Name: 从茶中提取的新建细胞悬浮培养基中六种系统杀虫剂的代谢研究(山茶西宁西斯L.叶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解茶树细胞悬浮培养技术，用于研究Camellia sinensis叶片中六种系统杀虫剂的代谢行为。该方法为植物代谢研究提供了可控的实验模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了国家重点研发计划的资助 &amp;中国国家重点研发计划（2016YFD0200900）、国家自然科学基金（编号 31772076 和 31270728）、中国博士后科学基金（2018M630700）以及茶叶生物化学与生物技术国家重点实验室开放基金（SKLTOF20180111）

1. 茶叶愈伤组织培养
注意：无菌叶片来源于本研究团队先前建立的体外培养植株系17。除在培养箱中培养的时间外，第5节之前的所有操作均在无菌超净工作台中进行。
<ol>
	<li>在高压灭菌（121 °C，20 分钟）前，将两种培养基（Murashige 和 Skoog [MS] 基本培养基与 Gamborg's B5 液体培养基）的 pH 值调节至 5.8。</li>
	<li>用剪刀沿无菌叶片的中脉剪开，然后在培养皿中将每一半进一步分割成约 0.3 cm × 0.3 cm 的小片。</li>
	<li>将无菌外植体（即小叶片段）放置于含有植物激素 2,4-D（1.0 mg L-1）和 KT（0.1 mg L-1）的 MS 基本培养基上。每个装有 100 mL MS 基本培养基的 300 mL 三角瓶中可放置六个外植体。</li>
	<li>&#160;将上述叶外植体在黑暗条件下于 25 °C 恒温培养。28 天后，选取第一代诱导出的愈伤组织并转移至新的三角瓶中（继代培养）。经过 3−4 次继代培养后，获得疏松易碎的愈伤组织。</li>
</ol>
2. 茶细胞悬浮培养
<ol>
	<li>在无菌条件下，使用无菌手术刀将固体培养基上生长旺盛、疏松易碎的愈伤组织切成小块（大小范围为 0.5−2 mm）。</li>
	<li>称取约 3 g 愈伤组织小块，放入含有 20 mL 添加了 2,4-D（1.0 mg L-1）和 KT（0.1 mg L-1）的 B5 液体培养基的 150 mL 三角瓶中。</li>
	<li>将液体细胞悬浮液置于摇床培养箱中，在恒定温度（25 ± 1 °C）、120 rpm 条件下避光振荡培养。</li>
	<li>培养 7 至 10 天后，取出培养瓶，静置数分钟。</li>
	<li>将全部上清液作为接种材料转接到新鲜培养基中进行继代培养（悬浮母液与新鲜培养基的传代比例为 1:1 至 1:2），去除沉淀的大块愈伤组织。</li>
	<li>经过每轮 28 天、共 3−4 轮继代培养后，获得最终生长良好的细胞悬浮培养物。</li>
</ol>
3. 细胞活力的氯化三苯基四氮唑检测法
<ol>
	<li>在进行活力染色前，将一部分活细胞样品在100 °C下加热10分钟，以杀死细胞作为对照。</li>
	<li>将所有细胞悬浮液在6000 × g 条件下离心8分钟。弃去上清液，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.3）重悬细胞，并手动振荡1分钟。</li>
	<li>加入2.5 mL 0.4%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液，再次手动振荡混匀。</li>
	<li>将混合液置于静置培养箱中（30 °C）孵育1小时。</li>
</ol>
4. 杀虫剂处理及茶树细胞悬浮培养物的取样
<ol>
	<li>分别向细胞悬浮培养物中加入400 µL过滤除菌的母液（浓度为500 µg mL-1）的四种新烟碱类杀虫剂（噻虫嗪、啶虫脒、吡虫啉和噻虫啉）或两种有机磷杀虫剂（乐果和氧乐果）。 
	注意：若目的是比较不同外源物质的行为，应使用同一批次的细胞悬浮培养物来测试不同化合物。</li>
	<li>将添加杀虫剂的细胞悬浮培养物样品置于恒温（25 ± 1 °C）摇床中，以120 rpm的转速培养。在第0、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70和75天取样（见步骤4.3或4.4）。</li>
	<li>检测含有新烟碱类杀虫剂的样品时，取1 mL均匀的细胞培养液，转移至1.5 mL塑料离心管中，在4000 × g 条件下离心2分钟。
	<ol>
		<li>将上清液通过0.22 µm孔径的滤膜过滤，随后采用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）和超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF）进行分析（材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测含有有机磷杀虫剂的样品时，取500 µL细胞培养液，转移至35 mL离心管或1.5 mL塑料离心管中（后者处理方式与新烟碱类杀虫剂样品相同）。
	<ol>
		<li>向35 mL离心管中的500 µL样品中加入0.1 g氯化钠和5 mL丙酮/乙酸乙酯（3:7, v/v）。</li>
		<li>涡旋混合1分钟，静置10分钟。</li>
		<li>取2.5 mL上清液转移至10 mL玻璃试管中，在40 °C条件下用氮吹仪浓缩至近干。</li>
		<li>用1 mL丙酮溶解残留物，涡旋1分钟，经0.22 µm滤膜过滤后，采用气相色谱-火焰光度检测器（GC-FPD）进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 带杀虫剂的完整茶树样品制备
注意：完整的茶树植株试验是在水培系统中进行的，使用茶苗在50 mL营养液（30 NH4+, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+, 20 Ca2+, 25 Mg2+, 0.35 Fe2+, 0.1 B3+, 1.0 Mn2+, 0.1 Zn2+, 0.025 Cu2+, 0.05 Mo+, 和 10 Al3+，单位为 mg L-1）中培养18。实验温室位于安徽农业大学，设置光照-黑暗循环（12小时光照和12小时黑暗），温度为20 °C。
<ol>
	<li>将五株植物放入4 L的塑料盆中培养15天。</li>
	<li>分别向塑料盆中加入0 ppm（对照）或100 ppm的噻虫嗪或敌敌畏。</li>
	<li>按照先前的方法制备完整植株样品，但无需预浸泡19，然后进行质谱分析以获得精确的质谱图。</li>
</ol>
6. 仪器分析
<ol>
	<li>新烟碱类杀虫剂代谢行为的高效液相色谱分析
	<ol>
		<li>使用高效液相色谱-紫外检测器（材料表）检测第&#160;4.3 节样品中噻虫嗪和啶虫脒在 254 nm 波长下的含量及代谢产物，以及吡虫啉和噻虫啉在 270 nm 波长下的含量及代谢产物。 
		注：高效液相色谱-紫外检测条件与先前研究19相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>有机磷类杀虫剂代谢行为的气相色谱分析
	<ol>
		<li>使用配备手性色谱柱的气相色谱-火焰光度检测器（材料表），检测第&#160;4.4 节样品中敌敌畏和甲基对氧磷的含量。</li>
		<li>以氮气作为载气，流速设定为 1.0 mL min-1。</li>
		<li>初始温度设为 120 °C，保持 5 分钟；以 30 °C min-1 的速率升温至 150 °C，保持 3 分钟；再以 10 °C min-1 的速率升温至 170 °C，保持 7 分钟；最后以 30 °C min-1 的速率升温至 210 °C，保持 5 分钟。</li>
		<li>进样口温度设为 200 °C，采用不分流模式；检测器温度设为 250 °C。</li>
		<li>进样体积设为 1 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养中杀虫剂代谢物的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析
	<ol>
		<li>使用配备 C18 色谱柱的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪（材料表），检测细胞培养样品（第&#160;4.3 节样品）中的杀虫剂代谢物。</li>
		<li>流速设为 0.2 mL min-1，进样体积设为 10 µL。</li>
		<li>对于新烟碱类杀虫剂处理的样品，初始流动相为 85% A（5 mM 甲酸铵水溶液）和 15% B（乙腈）；在 10 分钟内将流动相 B 升至 38%，然后在 1 分钟内恢复至 15%，保持 9 分钟。</li>
		<li>对于有机磷类杀虫剂处理的样品，初始流动相为 55% A（0.1% 甲酸水溶液）和 45% B（乙腈）；在 5 分钟内将流动相 B 升至 70%，然后在 0.5 分钟内恢复至 45%，保持 2.5 分钟。</li>
		<li>设定四极杆飞行时间质谱仪的操作参数如下：气化温度 325 °C；干燥气（氮气）流速 10 L min-1；鞘气温度 350 °C；鞘气流速 11 L min-1；毛细管电压 4000 V；喷嘴电压 1000 V；碎裂电压：新烟碱类杀虫剂为 100 V，有机磷类杀虫剂为 110 V；锥孔电压 65 V；正离子模式下运行。</li>
		<li>将仪器设为全扫描模式和目标 MS/MS 模式。</li>
