Name: 用荧光显微镜分析膜受体扩散和簇簇的图像处理协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学习使用ImageJ、MATLAB和uTrack进行单分子追踪的图像处理协议，以量化膜受体的扩散系数和簇簇大小。该方法适用于多种颗粒结构，有助于深入理解细胞水平的生物学过程。

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我们感谢 Carlo Manzo 和 Maria García Parajo 在扩散系数分析方面提供的帮助及源代码。本工作部分得到了西班牙科学、创新与大学部（SAF 2017-82940-R）以及卡洛斯三世健康研究所 RETICS 计划（RD12/0009/009 和 RD16/0012/0006；RIER）资助项目的支持。LMM 和 JV 得到了西班牙国家研究委员会通用基金会 COMFUTURO 计划的支持。

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<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).</li>
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<li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+%28nanovid+microscopy%29.+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).</li>
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<li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Martinez-Munoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Actin-Dependent+Chemokine+Receptor+Nanoclustering+from+Dimerization+Indicates+a+Role+for+Clustering+in+CXCR4+Signaling+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function.</a> Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).</li>
<li>Destainville, N., Salome, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+correction+of+systematic+errors+due+to+detector+time-averaging+in+single-molecule+tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments.</a> Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述方法易于操作，即使没有任何使用Matlab的先前经验也能完成。然而，Matlab程序对各种命令的命名规范以及程序所使用文件夹的路径定位要求极为精确。在追踪分析程序（步骤3）中，可修改多个参数。“设置高斯混合模型拟合”窗口（步骤3.8）控制U-track如何在视频中检测单个粒子，该过程通过拟合高斯混合模型实现，具体方法如文献3所述。该拟合过程中的一个关键参数定义了用于识别局部极大值的滤波器。此操作的成功与否取决于图像对比度以及图像中存在的噪声水平。第一个参数（与局部背景比较的Alpha值）控制将一个极大值判定为真实光斑的置信度，而第二个参数有助于在光斑识别过程中降低噪声。在“追踪”步骤（3.9）中，重要参数包括用于填补间隙的帧数（即一条轨迹可以跨越粒子未实际出现的帧，但该粒子在这些帧之前和之后均可见；在本示例中为0），以及一条轨迹必须跨越的最少帧数才能被视为有效轨迹（在本示例中为20；该参数与相机采集速度相关，且轨迹中的帧数需足够以支持扩散系数的计算）。此外，还需决定是否合并和拆分轨迹片段（在本示例中选择了这两种选项）。随后，必须设置代价函数中步骤1（帧间连接）的参数。该函数控制粒子在各...

