Name: 热、压水固化重组蜘蛛丝的材料形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 了解利用热水加压一步法溶解重组蜘蛛丝蛋白的技术，制备水凝胶、纤维等多种材料形态。该方法避免有机溶剂，保留丝蛋白特性，适用于生物材料与蛋白质工程研究。

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作者谨此衷心感谢犹他州科学技术研究（USTAR）计划提供的资助。

1. 从冻干蛋白储备液制备重组蜘蛛丝混合物
<ol>
	<li>确定所需材料成型所需的配方和体积。典型配方范围为 3% (w/v) 至 15% (w/v)。根据此选择，计算适当的 rSSp 浓度和比例。
	<ol>
		<li>使用以下相应配方制备本方案中描述的每种材料：水凝胶/海绵/冰凝胶，6% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2；薄膜/涂层，5% (w/v) 80:20 MaSp1:MaSp2；粘合剂，12% (w/v) 50:50 MaSp1:MaSp2；纤维，12.5% (w/v) 80:20 MaSp1:MaSp2。 
		注意：尽管大多数配方更适合特定形态和材料，但存在广泛可重叠的配方范围。此外，最终的 rSSp 材料也可在成型和加工过程中进行调整，以获得所需的性能。通常，每种蛋白质都需要对其合适的或有用的参数进行研究。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择一个洁净且全新的 8 mL 可高压灭菌的硼硅酸盐玻璃培养瓶，配带橡胶衬垫的螺旋盖。</li>
	<li>取下瓶盖，将空瓶置于分析天平上。去皮归零，使天平显示质量为零。</li>
	<li>向每个空瓶中加入特定材料所需的冻干 rSSp 粉末。
	<ol>
		<li>在配制 2 mL 溶液时，使用以下每种材料对应的特定蛋白质量：水凝胶/海绵/冰凝胶，MaSp1 60 mg 和 MaSp2 60 mg；薄膜/涂层，MaSp1 80 mg 和 MaSp2 20 mg；粘合剂，MaSp1 120 mg 和 MaSp2 120 mg；纤维，MaSp1 200 mg 和 MaSp2 50 mg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向已装有称量好的 rSSp 粉末的瓶中加入所需量的超纯水，至少 2 mL。 
	注意：所有溶解过程均建议最小体积为 2 mL。</li>
	<li>盖紧瓶盖，剧烈涡旋振荡内容物，形成分散且均匀的 rSSp 混合物，即可进入溶解程序。可单独或与涡旋混合联用其他均质化方法，如超声处理或搅拌桨混合。</li>
</ol>
2. 重组蜘蛛丝的溶解
警告：溶解过程会产生高温和高压。操作时必须佩戴适当的个人防护装备，特别是护目镜、长袖衣物和耐热手套。
<ol>
	<li>检查小瓶或容器的瓶盖，确保其已牢固且紧密地拧紧。然后将悬浮的 rSSp 混合物转移至常规微波炉中。 
	注意：建议使用功率范围为 700 至 1,500 瓦、内部腔体容量较小并配有旋转平台的微波炉，以提供更佳的溶剂化条件。</li>
	<li>以全功率进行每次 5 秒的微波处理。每次脉冲后短暂打开炉门，并小心混合或旋转小瓶，以防止沉淀并维持混合物的悬浮状态。</li>
	<li>重复此微波处理过程，直至混合物和/或溶液的温度达到至少 130 °C，该温度需使用红外测温仪直接测量小瓶中含溶液部分的表面获得。重复此过程，直至所有固体颗粒完全溶解且不可见。 
	注意：建议偶尔让小瓶和溶液冷却，特别是当配方中含有高浓度 rSSp 时。温度超过 200 °C 会增加瓶盖密封失效的风险。还需特别注意避免过热的混合物/溶液接触密封部位，否则也会导致小瓶密闭性失效。</li>
	<li>在成功将 rSSp 混合物溶解为溶液后，需待溶液及小瓶盖的温度冷却至 100 °C（沸点）以下，方可打开小瓶。</li>
</ol>
3. 水凝胶
<ol>
	<li>从微波炉中取出溶液后，待其冷却并凝固，制备水凝胶。在水凝胶完全冷却前，将其浇铸成特定几何形状。 
	注意：不同的重组蜘蛛丝蛋白（rSSps）转变为水凝胶所需的时间各不相同。例如，与MaSp1-like序列相比，MaSp2-like序列倾向于更快地形成水凝胶。蛋白质浓度、盐度和pH值也会直接影响转变为水凝胶的速率。</li>
</ol>
4. 海绵
<ol>
	<li>通过将初始溶胀溶液静置形成水凝胶，制备rSSp海绵。</li>
	<li>将水凝胶置于水浴中，再将水浴放入-20 °C冰箱中，直至水浴完全冻结。</li>
	<li>将冻结的水凝胶和水浴从冰箱中取出，在25 °C下解冻，完成海绵的形成过程。随后可将所得海绵从解冻后的水中取出。</li>
</ol>
5. 冷冻凝胶
<ol>
	<li>通过直接冷冻已成型的水凝胶（可选择使用或不使用水浴），制备rSSp干凝胶，并将冷冻后的水凝胶样品转移至冷冻干燥机（冻干机）中。</li>
	<li>从水分升华发生的容器中取出最终的冻干凝胶材料。</li>
</ol>
6. 薄膜与涂层
<ol>
	<li>采用以下三种方法之一：溶液浇铸、溶液喷涂或浸涂，以制备重组蜘蛛丝蛋白（rSSp）的薄膜或涂层。
	<ol>
		<li>将溶解的丝蛋白溶液浇铸至/注入所需形状的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中。</li>
		<li>倾倒并铺展200 µL成膜溶液，待其干燥后从PDMS基底上剥离，用于后续测试或处理。</li>
		<li>干燥后，取下所形成的薄膜进行力学性能测试，或对薄膜进行后处理以改善其力学性能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若需制备无法从基底上剥离的涂层或薄膜，可使用喷涂或浸涂方法形成一层薄的薄膜。
	 