		<li>使用精确质量分析工具处理数据；结合 MS/MS 注释及文献12,15,20,21,22 推断无标准品的代谢物结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完整植物提取物中杀虫剂代谢物的超高效液相色谱-轨道阱质谱分析
	<ol>
		<li>使用超高效液相色谱-轨道阱质谱法（材料表）检测完整植物提取物中的杀虫剂代谢物。</li>
		<li>设定质谱仪（材料表）操作参数如下：鞘气压力 35 arb；气化温度 300 °C；喷嘴电压 3.5 KV；毛细管温度 350 °C。</li>
		<li>洗脱程序参照上述步骤（6.3.3 和 6.3.4）中用于细胞培养样品的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析条件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+identification%2C+quantitation%2C+and+principal+component+analysis+of+green+pu-erh%2C+green%2C+and+white+teas+using+UPLC%2FDAD%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS.</a> Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).</li>
<li>Alcazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+green%2C+white%2C+black%2C+Oolong%2C+and+Pu-erh+teas+according+to+their+free+amino+acids+content%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).</li>
<li>Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+content+and+antioxidant+activity+of+green%2C+yellow+and+black+tea+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+and+Biological+Technologies+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves.</a> Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).</li>
<li>Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+QuEChERS+sample+preparation+method+for+the+analysis+of+70+pesticide+residues+in+tea+using+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).</li>
<li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+Nonsystemic+Behavior+of+the+Pesticide+Ferbam+on+Tea+Leaves+by+Engineered+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles.</a> Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).</li>
<li>Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+C-14-Ethion+insecticide+in+the+presence+of+deltamethrin+and+dimilin+pesticides+in+cotton+seeds+and+oils%2C+removal+of+ethion+residues+in+oils%2C+and+bioavailability+of+its+bound+residues+to+experimental+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).</li>
<li>Fang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+Dynamics+and+Dietary+Risk+Assessments+of+Two+Neonicotinoid+Insecticides+during+Lonicerajaponica+Planting%2C+Drying%2C+and+Tea+Brewing+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food%22%5BJournal%5D)">Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes.</a> Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).</li>
<li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissipation+pattern%2C+processing+factors%2C+and+safety+evaluation+for+dimethoate+and+its+metabolite+%28omethoate%29+in+tea+%28Camellia+sinensis%29%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis).</a> PloS One. 10 (9), e0138309(2015).</li>
<li>Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+intoxication+with+omethoate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fatal intoxication with omethoate.</a> International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).</li>
<li>Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residues+of+acephate+and+its+metabolite+methamidophos+in%2Fon+mango+fruit+%28Mangifera+indica+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Environmental+Contamination+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.).</a> Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).</li>
<li>Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+acephate+using+a+developed+bacterial+consortium+and+toxicological+analysis+using+earthworms+%28Lumbricus+terrestris%29+as+a+model+animal%5BTitle%5D)+AND+%22International+Biodeterioration+%26+Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal.</a> International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).</li>
<li>Ford, K. A., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metabolism+and+pharmacokinetics+of+seven+neonicotinoid+insecticides+in+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).</li>
<li>Frear, D. S., Swanson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+cisanilide+%28cis-2%2C5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide%29+by+Excised+Leaves+and+Cell+Suspension+Cultures+of+Carrot+and+Cotton%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).</li>
<li>Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+plant+cell+cultures+to+study+the+metabolism+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).</li>