由于热扩散作用，嵌入脂双层中的膜蛋白处于持续运动状态。膜蛋白的动态特性对于调控细胞反应至关重要，因为分子间相互作用可形成从单体到寡聚体等不同大小的复合物，并影响信号传导复合物的稳定性。因此，阐明调控蛋白质动态行为的机制已成为细胞生物学领域的新挑战，这对于理解信号转导通路以及发现未知的细胞功能具有重要意义。
一些光学方法已被开发用于在活细胞中研究这些相互作用1。其中，全内反射荧光（TIRF）显微镜技术于20世纪80年代初期发展起来，可用于研究细胞膜上或非常接近细胞膜的分子相互作用2。为了研究从活细胞TIRF数据中获得的膜蛋白运动轨迹的动态参数，需要采用单粒子追踪方法（SPT）。尽管已有多种算法可用于此目的，但我们目前使用的是Jaqaman等人3发表的方法，该方法通过在连续帧之间连接粒子，将生成的轨迹片段整合为完整的轨迹（包括粒子暂时消失的情况），从而解决了高密度粒子场中粒子运动异质性的问题。该软件能够捕捉由聚集和解离事件引起的粒子合并与分裂过程3。该软件的输出数据之一是通过定义每个帧中粒子的X和Y位置，来检测整个轨迹上的粒子。
一旦检测到粒子，我们将应用不同的算法来确定短时间滞后扩散系数（D1-4）4,5。通过应用矩量标度谱（Moment Scaling Spectrum, MSS）6,7,8 分析，或通过调整均方位移（Mean Square Displacement, MSD）曲线拟合“alpha”值9，我们还可根据轨迹类型对粒子进行分类。
荧光图像中斑点强度的分析是该领域科学家共同关注的目标10,11。最常用的算法是所谓的“数目与亮度”（Number and Brightness）法。然而，该方法无法对可移动组分中的颗粒实现逐帧的准确强度检测。因此，我们开发了一种新算法，用于逐帧评估这些颗粒的强度，并确定其聚集状态。在使用U-Track2软件3检测到每个颗粒的坐标后，我们对其在整个轨迹过程中的每一帧定义其强度，同时考虑每帧中的细胞背景信号。该软件提供了多种选项用于确定斑点强度和细胞背景，并通过已知的单体和二聚体蛋白作为参考，计算所检测颗粒中蛋白质的大致数量（即簇大小）。
本文中，我们详细描述了执行以下三个步骤的方法：1）利用 U-track 对荧光显微镜视频中的单个粒子进行检测与追踪；2）通过 MSS 分析这些粒子的瞬时扩散系数（D1-4），并对具有较长轨迹的粒子判断其运动类型（受限运动、自由运动或定向运动）；3）测量每个荧光斑点在视频序列中的斑点强度，并根据估计的背景荧光进行校正。该方法可实现对聚集体大小的估算，并识别光漂白步进过程。
使用本实验方案无需特殊技能，任何具备细胞培养、流式细胞术和显微镜设备的实验室均可开展。该方案使用 ImageJ 或 Fiji（ImageJ 的一个发行版本12）、U-track3 以及一些临时编写的程序（http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip）。U-track 和临时编写的程序在 Matlab 环境下运行，Matlab 可安装于任何兼容的计算机上。

<table><tbody><tr><td>人 Jurkat 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-10915</td><td>人类 T 细胞系。任何其他细胞类型均可使用该软件进行分析</td></tr><tr><td>pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP</td><td>Clontech</td><td>632469</td><td>可使用本实验流程追踪和分析不同的荧光蛋白</td></tr><tr><td>Gene Pulse X Cell 电穿孔仪&amp;nbsp;</td><td>BioRad&amp;nbsp;</td><td></td><td>我们对 Jurkat 细胞使用 280 V、975 mF 的参数。&amp;nbsp; 请采用在您实验条件下最有效的转染方法。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cytomics FC 500 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios 细胞分选仪&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>根据转染效率的不同，可能无需进行细胞分选。&amp;nbsp; 您也可使用稳定表达适量目标受体的细胞。</td></tr><tr><td>Dako Qifikit</td><td>DakoCytomation</td><td>K0078</td><td>用于定量细胞表面受体的数量</td></tr><tr><td>玻璃底微孔培养皿</td><td>MatTek 公司</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>人血浆来源纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>重组人 CXCL12</td><td>PeproTech</td><td>300928A</td><td></td></tr><tr><td>Leica AM TIRF 倒置显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD 相机</td><td>Andor&amp;nbsp;</td><td>DU 885-CSO-#10-VP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-Track2 软件</td><td>Danuser 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>FiJi</td><td>FiJI</td><td></td><td>https://imagej.net/Fiji)</td></tr><tr><td>u-Track2 软件</td><td></td><td></td><td>Matlab 工具。&amp;nbsp; 安装时，请从网页（http://lccb.hms.harvard.edu/software.html）下载 .zip 文件，并解压至您选择的目录中</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad 软件</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于荧光显微镜分析膜受体扩散与簇大小的图像处理方案