	注意：本方案中，使用Master空气喷笔型号的喷枪进行喷涂已取得良好效果。
	<ol>
		<li>通过将所选基底简单浸入溶解的rSSp溶液中形成浸涂涂层，干燥后重复操作以达到所需厚度。</li>
		<li>在进行浸涂前，先进行一次初步喷涂，以提高最终涂层的均匀性和有效性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 黏合剂
注意：粘合剂的形成可通过以下方法之一实现。
<ol>
	<li>将溶解的rSSp直接添加到基底上，然后在溶液上方覆盖另一基底。将两片基底紧密夹紧，随后在温度不低于25 °C的烘箱中干燥至少16小时。</li>
	<li>或者，将rSSp通过喷雾涂层方式喷涂于两个基底表面，然后将基底夹紧在一起。</li>
	<li>也可采用浸渍法将基底涂覆rSSp，再将基底粘合，以此制备粘合剂。</li>
</ol>
8. 湿法纺丝纤维
<ol>
	<li>通过19 G滑动针头将溶解的纺丝液装入带有鲁尔锁头端的同心注射器中。排出气泡，并让纺丝液停留在注射器的鲁尔锁端。</li>
	<li>将至少25 mm长、内径为0.01英寸的PEEK管插入PEEK管的一体式手紧接头（适用于1/16英寸外径和10/32锥形接口）中。将该接头连接至PEEK管转鲁尔锁母头转换器。
	<ol>
		<li>将已装液的注射器上的19号针头替换为上述组装好的装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用99%纯度的异丙醇填充一个高而透明的玻璃浴槽，作为凝固浴。
	<ol>
		<li>填充位于拉伸导辊下方的拉伸浴槽。第一拉伸浴槽中使用80:20的异丙醇:去离子水混合液，第二拉伸浴槽中使用20:80的异丙醇:去离子水混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置导辊拉伸系统，使凝固浴后的第一个导辊与第一拉伸浴槽中的第一个导辊以相同速度旋转。
	<ol>
		<li>通过调节第一拉伸浴槽中最后一个导辊、中间上部导辊以及第二拉伸浴槽中第一个导辊的速度至相同值来启动第一次拉伸。该速度应为初始纤维牵引速度的2倍。</li>
		<li>通过调节第二拉伸浴槽中最后一个导辊、最后的上部导辊以及卷绕装置的速度至相同值来启动第二次拉伸。该速度应为第一次拉伸所用速度的2倍，或初始纤维牵引速度的4倍。</li>
		<li>在中间导辊外侧戴上腈手套，以防止纤维打滑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始缓慢地将溶液挤入凝固浴中。在自动化系统中，设定挤出速率以匹配10 mm/s的牵引速度。
	<ol>
		<li>在使用细金属钩或镊子将纤维从浴槽中拉出之前，确保纤维挤出过程已趋于均匀。确认从浴槽中引出纤维后，在PEEK管尖端与离开浴槽的纤维路径之间形成了一个环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>引导回收的纤维依次通过各导辊，使纤维在拉伸浴槽中保持浸没状态，而在拉伸浴槽之间的空气中以及卷绕前进行干燥。此干燥过程通过位置较高的中间导辊实现。 
	注：需要根据蛋白质浓度、添加剂种类及蛋白质类型调整纤维牵引速率和/或挤出速率，以确保足够的凝固时间，同时避免纤维在凝固浴底部堆积。</li>
	<li>使用胶带将完全拉伸后的纤维固定在卷绕机构的卷筒上。</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
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<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在纯化重组蜘蛛丝蛋白后，必须将其制备成可用于材料成型的溶液。通过将冻干的蜘蛛丝蛋白与水混合，并对混合物进行微波辐照以产生热量和压力，即可制备出重组蜘蛛丝蛋白（rSSp）溶液。这种简单且高效的rSSp溶解方法可制备多种不同形态的材料。每种材料都必须经过独特地制备和加工，以获得预期的结果和性能。通过轻微调整初始配方、成型条件和/或加工参数，均可利用该方法便捷地调节各类材料的特性。本文所展示的材料形式仅是其中一部分，随着该领域其他研究人员的进一步探索，这一技术将继续推动新型材料形态的发展。
只要溶液主要由水和蛋白质组成（可使用添加剂来延缓凝胶化并提高溶液的稳定性），与基于HFIP的重组蜘蛛丝蛋白溶液相比，其与生物活性成分进行功能化结合的可能性将显著提高。已有多种成分（尽管并非全部）被加入纺丝液中，并制备成相应的材料形式，包括：抗生素、抗真菌剂、肝素、银纳米颗粒以及用于细胞黏附的整合素。除添加剂外，多种不同大小、序列、性质和来源的重组蜘蛛丝蛋白也已成功通过该方法溶解，并用于本方案所述材料的制备。
进一步拓展该溶解方法的适用性，不仅限于...

