分化后再蛋白的人类多能干细胞衍生神经元，用于高含量的内尿成生和突合性成熟筛查
August 28th, 2019
该协议描述了一个详细的程序，用于重新悬浮和培养人类干细胞衍生神经元，这些神经元以前在体外与神经祖细胞分离了数周。该程序有助于以与光显微镜和高含量筛选相兼容的格式对神经亮物、突触和晚表达神经元标记进行基于成像的检测。
该协议有助于将人类多能干细胞衍生神经元用于高含量筛选应用。它特别适合检测突触，在人类神经元中需要长时间的培养。我们演示神经元从大格式盘到 HCS 兼容的多孔，以保持其生存能力的方式。
相反，我们表明，在重新补充和重放之前延长蛋白酶的孵化可以改善神经元存活率。人类多能干细胞衍生神经元在基础研究、药物开发和退行医学领域越来越重要。这种温和的滴定方法可用于重新暂停任何具有厚过程网络的细胞大单层。
除了人类 iPSC 之外，它还可用于重新镀显原神经元的培养，或重新用于事实排序或单细胞测序。必须仔细遵循协议步骤，并经常监测神经元从板的蛋白酶中调解分离。最佳孵育时间可能因培养而有所不同。
视觉演示使即使是没有经验的调查人员也能够重现此过程。首先用PBS轻轻冲洗分化神经元的板。将 PBS 分散到板壁上，而不是直接分散到电池上，以避免破坏它们。
从盘子边缘吸出PBS，同时翻倒它，注意不要触摸细胞。每10厘米板至少应用一毫升蛋白解酶。将细胞返回培养箱40至45分钟。
在孵育过程中，在相控显微镜上检查神经元，并继续蛋白酶治疗，直到神经网络完全脱离板并开始分离。当神经元分离时，停止消化，每增加五毫升新的 DEMEM 介质，每一毫升蛋白酶。使用血清移液器将细胞轻轻滴定在板上五到八次，确保不要施加太大的压力。
通过100微米网格将细胞应变成50毫升的圆锥管，一滴一滴。并用额外的五毫升新鲜DMEM介质冲洗过滤器。使用台式离心机将细胞以 1000 次 G 旋转五分钟。
离心后，将圆锥管返回生物安全柜并吸气大部分介质，留下 250 微升来保持细胞湿润。轻轻地将细胞重新在两毫升新鲜DMEM介质中，然后通过五毫升血清移液器的末端。最后，反转管子两到三次。
使用血细胞计和三脚架蓝色来计算可行的细胞。然后 DMEM 达到所需的浓度。根据特定细胞系的要求，在管中加入适当的补充剂，通过倾斜锥形管两到三次轻轻混合细胞。
从 24 井板中吸层压涂层，然后用 PBS 冲洗一次。吸气 PBS 。并在图八运动中将细胞溶液应用于每一个井，以避免出现咯咯声。
电镀完电池后，将板返回37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱。简要地涡旋早期细胞死亡记者的库存溶液，并按照手稿指示将其添加到井中。等待 20 分钟。
然后成像玻璃底部多孔上的活细胞和死细胞。延长蛋白酶孵育允许释放细胞内神经元网络。这导致分离时细胞死亡减少，并导致在以下几天内更有效地恢复。
使用延长的酶孵育程序，培养物在重放后几天内表现出大约两倍的细胞生存能力，并且死亡或死亡细胞的密度较低。神经元分化的过渡阶段在几天内发生，在此期间，细胞逐渐表达晚期神经元标记。这些标记在经过四周的预分化后重新镀金的培养中立即被检测到。
扩展蛋白酶协议也适度增强中性酯生长。总中性酯长度和树突生长均得到改善。重放也可用于研究突触。
在重放一周后，观察到突触前和突触后蛋白质的标记。此外，使用钙成像或多电位阵列可检测自发去极化和突触驱动电流的电活动。此重放过程可以适应多种类型的应用。
除了高含量筛选，以确定潜在的治疗化合物，它可用于成像生长锥或多电子阵列录音。已经形成长过程的神经元的机械分离是有压力的。拉长酶孵育和细胞的温和滴定是这一程序成功的基本步骤。
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概述
该协议概述了一种重悬浮和培养体外分化的人类干细胞源神经元的程序。该方法允许基于成像的神经突、突触和神经元标记物的检测，适用于高内容筛选应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 细胞培养技术
背景
- 人类多能干细胞源神经元对于研究突触至关重要。
- 这些神经元需要长时间的培养才能成熟。
- 在培养过程中提高神经元活力对于准确的检测至关重要。
- 该程序提高了重新铺板后的细胞恢复和活力。
研究目的
- 创建一种可靠的方法来培养人类干细胞源神经元。
- 展示高内容筛选的有效重新铺板。
- 优化蛋白酶孵育时间以改善细胞健康。
使用的方法
- 涉及人类多能干细胞源神经元的细胞培养方法。
- 利用了详细的蛋白酶处理以温和地分离细胞。
- 在协议中纳入了视觉检查以监控神经元的分离。
- 严格遵守孵育和重新铺板过程的时间表。
- 该方法可适用于其他神经元类型和应用。
主要结果
- 延长蛋白酶孵育时间改善了神经元存活率并减少了细胞死亡。
- 重新铺板后几天内展示了神经突生长和活力的增强。
- 重新铺板后一周内观察到突触蛋白的标记物。
- 可检测到电活动，表明存在功能性神经网络。
结论
- 该研究提供了一个可重复的神经元培养和检测应用协议。
- 提高的存活率和神经突生长为进一步研究神经元功能提供了便利。
- 研究结果有助于理解神经元机制和潜在的治疗途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Replating human pluripotent stem cell-derived neurons enables high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation within a compressed timeline, addressing the bottleneck of lengthy differentiation cycles in drug discovery. This approach supports scalable, reproducible assays for target validation and phenotypic screening in neurodegenerative disease models. By improving cell viability and preserving functional networks post-replating, the method enhances predictive confidence in early-stage compound evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through scalable assessment of neurite outgrowth and synaptic marker expression in human neurons.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation using late-stage neuronal markers such as NeuN and CTIP2.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid detection of compounds affecting neurite regeneration and synapse assembly within two weeks post-replating.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of uniformly distributed, viable neurons in 384-well formats for high-content imaging of neurite length and synaptic puncta.