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

如今，在许多生物学研究中，对视频序列中的颗粒进行追踪并对其轨迹进行后续分析已成为一项常见操作。本文以细胞膜受体簇的分析为模型，详细介绍使用Fiji（ImageJ）和Matlab程序完成该图像分析任务的实验方案：1）定义感兴趣区域，并针对这些区域设计相应的掩膜；2）在荧光显微镜视频中追踪颗粒；3）分析选定轨迹的扩散特性和荧光强度特征。通过对荧光显微镜结合图像处理所获得的扩散系数、运动类型和簇大小等参数进行定量分析，可为客观评估颗粒动力学行为以及环境条件改变所造成的影响提供有力工具。本文提供了针对这些特征分析的详细操作流程。该方法不仅能够实现单分子追踪检测，还可自动化估算细胞膜上的侧向扩散参数，对轨迹类型进行分类，并实现全面分析，从而克服了在细胞膜上对颗粒在整个运动轨迹中大小变化进行定量测量的技术难题。

本方案可用于对荧光显微镜视频中检测到的颗粒进行自动追踪，并分析其动态特征。首先，将待追踪的荧光标记蛋白转染至细胞中。通过细胞分选获得细胞表面适量的受体表达水平，以满足单颗粒追踪（SPT）的要求（图1）。随后，对筛选出的细胞进行全内反射荧光（TIRF）显微镜分析，获得可用于本方案所述工具分析的视频数据（补充视频1）。
生成的视频无法直接进行分析，需要提取每个视频的独立帧。使用 ImageJ 可生成能够通过 Matlab 软件读取的文件，例如 .tiff 格式的视频帧或掩膜。U-track 对所选视频中观察到的粒子进行追踪，并将信息保存为 Matlab (.mat) 文件movieData.mat, 通道1检测结果.mat，通道1.mat，通道1追踪结果.mat），参见 图2</stro...