蜘蛛丝因其出色的强度、弹性和生物相容性组合而引起了材料科学家的广泛关注。传统上，相关研究主要致力于人造纤维的制备。然而，这类研究受到重组蜘蛛丝蛋白（rSSp）在水中不溶的限制，且传统的溶解技术（如变性剂和去垢剂）无法实现其在水相中的有效溶解。此外，目前已开发出的某些rSSp溶解方法并不适用于所有rSSp变体，且通常需要复杂的操作步骤和较长时间，常导致蛋白质损失1,2。因此，目前该领域普遍采用1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）作为溶剂来制备纤维及其他有限形态的材料。其优势在于所有已知的rSSp均能溶于HFIP，从而保证了各研究团队之间数据的一致性。然而，HFIP是一种有毒溶剂，价格昂贵，且由于健康和环境方面的顾虑，难以实现规模化应用。
开发了一种新型的rSSp溶解方法，填补了强有机溶剂HFIP与其他仅对rSSp溶解有效的方法之间的技术空白。该方法将特定的温度和压力条件应用于rSSp与水的悬浮液。结果实现了接近100%的rSSp溶解与回收，并获得了高浓度的蛋白质；由这些配方制备出多种材料形态，而这些形态并非全部可通过HFIP或其他有机溶剂实现3,4,5,6。该方法的目标是高效、简便地将纯化并干燥的重组蜘蛛蛋白溶解于水溶液中，进而用于制备多种材料形态。
利用该方法，可从相同的水性rSSp溶液中轻松制备出纤维、薄膜、涂层、粘合剂、水凝胶、干凝胶、微球以及海绵材料。该方法的持续发展，不仅可应用于更多的rSSp蛋白，还可拓展至其他蛋白质，从而有望催生新型材料形态，并开辟蛋白质纯化与溶解的新途径。

<table><tbody><tr><td>3 mL 带鲁尔锁扣接头的注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td>可使用其他规格的注射器，但为确保接头牢固，建议使用鲁尔锁扣接头</td></tr><tr><td>4 mL 透明培养瓶，带橡胶衬里瓶盖</td><td>Wheaton</td><td>225142</td><td>最小溶液量为 1 mL，最大为 2 mL</td></tr><tr><td>8 mL 透明培养瓶，带橡胶衬里瓶盖</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>最小溶液量为 2 mL，最大为 4 mL</td></tr><tr><td>99% 异丙醇，试剂级 ACS/USP 标准</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>冷冻干燥机</td></tr><tr><td>鲁尔接头，雌性鲁尔接头转 10-32 雌螺纹，材质为聚四氟乙烯-乙烯共聚物（Tefzel, ETFE）</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120 V，60 Hz 交流电；1000 瓦；1.1 立方英尺容量；带玻璃转盘</td></tr><tr><td>一体式手紧 10-32 锥形接头，适用于 1/16&quot; 外径</td><td>IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>聚醚醚酮（PEEK）管，1/16&quot; 外径 × 0.010&quot; 内径</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>喷雾器：Master Airbrush</td><td>Master Airbrush</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