<li>Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metabolite+profiling+of+the+insecticide+thiamethoxam+in+plant+and+cell+suspension+culture+of+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).</li>
<li>Lichtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+mobility+of+crop+protection+products%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phloem mobility of crop protection products.</a> Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+basal+ends+as+novel+explants+for+in+vitro+plantlet+regeneration+in+an+elite+clone+of+tea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Horticultural+Science+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea.</a> Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).</li>
<li>Meng, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+Translocation%2C+Metabolism%2C+and+Distribution+of+Glyphosate+in+Nontarget+Tea+Plant+%28Camellia+sinensis+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).</li>
<li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Extraction+Method+for+Determination+of+Neonicotinoid+Residues+in+Tea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).</li>
<li>Karmakar, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence%2C+metabolism+and+safety+evaluation+of+thiamethoxam+in+tomato+crop%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop.</a> Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).</li>
<li>Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Dimethoate+and+Metabolites+Following+Foliar+Application+to+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).</li>
<li>Lucier, G. W., Menzer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+oxidative+metabolites+of+dimethoate+formed+in+rats%2C+liver+microsomes%2C+and+bean+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).</li>
<li>Yang, G. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYang%2C+GW+%22Construction+of+Camellia+sinensis+Cell+Suspension+Culture+and+Primary+Study+on+Kineties%22">Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties</a>. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).</li>
<li>Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Metabolic+Behaviors+of+Six+Systemic+Insecticides+in+a+Newly+Established+Cell+Suspension+Culture+Derived+from+Tea+%28L.%29+Leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).</li>
<li>Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).</li>
<li>Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plant+growth+regulators+on+cell+growth+and+ginsenoside+saponin+production+by+suspension+cultures+of+Panax+quinquefolium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium.</a> Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoterpenoids+and+aroma+compounds+from+cell+suspension+cultures+of+Camellia+sinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%2C+Tissue+and+Organ+Culture%22%5BJournal%5D)">Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).</li>
<li>Lei, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevent+Browning+of+Axillary+Buds+in+vitro+Culture+of+Camellia+sinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis.</a> Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).</li>
<li>Hou, X., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+various+nitrogen+sources+on+the+growth+and+nitrate+assimilation+indicator+of+suspension+roselle+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Guihaia%22%5BJournal%5D)">The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell.</a> Guihaia. 18, 169-172 (1998).</li>
<li>Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenobiotic+Metabolism+in+Plants%3A+In+vitro+Tissue%2C+Organ%2C+and+Isolated+Cell+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques.</a> ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了建立茶树组织中农药代谢模型的详细过程，包括外植体的选择、细胞活力的测定，以及具有高代谢活性的茶树细胞悬浮培养体系的建立。在无菌环境中，植物组织的任何部分均可用于诱导愈伤组织25。本研究选用茶叶作为愈伤组织诱导材料，不仅因为叶片相较于地下部分更不易受污染，还因为叶片是该作物的可食用部分，也是农药施用的主要靶标部位。
本研究比较了从田间植株采集的叶片与从体外培养的无菌苗上切取的叶片诱导愈伤组织的诱导率及生长状况。与田间生长的叶片相比，无菌叶片的褐化率和污染率显著较低，且诱导率更高。这可能是因为田间植株的叶片不仅需要使用乙醇和汞进行表面消毒，还经历了生长环境的改变，而无菌苗叶片在无菌环境中培养，可直接使用，无需额外消毒处理。此外，在90天的培养期间，来源于体外培养无菌苗的愈伤组织表现出比田间叶片更强的生长活力。无菌苗叶片更适用于茶树愈伤组织的诱导，不仅因其具有较高的愈伤组织诱导率和较低的污染率，还因其预处理时间更短，且不受季节因素影响。
为了培养疏松易碎的愈伤组织，必须优化关...