本文介绍了一种用于单粒子追踪图像分析的实验方案，可对荧光显微镜检测到的单个粒子的扩散系数、运动类型和簇大小进行定量评估。

在当今许多生物学研究中，对视频序列中的颗粒进行追踪并对其轨迹进行后续分析已成为一项常见操作。使用……

新的显微镜技术需要开发适当的工具，以正确理解所研究的生物学过程。本方案描述了单分子追踪所需的图像处理步骤，包括细胞膜上分子在整个轨迹过程中侧向扩散参数的估计和斑点尺寸的量化。该方案结合使用了多种软件，包括 ImageJ、MATLAB 和 uTrack，以及一些为此方案专门开发的蛋白质。本方法以光学显微镜下膜受体的追踪为例进行说明，但也可应用于任何在视频序列中可随时间追踪其轨迹的类颗粒结构。该技术属于基础研究范畴，在临床环境中无直接应用。然而，它可用于辅助表征不同疾病中的生物学事件，从而有助于发现新的治疗靶点。本方案适用于细胞膜中颗粒的追踪，如本视频所示，也可用于完整细胞、细菌、流体中的纳米颗粒或其他任何其中心位置能够准确确定的物体的追踪。本方案操作友好，仅需具备细胞培养和显微镜技术的相关知识。然而，本方案所采用的多种技术与信息学工具可能会让初学者望而生畏。通过可视化演示，可帮助研究者自信地掌握该技术。首先，培养Jurkat细胞，用单体GFP标记的趋化因子受体载体转染这些细胞，并根据随附的文字方案，筛选出标记载体表达水平较低的细胞。向每孔已包被纤维连接蛋白的35毫米玻璃底微孔培养皿中加入含有CXCL12配体的培养基或对照培养基，在37摄氏度下孵育1小时。接下来，将分选后的细胞加入每个培养皿中，在成像前孵育20分钟。孵育结束后，将第一块培养皿转移至TIRF显微镜载物台上，并切换至100倍油浸物镜。使用明场模式定位细胞并进行聚焦，以尽量减少光漂白效应。然后切换至全内反射荧光（TIRF）模式，并使用低激光强度进行精细调焦。采集时长约50秒的视频，尽量缩短帧间时间间隔。针对每种实验条件的视频文件，按照本视频文字方案中所述的文件结构要求，创建一个新的文件夹。通过将文件拖放到 Fiji 菜单栏上，使用 Fiji 或 ImageJ 打开视频，并单击“确定”以使用 bioformats 导入 LIF 文件。为了设计掩膜，还需导入相应的多通道图像。接下来，首先使用对掩膜设计有用的通道创建一幅单通道图像，以创建掩膜。在菜单栏中选择“图像”，然后依次点击“颜色”和“拆分通道”，将不同通道显示为单独的图像。再次通过在菜单栏中选择“图像”，进入“颜色”并选择“合并通道”，将三个通道合并为单一图像。请确保选择正确的通道，然后点击“确定”生成新的非堆叠图像。通过点击菜单栏，选择“Analyze”，然后进入“Tools”并选择“Sync Windows”，以同步两个窗口。此时将显示一个包含同步图像选项的新窗口。现在，两个窗口已同步，可对两个窗口中的相同区域进行裁剪。转到菜单栏中的“图像”并选择“裁剪”。使用矩形选择工具绘制感兴趣区域。两个裁剪后的图像将分别显示。接下来，取消两个窗口的同步。如果尚未创建蒙版，请使用选择工具绘制感兴趣区域并进行裁剪。之后，将视频作为图像序列保存到 Videosec 目录中。然后选择多通道图像，点击菜单中的 Plugins，选择 Segmentation Editor 以打开分割编辑器插件。选择自由绘制选择工具，用其选中一个绿色标签并设计最外层的掩膜。设计完成后，按下复合窗口中选择选项的加号按钮，所选掩膜即会在查看器中显示。对所有标签重复此步骤。所有掩膜设计完成后，将掩膜保存为与视频相同的文件名，命名为：mask.tif。打开 MATLAB，通过进入“设置路径”并选择“添加并包含子文件夹”，将 uTrack 目录添加到路径中。然后，将工作目录更改为包含待分析序列的目录。在控制台中输入 Movie Selector GUI 并按 Enter 键以启动 uTrack。这将打开视频选择窗口。点击“新建视频”按钮，等待视频添加窗口出现。点击“添加通道”以选择包含视频的目录，并填写视频信息参数。将uTrack结果的输出目录设置为“Results”，然后点击“高级通道设置”，填写与采集相关的参数，最后保存。制作完视频后，在视频选择窗口中点击“继续”。此时，uTrack 将询问要分析的对象类型。选择“单个粒子”，随后将出现控制面板窗口。接下来，选择第一步“步骤1：检测”，然后点击“设置”。此时将出现“设置高斯混合模型拟合”窗口。输入此处所示的参数设置，然后点击“应用”。在控制面板中，单击“运行”以执行检测步骤。几分钟后，按“结果”按钮查看检测结果。视频中会在检测到的颗粒上显示红色圆圈。如果没有显示红色圆圈，则说明此步骤未正确完成，您应重新尝试。现在，首先按此处所示设置参数，将刚刚检测到的粒子合并为跨越多个帧的轨迹，然后在控制面板中点击运行。接下来，执行轨迹分析。按照此处所示设置参数，然后点击应用并运行。首先点击结果按钮，验证结果，随后在视频选项窗口中点击显示轨迹编号，逐帧检查每条轨迹是否被正确识别，并手动标记非真实粒子的颗粒。在 MATLAB 中输入此处所示的命令。该命令将使程序读取所有轨迹并计算扩散系数。接下来，通过提供需要排除的斑点列表，排除对应于错误识别的斑点或轨迹的轨迹。根据随附的文字方案，计算该细胞每条轨迹的瞬时扩散系数。在此情况下，计算时间滞后等于4时的扩散系数，记为D1至4。完成后，将轨迹分解为短轨迹和长轨迹。为了分析长轨迹，请输入此处所示命令，通过其矩缩放谱来分类运动类型。分析每个粒子在其轨迹上的强度变化。通过参考随附的文字版实验方案，可以以多种不同方式配置这一基本行为。然后，收集所有轨迹的扩散系数和强度信息。仅收集短轨迹的扩散系数和强度信息。最后，通过输入以下命令来收集矩谱标度和强度信息，其中 long 是之前使用的后缀。本方案所述技术可用于对荧光显微镜视频中检测到的颗粒进行自动追踪，并分析其动态特征。通过该分析，可获得不同刺激条件下颗粒行为的多种特征，包括基于四种不同刺激条件下的静止斑点百分比、长度超过50帧的长轨迹百分比，以及沿轨迹运动的类型（分为定向运动、自由运动或受限运动）。此外，还可以确定扩散系数、平均斑点强度以及每个颗粒上的受体数量。该图显示了在不同刺激条件下，每个斑点的短扩散系数值的分布情况。红线代表中位数值，这张类似的图则显示了在相同刺激条件下，每个斑点在其前20帧中的平均斑点强度。同样，红线代表平均强度值。由于斑点的平均校正强度与该斑点中荧光蛋白的数量相关，因此可直接计算每个颗粒上的受体数量，如此处所示。MATLAB 是一种区分大小写的编程语言。您可以根据本方案中描述的变量名称进行调整，但需确保命名的一致性。函数名称不得更改，且逗号、冒号和分号对于正确语法至关重要。单分子显微技术能够以前所未有的时空分辨率对单个膜蛋白进行可视化观察，并为揭示细胞生物学中未曾预料的新现象提供了独特的机会。该方案为细胞和分子生物学中显微镜视频的定量分析开辟了新的途径。