利用热和压力通过水相溶剂化形成重组蜘蛛丝材料

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

许多蜘蛛能产生七种不同类型的丝。其中六种丝在蜘蛛分泌时呈纤维形态，这些纤维不溶于水。为了重现蜘蛛丝卓越的力学性能，必须在异源宿主中进行表达，因为蜘蛛具有领地性和同类相食的习性。人工合成的蜘蛛丝类似物在水溶液中也往往不溶。因此，目前大部分关于重组蜘蛛丝的研究依赖于有机溶剂，而这不利于材料的大规模生产。本课题组的方法通过加热加压，迫使这些重组蜘蛛丝蛋白溶于水中。值得注意的是，当采用该加热加压方法制备这些蛋白质时，可从同一批重组蜘蛛丝蛋白（rSSp）溶液中制备出多种形式的材料，包括：薄膜、纤维、海绵、水凝胶、干凝胶以及粘合剂。本文以直观方式展示了溶剂化rSSp及其材料形态的制备过程，相比仅依靠文字描述的材料与方法部分更易于理解。

通过所述的rSSp溶解方法，可获得多种材料形态，如图1所示。该溶解方法是利用常规微波炉产生的热量和压力作用于rSSp与水的悬浮液。当达到临界温度和压力时，蛋白质即溶解。由此得到的溶解态rSSp溶液，可用于制备七种不同形态的材料：水凝胶、干凝胶、海绵、胶黏剂、涂层、薄膜和纤维。水凝胶通过将溶解态rSSp冷却并使其自然自组装而形成；干凝胶则通过冷冻干燥水凝胶获得；海绵材料是将水凝胶浸没于水中并冷冻成型；薄膜可通过将溶解态rSSp浇铸于PDMS表面（或其他适宜表面）并干燥制得，PDMS表面有助于薄膜在后续处理或分析时易于剥离；涂层和胶黏剂可通过喷涂、浸涂或两者结合的方法制备；纤维的制备过程最为复杂，需将溶液挤出至凝固浴中，随后在纺丝后拉伸浴中连续拉伸初生纤维。虽然仅通过挤入凝固浴也可制得纤维，但纤维最佳的力学性能需通过纺丝后拉伸浴中的拉伸步骤实现3,7,<sup class="xr...