茶是全球消费最广泛的非酒精饮料之一1,2。茶由木本多年生植物Camellia sinensis L.的叶片和芽叶加工而成。茶树通常在大规模种植园中栽培，易受多种害虫侵袭3,4。有机磷类和新烟碱类杀虫剂常作为内吸性杀虫剂5用于防治粉虱、叶蝉及某些鳞翅目昆虫等茶树害虫6,7。施用后，这些杀虫剂可被植物吸收或在体内转运。在植物体内，内吸性杀虫剂可能通过植物酶催化的水解、氧化或还原反应发生转化。这些转化产物通常比母体化合物极性更强、毒性更低。然而，某些有机磷类化合物的代谢产物生物活性反而更高。例如，乙酰甲胺磷可代谢为毒性更强的甲胺磷8,9，乐果可转化为氧乐果10,11。因此，植物代谢研究对于明确农药在植物体内的归趋具有重要意义12。
植物组织培养已被证明是研究农药代谢的有效平台，所鉴定的代谢产物与在完整植株中发现的相似13,14,15。利用组织培养，特别是细胞悬浮培养，具有多个优势。首先，实验可在无微生物条件下进行，从而避免了微生物对农药转化或降解的干扰。其次，组织培养可随时提供一致的实验材料。第三，与完整植株相比，从组织培养中提取代谢产物更为容易，且组织培养中干扰性化合物更少，化合物组成更简单。最后，利用组织培养可在单次实验中更方便地比较一系列农药的代谢情况16。
本研究成功建立了来源于无菌培养茶苗叶片的细胞悬浮体系。利用该茶细胞悬浮培养体系，比较了六种内吸性杀虫剂的消解行为。
本详细实验方案旨在提供一些指导，以便研究人员建立可用于研究外源物质在茶树中代谢去向的植物组织培养平台。