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多目标追踪是一种自制算法，用于追踪活细胞质膜中单个标记的分子。该算法能够高效地在高密度条件下随时间检测、估算和追踪分子，为研究纳米尺度的膜动力学提供了一种用户友好且全面的工具。...

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本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

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网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。...

通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用

质膜蛋白和脂质的空间分布与时间动态是生物学中的热点问题。本文通过时空图像涨落分析来探讨这一问题，该方法在概念上可提供与单粒子追踪相同的物理量，但使用小分子标记物和常规显微镜装置即可实现。...

从快速荧光成像到商用显微镜下活细胞膜上的分子扩散规律研究

生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

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本方案介绍了利用跨孔无溶剂脂双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运过程。该方法通过制备大量生产的纳米孔阵列芯片，结合高通量数据采集与分析，有望实现膜蛋白效应物筛选的未来应用。...

基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

我们提出一种新技术，通过将液滴单层与平面单层合并，来测量表面活性物质在流体-流体界面的侧向扩散。...

通过液滴融合测量磷脂单分子层二维扩散的荧光恢复实验

本文介绍了一种利用偏振全内反射荧光显微镜（TIRFM），在微流控通道中以单分子灵敏度和约15毫秒时间分辨率检测脂质体与支撑双层膜之间由SNARE介导的单个融合事件的实验方案。该方法可同时检测脂质和可溶性货物的释放，并可测量脂质体尺寸、脂质扩散系数以及融合孔的特性。...

微流控流动池中通过偏振全内反射荧光显微镜监测单个蛋白脂质体与锚定支撑双层膜的SNARE介导融合

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic...

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

我们介绍了一种成像方法，用于测定活细胞质膜中由配体结合诱导的mEGFP标记受体寡聚体的平均寡聚状态。该方案基于全内反射荧光（TIRF）显微镜结合粒子数与亮度（N&amp;B）分析。...

结合全内反射荧光显微镜与数目和亮度分析法研究活细胞中细胞表面受体的寡聚化动态

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

学习使用ImageJ、MATLAB和uTrack进行单分子追踪的图像处理协议，以量化膜受体的扩散系数和簇簇大小。该方法适用于多种颗粒结构，有助于深入理解细胞水平的生物学过程。

用于荧光显微镜分析膜受体扩散与簇大小的图像处理方案

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