的组织放入同一烧杯中，加入新鲜的去离子水和1%青霉素-链霉素。用封口膜严密封住烧杯，于4摄氏度下静置过夜。第二天，将烧杯中的内容物倒入滤网中，用精细擦拭纸短暂吸干组织，称重。然后，将MFP放入同一个烧杯中，并加入适当大小的搅拌子。每克组织用60毫升含有4%乙醇和0.1%过氧乙酸的溶液覆盖组织。室温下搅拌两小时。将烧杯中的内容物倒入0.7毫米的筛网中。使用镊子手动揉搓组织，并将内容物重新放回烧杯中。用每克组织60毫升的1×PBS覆盖组织进行洗涤，在室温下搅拌15分钟。重复整个洗涤过程一次。接下来，将烧杯中的内容物倒入一个0.7毫米的筛网中。使用镊子手动揉搓组织，然后将内容物重新放回烧杯中。按每克组织加入60毫升去离子水的量覆盖组织，以清洗组织。室温下搅拌15分钟。将整个洗涤过程再重复一次。用无尘纸轻轻擦干洗涤后的组织并称重。将组织及内容物倒入滤筛中，使用镊子手动揉搓组织。将内容物重新放回烧杯中，并按每克组织加入60毫升100%正丙醇覆盖组织。室温下搅拌一小时。然后，用无尘纸轻轻吸干组织并称重。将组织及内容物倒入一个0.7毫米的筛网中，用镊子手动揉搓组织。将内容物重新放回烧杯中，并按每克组织加入60毫升去离子水覆盖组织的方式清洗组织。室温下搅拌15分钟。重复此洗涤过程三次。之后，用无尘纸轻轻擦干组织并称重。将组织转移至已标记的15毫升离心管中，在负80摄氏度下冷冻过夜。首先，用液氮填充一个浅容器。从冰箱中取出样品，称量每份冻干的MFP。将一份样品放入研钵中，用低温手套将研钵置于液氮中固定。然后使用连接到手持电钻的研杵研磨样品。每隔一分钟研磨一次以检查研磨进度，并将戴着手套的手从液氮中取出。对所有样品重复此研磨过程，确保在处理每个样品之间用乙醇喷洒并擦拭研钵和研杵。将粉末样品储存于15毫升离心管中，置于负80摄氏度冰箱中，直至使用前。开始时，将样品从冰箱中取出，在室温下解冻。样品解冻的同时，将胃蛋白酶混入盐酸中，制成胃蛋白酶-盐酸溶液。接着，将样品粉末和胃蛋白酶-盐酸溶液加入一个15毫升离心管中，放入一根小搅拌子，搅拌48小时。此后，将离心管置于冰上放置5分钟。向每个样品中加入10倍浓度的PBS，使最终溶液的PBS浓度为1倍浓度。然后向每个溶液中加入终体积10%（体积/体积）的0.1摩尔氢氧化钠，使用pH试纸分别检测各溶液，调节至pH 7.4。使用pH 7.4的凝胶溶液，将沉淀的GFP和荧光素酶标记的4T1细胞重悬，使其浓度为每毫升凝胶溶液500,000或1,000,000个细胞。向16孔板的每个孔中加入16 µL凝胶细胞溶液，在37 °C下孵育30分钟。随后，向每个孔中加入100 µL完全RPMI培养基。继续在37 °C下孵育48小时。然后，使用荧光显微镜在激发波长519纳米和发射波长618纳米的条件下观察细胞。本研究利用细胞外基质水凝胶研究正常组织的辐射效应。通过细胞核及其他DNA痕迹的消失，采用苏木精和伊红染色法确认去细胞化效果。尽管油红O染色用于评估脂质含量并确认双相形态的保留，但ECM水凝胶的流变特性在37摄氏度下进行评估。在所有条件下，储能模量均高于损耗模量，表明形成了稳定的水凝胶。将表达GFP和荧光素酶的4T1乳腺癌细胞包埋于水凝胶中。包埋48小时后，通过荧光显微镜观察、生物发光检测及活细胞染色评估细胞增殖情况。经辐照的水凝胶显示出肿瘤细胞增殖呈上升趋势。使用鬼笔环肽偶联物对包封细胞中的F-肌动蛋白进行可视化。将组织放入研磨仪前请记得冷却研钵，温热的研钵可能导致研磨不充分。操作正丙醛和胃蛋白酶时需谨慎，仅可在化学通风橱下打开正丙醛及其他脱细胞试剂。如果可能，应在化学通风橱内称量胃蛋白酶，因为存在吸入风险。辐照和脱细胞处理后细胞外基质（ECM）成分的变化可通过质谱法和拉曼光谱法进行评估。此外，ECM水凝胶的纤维结构可通过扫描电子显微镜进行分析。该方法有望进一步拓展，用于研究辐射不仅对肿瘤细胞，而且对免疫细胞以及因治疗而遭受辐射损伤的组织所产生的影响。这种脱细胞技术将使研究人员能够评估辐射后组织的细胞外基质特性，而这对大多数癌症的重要治疗手段而言具有重要意义。