<table><tbody><tr><td>啶虫脒（99.8%）</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>46717</td><td>CAS 号：135410-20-7</td></tr><tr><td>乙腈（CAN，99.9%）</td><td>Tedia</td><td>AS1122-801</td><td>CAS 号：75-05-8</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Solarbio Science &amp; Technology</td><td>A8190</td><td>CAS 号：9002-18-0</td></tr><tr><td>噻虫胺（99.8%）</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>525</td><td>CAS 号：210880-92-5</td></tr><tr><td>敌百虫（98.5%）</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>109217</td><td>CAS 号：60-51-5</td></tr><tr><td>吡虫啉（99.8%）</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>91029</td><td>CAS 号：138261-41-3</td></tr><tr><td>噻虫啉（99.5%）</td><td>Toronto Research Chemical</td><td>I275000</td><td>CAS 号：105843-36-5</td></tr><tr><td>激动素（KT，&gt;98.0%）</td><td>Solarbio Science &amp; Technology</td><td>K8010</td><td>CAS 号：525-79-1</td></tr><tr><td>氧乐果（98.5%）</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>105491</td><td>CAS 号：1113-02-6</td></tr><tr><td>聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）</td><td>Solarbio Science &amp; Technology</td><td>P8070</td><td>CAS 号：25249-54-1</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5511</td><td>CAS 号：57-50-1</td></tr><tr><td>噻虫嗪（99.8%）</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>20625</td><td>CAS 号：153719-23-4</td></tr><tr><td>氯化三苯基四氮唑（TTC，98.0%）</td><td>Solarbio Science &amp; Technology</td><td>T8170</td><td>CAS 号：298-96-4</td></tr><tr><td>2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D，&gt;98.0%）</td><td>广州赛国生物科技</td><td>D8100</td><td>CAS 号：94-75-7</td></tr><tr><td>手性色谱柱</td><td>Agilent CYCLOSIL-B</td><td>112-6632</td><td>色谱柱（30 m &amp;times; 0.25 mm &amp;times; 0.25 &amp;mu;m）</td></tr><tr><td>气相色谱法（GC）</td><td>Shimadzu</td><td>2010-Plus</td><td>配备火焰光度检测器（FPD）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高效液相色谱法（HPLC）</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>配备紫外检测器（UV）</td></tr><tr><td>HSS T3 C18 色谱柱</td><td>Waters</td><td>186003539</td><td>色谱柱（100 mm &amp;times; 2.1 mm &amp;times; 1.8 &amp;mu;m）</td></tr><tr><td>超高效液相色谱法（UPLC）</td><td>Agilent</td><td>1290-6545</td><td>串联四极杆飞行时间质谱仪（QTOF）</td></tr><tr><td>超高效液相色谱法（UPLC）</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000-Q Exactive Focus</td><td>连接轨道阱质谱仪</td></tr></tbody></table>