- Operational Value: Ensures assay standardization through enzymatic dissociation and gentle titration, minimizing variability from mechanical stress.
- Scalability: Enables platform reuse across compound libraries and gene perturbation studies with consistent cell recovery and viability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal phenotypes from discovery through preclinical validation by preserving synapse maturation trajectories.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of pre- and post-synaptic protein expression and electrical activity as functional readouts for target engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on quantitative neuritogenesis and synaptogenesis readouts prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The replating method bridges early discovery and preclinical workflows by providing a scalable neuronal model compatible with high-content screening timelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative imaging of neurite outgrowth and dendritic arborization.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized dissociation and replating in multi-well formats.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outputs such as total neurite length, dendrite growth, and synaptic protein signal intensity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through detection of spontaneous electrical activity and synaptically-driven currents post-replating.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal plating capability applicable across multiple assay types and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurite and synapse formation assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through defined protease titration and gentle resuspension steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by shortening the time-to-assay for mature neuronal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on early-stage neuritogenesis and synaptogenesis efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell-derived neuronal culture and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to phase-contrast microscopy for monitoring neural network detachment during protease incubation.
- Necessitates standardized protocols for protease concentration, incubation time, and titration to ensure cross-lot consistency.
- Requires adaptation of coating and seeding densities when transitioning between different multi-well formats.
- Practical limitations include variability in optimal protease incubation time across cell lines and differentiation stages.
