利用细胞外基质水凝胶研究正常组织辐射效应

本方案表明，辐射会影响小鼠乳腺脂肪垫中脂肪组织的细胞外基质特性。在脱细胞模型中加入辐射处理此前尚未见报道。该技术包含多个洗涤步骤，每个步骤在脱细胞过程中均具有特定的化学作用。

该技术的特异性使得可以采用更温和的化学洗涤，从而更好地保持组织特性。乳腺癌在治疗后会出现复发，尤其是在三阴性病例中。评估经辐射的细胞外基质如何改变肿瘤细胞行为，将有助于揭示复发机制的重要发现。

使用铯源照射样品后，将照射过的MFP和完全RPMI培养基转移至生物安全柜中。用足量培养基填充6厘米或10厘米培养皿，以完全浸没MFP。于37°C、5%二氧化碳条件下孵育两天。

首先，将MFP置于六厘米培养皿中，加入五毫升胰蛋白酶-EDTA溶液。用70%乙醇喷洒并擦拭培养皿，于37摄氏度孵育一小时。使用0.7毫升细胞滤网，通过将去离子水倾倒在组织上三次，清洗MFP。

使用镊子在每次洗涤间隔手动按压组织。接着，将组织在精细擦拭纸上短暂吸干后称重。将干燥后的组织放入已预先高压灭菌的烧杯中，烧杯内放置适当大小的搅拌子，并按每克组织加入60毫升3% t-辛基苯基聚氧乙烯醚溶液以完全覆盖组织。

在室温下搅拌一小时。然后将烧杯中的内容物倒入滤网中。用去离子水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上。

重复此洗涤过程两次，每次之间务必使用镊子手动按摩组织。之后，将组织在一张精细擦拭纸上短暂吸干并称重。将组织和搅拌子放回相同的烧杯中，并加入每克组织60毫升的4%脱氧胆酸溶液覆盖。

室温下搅拌一小时。接着，将烧杯中的内容物倒入网筛中，用去离子水冲洗烧杯，并将冲洗液倒在组织上。重复此冲洗过程两次，每次冲洗之间务必使用镊子手动按摩组织。

用无尘纸轻轻吸干冲洗后的组织并称重。将干燥的组织放入同一烧杯中，加入新鲜的去离子水和1%青霉素-链霉素。用封口膜严密覆盖烧杯，并于4摄氏度下静置过夜。

第二天，将烧杯中的内容物倒入滤网中，用无尘纸短暂吸干组织，称重。然后，将MFP放入同一个烧杯中，并加入适当大小的搅拌子。每克组织用60毫升含有4%乙醇和0.1%过氧乙酸的溶液覆盖组织。

室温下搅拌两小时。将烧杯中的内容物倒入0.7毫米的滤筛中。使用镊子手动揉搓组织，并将滤过物重新放回烧杯中。

用每克组织60毫升的1×PBS覆盖组织进行洗涤，在室温下搅拌15分钟。重复整个洗涤过程一次。

接下来，将烧杯中的内容物倒入一个0.7毫米的筛网中。使用镊子手动揉搓组织，然后将内容物重新放回烧杯中。按每克组织加入60毫升去离子水的量覆盖组织，以清洗组织。

室温下搅拌15分钟。将整个洗涤过程再重复一次。用无尘纸轻轻吸干洗涤后的组织并称重。

将组织及内容物倒入滤网中，用镊子手动揉搓组织。将内容物重新放回烧杯中，并按每克组织加入60毫升100%正丙醇覆盖组织。室温下搅拌一小时。

然后，用无尘纸轻轻擦干组织并称重。将组织及内容物倒入一个0.7毫米的筛网中，用镊子手动揉搓组织。将内容物重新放回烧杯中，并按每克组织加入60毫升去离子水覆盖组织的方式清洗组织。

室温下搅拌15分钟。重复此洗涤过程三次。之后，用无尘纸轻轻吸干组织并称重。

将组织转移至已标记的15毫升离心管中，并在-80摄氏度下冷冻过夜。首先，用液氮填充一个浅容器。从冰箱中取出样品，称量每份冻干的MFP。

将一份样品放入研钵中，用低温手套将研钵固定在液氮中。然后使用连接到手持电钻的研杵研磨样品。每隔一分钟研磨一次以检查进度，并将戴着手套的手从液氮中取出。

对所有样品重复此研磨过程，确保在处理每个样品之间用乙醇喷洒并擦拭研钵和研杵。将粉末样品储存于15毫升离心管中，置于负80摄氏度冰箱中，直至使用前。开始时，将样品从冰箱中取出，在室温下解冻。

样品解冻的同时，将胃蛋白酶加入盐酸中，配制成胃蛋白酶-盐酸溶液。接着，将样品粉末和胃蛋白酶-盐酸溶液加入15毫升离心管中，放入一根小型搅拌子，搅拌48小时。此后，将离心管置于冰上放置5分钟。

向每个样品中加入10倍浓度的PBS，使最终溶液的PBS浓度为1倍浓度。然后向每份溶液中加入终体积10%（体积/体积）、0.1摩尔的氢氧化钠，使用pH试纸分别检测各溶液，调节至pH 7.4。使用pH 7.4的凝胶溶液，将沉淀的GFP和荧光素酶标记的4T1细胞重悬，细胞浓度为每毫升凝胶溶液500,000或1,000,000个细胞。

向16孔板的每个孔中加入16 µL凝胶细胞溶液，在37 °C下孵育30分钟。随后，向每个孔中加入100 µL完全RPMI培养基。继续在37 °C下孵育48小时。

然后，使用荧光显微镜在激发波长519纳米、发射波长618纳米的条件下观察细胞。本研究利用细胞外基质水凝胶研究正常组织的辐射效应。通过苏木精和伊红染色观察细胞核及其他DNA痕迹的消失，以确认去细胞化效果。

尽管油红O染色用于评估脂质含量并确认双相形态的保留，但ECM水凝胶的流变特性在37摄氏度下进行评估。在所有条件下，储能模量均高于损耗模量，表明形成了稳定的水凝胶。

将表达GFP和荧光素酶的4T1乳腺癌细胞包埋于水凝胶中。包埋48小时后，通过荧光显微镜、生物发光检测及活细胞染色法检测细胞增殖情况。经辐照的水凝胶显示出肿瘤细胞增殖呈上升趋势。

使用鬼笔环肽偶联物对包封细胞中的F-肌动蛋白进行可视化。将组织放入研磨仪前请记得冷却研钵，温热的研钵可能导致研磨不充分。操作正丙醛和胃蛋白酶时需谨慎，仅可在化学通风橱下打开正丙醛及其他脱细胞试剂。

如果可能，应在化学通风橱下称量胃蛋白酶，因为存在吸入风险。辐照和脱细胞处理后细胞外基质（ECM）成分的变化可通过质谱法和拉曼光谱法进行评估。此外，ECM水凝胶的纤维结构可通过扫描电子显微镜进行分析。

该方法有望进一步拓展，用于研究辐射对肿瘤细胞以及因治疗而受到辐射损伤的免疫细胞和组织的影响。这种脱细胞技术将使研究人员能够评估辐射后组织的细胞外基质特性，而辐射是大多数癌症治疗中的重要手段。