茶树（camellia sinensis l.）叶片新建立的悬浮细胞培养体系中六种系统性杀虫剂代谢的研究

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

开发了一种利用茶树体外组织研究杀虫剂代谢的平台。将无菌茶苗的叶片接种于添加植物激素2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D，1.0 mg L-1）和激动素（KT，0.1 mg L-1）的MS基本培养基上，诱导其形成疏松愈伤组织。经过3至4轮、每轮28天的继代培养后，获得愈伤组织。将约3 g疏松愈伤组织接种至含相同植物激素的B5液体培养基中，在黑暗条件下于25 ± 1 °C的摇床（120 rpm）中进行培养。经过3−4次继代培养后，建立了来源于茶树叶片的细胞悬浮系，继代比例为1:1至1:2（悬浮母液：新鲜培养基）。利用该平台，向茶树叶片来源的细胞悬浮培养物中添加六种杀虫剂（每种浓度均为5 µg mL-1），分别为噻虫嗪、吡虫啉、啶虫脒、氯噻啉、敌敌畏和氧乐果。采用液相色谱和气相色谱技术追踪这些杀虫剂的代谢过程。为验证茶树细胞悬浮培养体系的有效性，通过质谱法比较了经处理的细胞培养物与完整植株中噻虫嗪和敌敌畏的代谢产物。在处理后的茶树细胞培养物中检测到七种噻虫嗪代谢物和两种敌敌畏代谢物，而在处理后的完整植株中仅检测到两种噻虫嗪代谢物和一种敌敌畏代谢物。与使用完整茶树植株相比，细胞悬浮培养体系简化了代谢分析过程，尤其适用于茶叶这类复杂基质的研究。

通过在MS培养基上培养28天后测定污染率、褐化率及愈伤组织诱导率，比较了采自田间茶树的叶片与在无菌环境中体外培养的茶苗叶片所诱导的愈伤组织（图1A）。在培养第20、37、62和90天时记录愈伤组织的生长情况（图1B）。在整个90天的培养期间，来源于体外培养叶片的愈伤组织生长比来源于田间种植叶片的愈伤组织更为旺盛。无菌叶片产生的愈伤组织呈亮黄色，而田间种植叶片产生的愈伤组织则呈褐色（图1B）。
在 1.0 mg/L 的浓度下-1 2,4-D23，对KT的浓度进行了优化。在0.05 mg L-1 KT，愈伤组织生长速度较慢，质地略为致密，颜色呈白色（<strong class="xfig"...

