茶树（Camellia sinensis L.）叶片新建立的悬浮细胞培养体系中六种系统性杀虫剂代谢的研究

茶是世界上最受欢迎的饮品之一。有时会使用农药来保护茶树免受病虫害。某些内吸性农药可能会由茶树中的酶合成。

然后通过氧化、水解或还原反应进行整合。植物细胞悬浮培养可用于作为一种简便的方法来研究农药的植物代谢行为。该方法具有多个优点。

首先，该方法可在游离微生物条件下操作，从而避免了微生物对农药降解的干扰。其次，该方法可随时为我们提供稳定的实验材料。最后，该方法还便于在单次实验中对农药行为的理论进行比较。

本研究通过不同颜色的茶叶建立茶细胞悬浮培养体系，并利用细胞悬浮培养的最佳状态比较六种农药的降解行为。本实验将由 Jiao Weiting 和 Ge Guoqin 进行。

这是我们的茶树无菌苗，可作为外植体的来源。用剪刀沿无菌叶片的中脉剪开，然后在培养皿中将每一半再分割成约0.3厘米×0.3厘米的小片。

将无菌外植体接种于含有2,4-D和KT的MS诱导培养基中。每个300毫升的培养瓶可放置六个外植体。将叶片外植体置于25°C恒温条件下避光培养。培养28天后，选取第一代诱导出的愈伤组织，转移至新的培养瓶中。

经过三到四次继代培养后，获得疏松且易变的愈伤组织。在无菌条件下，用无菌手术刀将从固体培养基上获得的较大、易变且疏松的愈伤组织切成小块。我们大约需要三克这样的愈伤组织小块。

将愈伤组织放入含有2,4-D和KT的B5培养基中。在黑暗条件下，于摇床培养箱中恒温培养液体细胞悬浮液。培养7至10天后，取出培养瓶，静置几分钟。吸取上清液，此处的沉淀物将被转移至新鲜培养基中继续培养。

去除沉淀的大愈伤组织。经过四到三次继代培养，每次培养周期为28天，获得最终状态良好的细胞悬浮培养物。在活力染色前，取活细胞样品在100摄氏度下保存10分钟，作为对照细胞。

将所有细胞悬浮培养物在6,000 G条件下离心8分钟。弃去上清液，将细胞重悬于5毫升PBS缓冲液中，手动振荡1分钟。加入2.5毫升TTC溶液，再次手动振荡。将混合物置于13摄氏度的静置培养箱中孵育1小时。

向四百微升的等分试样中加入新烟碱类杀虫剂噻虫嗪、啶虫脒、吡虫啉和Imideproxase的母液，以进行灭菌处理。将所有物质加入有机第一相。分别将敌百虫和氧乐果加入细胞悬浮培养物中。

在恒定温度和摇床培养箱转速条件下，培养含有杀虫剂的细胞悬浮液样品。在不同时间点取样。检测含有新烟碱类杀虫剂的样品时，取1毫升均一的细胞培养液 aliquot。

将其放入一个1.5毫升的塑料离心管中，在4,000 G条件下离心2分钟。将上清液经0.22微米滤膜过滤后，用于HPLC-UV和UPLC QTOF分析。为测试样品，请继续进行有机第一相步骤。

取500微升细胞培养液，转移至35毫升离心管或1.5毫升塑料离心管中。向含有500微升样品的35毫升离心管中加入0.1克氯化钠和5毫升提取溶剂。涡旋振荡混合物1分钟。

然后静置10分钟。取2.5毫升上清液至10毫升玻璃试管中，在14°C下使用氮气吹干仪蒸发至近干。用1毫升丙酮溶解残留物。

涡旋震荡一分钟，经0.22微米滤膜过滤后，进行气相色谱-火焰光度检测器（GC-FPD）分析。将五株植物分别放入4升的塑料盆中培养15天。分别向塑料盆中加入0微克/毫升或100微克/毫升的噻虫嗪或敌敌畏。

按照先前的方法制备完整的植物样品，但无需预浸泡，然后通过Orbitrap质谱法进行分析。使用高效液相色谱-紫外检测法（HPLCUV），在254纳米波长下检测噻虫嗪和啶虫脒的含量及其代谢产物，在270纳米波长下检测吡虫啉和吡虫啉代谢物Imideproxase的含量。采用气相色谱-火焰光度检测法（GC-FPD），使用毛细管柱检测乐果和氧乐果的含量。

使用配备C18柱的UPRC QTOF检测细胞培养物中杀虫剂的代谢物。采用UPLC Orbitrap质谱法检测试验植物提取物中杀虫剂的代谢物。无菌苗的愈伤组织相较于采摘茶叶所得愈伤组织，污染褐变程度较低，但诱导能力更高。

由无菌叶片诱导的愈伤组织始终呈亮黄色，而由采摘叶片诱导的愈伤组织则呈白色并带有褐色斑点。当KT浓度为0.1毫克/升时，愈伤组织呈黄色，质地疏松。当2,4-D浓度为1毫克/升且KT浓度为0.5毫克/升时，愈伤组织的生长速率最高，可达61.5%。

愈伤组织的生长数据最佳，其生长率最高达到46.9%。因此，茶树愈伤组织生长的最佳植物激素组合为每升1毫克的2,4-D和每升0.1毫克的KT。在继代培养周期为28天的情况下，到第四次继代培养时，愈伤组织已完全覆盖叶片，生长旺盛，呈淡黄色，质地疏松，无褐化现象。

通过比较愈伤组织的总体数据和细胞悬浮液的颜色，B5液体培养基更适用于细胞悬浮培养。细胞悬浮培养的OD值用于表示细胞生长量。在75天的培养过程中，每40毫升中加入15克的配比其OD值显著高于其他两种配比。

通过TTC染色法检测茶细胞悬浮培养物中的细胞活力。无色的TTC化合物可被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为红色的甲臜，而死细胞则不能发生此颜色变化。以上即为建立茶细胞悬浮培养体系的完整过程。

本研究是首次利用细胞悬浮培养技术对茶叶中不同农药代谢情况进行的比较研究。研究鉴定出多种农药代谢产物，并对其中部分代谢产物在贮存的茶树植株中进行了进一步分析。该新方法可作为茶叶或其他植物中农药代谢研究的模型。