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JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

研究使用细胞外基体水凝胶的正常组织辐射效应

基底硬度对细胞功能的影响可被模拟 体外...

利用基于丙烯酰胺的水凝胶研究基质刚度对细胞功能的影响

本视频介绍了一种通过脱细胞化小鼠乳腺脂肪垫来制备细胞外基质水凝胶的技术 离体 辐照 用于 体外 研究。该水凝胶有助于模拟 体内...

去细胞化乳腺脂肪垫：从乳腺脂肪垫中提取细胞外基质水凝胶

本视频展示了一种用于研究细胞外基质（ECM）硬度对黏附细胞细菌感染影响的实验方法。将不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶覆盖胶原蛋白后，分层置于多孔板中，以模拟生理条件下ECM的硬度。将人内皮细胞接种于水凝胶表面，并用经基因工程改造、可在细胞内表达荧光蛋白的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria...

一种研究细胞外基质刚度对细菌感染影响的检测方法

粒子追踪微流变学可用于无损地定量分析并空间定位三维肿瘤模型中细胞外基质力学性质的变化。...

利用粒子追踪微流变学对三维肿瘤模型中细胞外基质刚度进行纵向测量

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

这是一种利用肺部细胞外基质制备三维细胞培养支架的方法。将完整的肺组织加工成水凝胶，该水凝胶可支持细胞在三维环境中生长。...

可调谐的肺部细胞外基质水凝胶用于三维细胞培养

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外...

用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

我们开发了一种基于多孔板格式的聚丙烯酰胺检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。该检测方法可与流式细胞术、免疫染色以及牵引力显微镜兼容，能够对细胞、其细胞外基质与致病菌之间的生物力学相互作用进行定量测量。...

一种基于多孔板格式聚丙烯酰胺的检测方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响

本实验方案描述了一种用于评估机械和生化信号对患者来源的胶质母细胞瘤细胞在三维基质模拟培养中化疗反应影响的实验平台，该平台采用定制的紫外光照装置，可实现具有可调机械特性的水凝胶的高通量光交联。...

水凝胶阵列可提高三维肿瘤模型中基质组分与治疗药物筛选的通量

在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型...

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

该方案阐明了应用于天然牛肺组织的两种不同脱细胞方法，并对其各自的表征进行了全面阐述。...

脱细胞肺细胞外基质水凝胶的开发与表征

了解小鼠乳腺脂肪垫脱细胞化及水凝胶形成方法，用于研究辐射对细胞外基质特性的影响。该技术采用温和化学洗涤步骤，有助于揭示乳腺癌复发机制。

利用细胞外基质水凝胶研究正常组织的辐射效应

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