本研究提出了一种从茶（Camellia sinensis L.）叶片建立细胞悬浮培养体系的实验方案，可用于研究整株植物可吸收的外源化合物（如杀虫剂）的代谢过程。

茶树（Camellia sinensis L.）叶片新建立的悬浮细胞培养体系中六种系统性杀虫剂代谢的研究

一种利用茶树离体组织研究杀虫剂代谢的平台被建立。由无菌茶苗的叶片诱导形成……

茶是世界上最受欢迎的饮品之一。有时会使用农药来保护茶树免受病虫害。某些内吸性农药可能会由茶树中的酶合成。然后通过氧化、水解或还原反应进行整合。植物细胞悬浮培养可用于作为一种简便的方法来研究农药的植物代谢行为。该方法具有多个优点。首先，该方法可在游离微生物条件下操作，从而避免了微生物对农药降解的干扰。其次，该方法可随时为我们提供稳定的实验材料。最后，该方法还便于在单次实验中对农药行为的理论进行比较。本研究通过不同颜色的茶叶建立茶细胞悬浮培养体系，并利用细胞悬浮培养的最佳状态比较六种农药的降解行为。本实验将由 Jiao Weiting 和 Ge Guoqin 进行。这是我们的茶树无菌苗，可作为外植体的来源。用剪刀沿无菌叶片的中脉剪开，然后在培养皿中将每一半再分割成约0.3厘米×0.3厘米的小片。将无菌外植体接种于含有2,4-D和KT的MS诱导培养基中。每个300毫升的培养瓶可放置六个外植体。将叶片外植体置于25°C恒温条件下避光培养。培养28天后，选取第一代诱导出的愈伤组织，转移至新的培养瓶中。经过三到四次继代培养后，获得疏松且易变的愈伤组织。在无菌条件下，用无菌手术刀将从固体培养基上获得的较大、易变且疏松的愈伤组织切成小块。我们大约需要三克这样的愈伤组织小块。将愈伤组织放入含有2,4-D和KT的B5培养基中。在黑暗条件下，于摇床培养箱中恒温培养液体细胞悬浮液。培养7至10天后，取出培养瓶，静置几分钟。吸取上清液，此处的沉淀物将被转移至新鲜培养基中继续培养。去除沉淀的大愈伤组织。经过四到三次继代培养，每次培养周期为28天，获得最终状态良好的细胞悬浮培养物。在活力染色前，取活细胞样品在100摄氏度下保存10分钟，作为对照细胞。将所有细胞悬浮培养物在6,000 G条件下离心8分钟。弃去上清液，将细胞重悬于5毫升PBS缓冲液中，手动振荡1分钟。加入2.5毫升TTC溶液，再次手动振荡。将混合物置于13摄氏度的静置培养箱中孵育1小时。向四百微升的等分试样中加入新烟碱类杀虫剂噻虫嗪、啶虫脒、吡虫啉和Imideproxase的母液，以进行灭菌处理。将所有物质加入有机第一相。分别将敌百虫和氧乐果加入细胞悬浮培养物中。在恒定温度和摇床培养箱转速条件下，培养含有杀虫剂的细胞悬浮液样品。在不同时间点取样。检测含有新烟碱类杀虫剂的样品时，取1毫升均一的细胞培养液 aliquot。将其放入一个1.5毫升的塑料离心管中，在4,000 G条件下离心2分钟。将上清液经0.22微米滤膜过滤后，用于HPLC-UV和UPLC QTOF分析。为测试样品，请继续进行有机第一相步骤。取500微升细胞培养液，转移至35毫升离心管或1.5毫升塑料离心管中。向含有500微升样品的35毫升离心管中加入0.1克氯化钠和5毫升提取溶剂。涡旋振荡混合物1分钟。然后静置10分钟。取2.5毫升上清液至10毫升玻璃试管中，在14°C下使用氮气吹干仪蒸发至近干。用1毫升丙酮溶解残留物。涡旋震荡一分钟，经0.22微米滤膜过滤后，进行气相色谱-火焰光度检测器（GC-FPD）分析。将五株植物分别放入4升的塑料盆中培养15天。分别向塑料盆中加入0微克/毫升或100微克/毫升的噻虫嗪或敌敌畏。按照先前的方法制备完整的植物样品，但无需预浸泡，然后通过Orbitrap质谱法进行分析。使用高效液相色谱-紫外检测法（HPLCUV），在254纳米波长下检测噻虫嗪和啶虫脒的含量及其代谢产物，在270纳米波长下检测吡虫啉和吡虫啉代谢物Imideproxase的含量。采用气相色谱-火焰光度检测法（GC-FPD），使用毛细管柱检测乐果和氧乐果的含量。使用配备C18柱的UPRC QTOF检测细胞培养物中杀虫剂的代谢物。采用UPLC Orbitrap质谱法检测试验植物提取物中杀虫剂的代谢物。无菌苗的愈伤组织相较于采摘茶叶所得愈伤组织，污染褐变程度较低，但诱导能力更高。由无菌叶片诱导的愈伤组织始终呈亮黄色，而由采摘叶片诱导的愈伤组织则呈白色并带有褐色斑点。当KT浓度为0.1毫克/升时，愈伤组织呈黄色，质地疏松。当2,4-D浓度为1毫克/升且KT浓度为0.5毫克/升时，愈伤组织的生长速率最高，可达61.5%。愈伤组织的生长数据最佳，其生长率最高达到46.9%。因此，茶树愈伤组织生长的最佳植物激素组合为每升1毫克的2,4-D和每升0.1毫克的KT。在继代培养周期为28天的情况下，到第四次继代培养时，愈伤组织已完全覆盖叶片，生长旺盛，呈淡黄色，质地疏松，无褐化现象。通过比较愈伤组织的总体数据和细胞悬浮液的颜色，B5液体培养基更适用于细胞悬浮培养。细胞悬浮培养的OD值用于表示细胞生长量。在75天的培养过程中，每40毫升中加入15克的配比其OD值显著高于其他两种配比。通过TTC染色法检测茶细胞悬浮培养物中的细胞活力。无色的TTC化合物可被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为红色的甲臜，而死细胞则不能发生此颜色变化。以上即为建立茶细胞悬浮培养体系的完整过程。本研究是首次利用细胞悬浮培养技术对茶叶中不同农药代谢情况进行的比较研究。研究鉴定出多种农药代谢产物，并对其中部分代谢产物在贮存的茶树植株中进行了进一步分析。该新方法可作为茶叶或其他植物中农药代谢研究的模型。

study-on-metabolism-six-systemic-insecticides-newly-established-cell

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

从茶中提取的新建细胞悬浮培养基中六种系统杀虫剂的代谢研究(山茶西宁西斯L.叶

本文展示并讨论了用于调查节肢动物害虫对触杀型和内吸型杀虫剂的敏感性及检测其抗药性的技术。...

监测昆虫抗药性的生物测定方法

本手稿描述了如何利用双子叶杂草的离体叶片有效量化除草剂代谢速率，从而降低变异性，并消除在整株植物测定中通常观察到的除草剂吸收或转运可能带来的混杂效应。...

利用离体叶片测定法测量双子叶杂草中除草剂代谢速率

杀虫剂的评估通常针对成虫，而非幼期阶段。本文介绍了一种评估杀虫剂对床虫卵作用效果的实验方案，并与床虫第一龄若虫阶段进行比较。这些方案可经调整后用于其他昆虫，以评估杀虫剂在非成虫生活阶段的防治效果。...

一种评估杀虫剂对床虫（Cimex lectularius）卵和一龄若虫杀灭效果的方法

本文介绍了一种制备家蝇羧酸酯酶蛋白的实验方案 体外 利用杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统表达相关基因，并通过基于细胞的 MTT 实验对这些基因在代谢氯菊酯中的功能作用进行表征，从而阐明其介导拟除虫菊酯抗性的机制 体外...

杀虫剂抗性家蝇 Musca domestica 中羧酸酯酶的功能表征

本文介绍了一种利用选择性生物测定方法研究 Ectropis grisescens 末龄幼虫对土壤因子（例如，基质类型和含水量）的化蛹偏好性的实验方案。同时，我们还提供了一种非选择性生物测定方法的实验方案，用于确定影响E.

Ectropis grisescens 蛹化偏好与羽化成功率研究的选与非选生物测定法

本实验方案介绍了一种向独居蜂Osmia...

评估杀虫剂对独居蜂幼虫的影响

建立了一种利用绿色咖啡果实（GFs）检测杀虫剂对咖啡果小蠹（CBB）毒性的方法。在CBB侵染前或侵染后，将杀虫剂或有毒物质施用于已消毒的GFs上。评估了昆虫死亡率、驱避性、繁殖能力以及其他相关参数。...

防治咖啡果小蠹 Hypothenemus hampei 的控制药剂与杀虫剂测试方法

本实验方案描述了一种在植物中鉴定2,4-二溴苯酚代谢物的简单且高效的方法。...

阐明植物中2,4-二溴苯酚的代谢过程

本实验方案描述了一种强制喂养试验，用于评估植物化学物质对鳞翅目昆虫幼虫的潜在毒性作用。这是一种通量极高的昆虫生物测定方法，易于优化亚致死剂量和致死剂量、驱避活性以及生理效应。该方法可用于筛选环境友好型杀虫剂。...

开发一种取食测定系统以评估植物化学物质对棉铃虫Helicoverpa armigera的杀虫效果

该方案描述了一种评估三唑类农药代谢物在植物中整体细胞毒性的新方法。...

评估典型三唑类农药代谢物对植物的细胞毒性

了解茶树细胞悬浮培养技术，用于研究Camellia sinensis叶片中六种系统杀虫剂的代谢行为。该方法为植物代谢研究提供了可控的实验模型。

茶树（Camellia sinensis L.）叶片新建立的悬浮细胞培养体系中六种系统性杀虫剂代谢的研究

探索更多视频