本文介绍了一种制备水溶性重组蜘蛛丝蛋白溶液及其可由此溶液形成的材料形态的实验方案。

许多蜘蛛能产生七种类型的丝。其中六种丝在蜘蛛产出时呈纤维状。这些纤维不溶于水。在……

这种溶解重组蜘蛛丝的方法能够制备出使用传统强有机溶剂无法获得的材料形态。此外，该过程具有可扩展性，可得到简单的水溶性蛋白质溶液。通过采用此方法，所形成或制备的材料能够保持蜘蛛丝蛋白的理想特性。这种用于重组蜘蛛丝蛋白的溶解技术，可实现重组蜘蛛丝蛋白的一步溶解。该方法具有优势，因为这类 notoriously 难以生产的蛋白质不会因复杂的处理过程而损失。此外，由于溶液仅由蛋白质和水组成，因此可根据应用需求添加其他具有生物活性的化合物。特别是蛋白质结构与功能之间的关系，该系统在利用水和高浓度蛋白质形成纤维方面，模拟了蜘蛛制造纤维的方式。通过使用这种溶解方法及后续的材料形成过程，应有可能深入了解所形成的材料及其结构基础。据认为，该技术可用于溶解合成肽，而这些肽通常需要碱性或酸性环境才能溶解。这对这些肽的后续应用可能是有利的。此外，许多已知蛋白质在合成表达时往往存在于不溶性组分中。重新溶解并复性这些蛋白质通常是一个费力的过程，且会导致大量损失。利用该技术，可能提高不溶性蛋白质回收过程的效率。将密封小瓶放入微波炉中存在一定风险，因为可能因过热而导致小瓶过度加压，令人担忧。理解分阶段施加热量和压力的方法至关重要。其次，对于重组蜘蛛丝蛋白而言，盐的存在会阻碍该技术的实施效果，具体影响程度取决于盐的含量。去除盐分至关重要。操作时需保持耐心和谨慎，密切监测样品瓶内的微波时间和温度。这一点至关重要，因为操作过程中涉及多个动态环节，而这些环节往往难以通过传统的书面材料和方法部分进行充分传达。鉴于许多蛋白质存在溶解度问题，从而阻碍了对其开展充分的研究，该方法有望应用于多种蛋白质体系，以改进甚至实现分析技术与表征工作。首先，选择一个洁净且全新的、可高压灭菌的八毫升硼硅酸盐玻璃培养瓶，配带橡胶衬里的螺口盖，并将空瓶置于分析天平上。将空瓶的质量归零，使天平显示为零质量。向空瓶中加入所需量的冻干重组蜘蛛丝蛋白粉末，用于特定材料。然后向瓶中加入至少两毫升的超纯水。密封小瓶盖，剧烈涡旋振荡内容物，以形成分散且均匀的重组蜘蛛丝蛋白混合物。最后检查小瓶盖，确保其已牢固且紧密地拧紧。随后，将悬浮的重组蜘蛛丝蛋白混合物转移至功率范围为700至1500瓦的常规微波炉中。手动开关微波炉，以全功率进行每次5秒的间歇处理。每次间歇后，短暂打开微波炉门，小心混匀反应管，防止沉淀产生，并保持悬浮状态。偶尔让反应管和溶液冷却，避免过热溶液接触密封处。使用红外温度计测量小瓶中溶液部分的温度。重复微波处理过程，直至温度达到至少130摄氏度，并且所有固体颗粒完全溶解。然后，使溶液及小瓶盖的温度冷却至100摄氏度以下。在溶液完全冷却之前，将其从西林瓶倒入特定几何形状的模具中以形成水凝胶。水凝胶形成后，将其放入水浴中，然后转移至零下20摄氏度的冰箱中。等待水浴完全冻结。将冷冻的水凝胶和水浴从冰箱中取出，于25摄氏度下解冻，完成海绵形成过程。然后将所得海绵从解冻后的水中取出。制备冰凝胶时，将冷冻的水凝胶样品转移至冷冻干燥机中。24小时后，将最终的冻干凝胶材料从容器中取出。为制备重组蜘蛛丝蛋白薄膜，将200微升来自小瓶的热溶解重组蜘蛛丝蛋白溶液浇铸到所需形状的PDMS模具上。待其干燥后，从PDMS基底上剥离下来用于测试或处理。为了制备无法从基底上去除的涂层，使用喷笔喷雾器将溶解的重组蜘蛛丝蛋白喷涂到所选基底上，进行初步的喷涂处理。待其干燥后，将已涂覆的基底浸入溶解的重组蜘蛛丝蛋白溶液中，形成浸涂涂层。重复浸涂步骤以达到所需的涂层厚度。制备胶粘剂时，使用移液器将溶解的重组蜘蛛丝蛋白加到基底上，然后在溶液上方覆盖第二块基底。将两块基底紧密夹紧，随后在温度不低于25°C的烘箱中干燥至少16小时。为制备湿法纺丝纤维，使用19号滑动针头，将溶解的纺丝液装入带有鲁尔锁接头的同心注射器中。排出气泡，并使铸膜液停留在注射器鲁尔锁端。将至少25毫米长的PEEK管插入PEEK管的单件式手紧接头中，用于外径1/16英寸和32分之10的组合。将19号针头从注射器的鲁尔锁母接头上取下，换上此装置。然后，将腈纶手套套在中间导丝盘的外侧，以防止生成的纤维打滑，并避免损坏电机。准备一个较高的透明玻璃浴槽，内盛99%纯度的异丙醇，用作凝固浴。在第一道拉伸浴槽中加入体积比为80:20的异丙醇与蒸馏水混合液。在第二道拉伸浴中，配制异丙醇与蒸馏水体积比为20至80的混合溶液。在计算机上设置导丝辊拉伸系统。为调节纤维引出的主速度，根据纤维成形的质量和速度，将导丝辊三辊组A的速度滑动条调整至10至14毫米每秒之间的某一数值。通过将三辊拉伸比装置B的滑动条调至2，启动第一次拉伸，作用于第一拉伸浴中的末级导辊、中间上导辊以及第二拉伸浴中的第一导辊。通过将三辊拉伸比装置C的滑动条调至2，启动第二次拉伸，作用于第二拉伸浴中的末级导辊、最后一个上导辊以及卷绕机。该设置可确保凝固浴后的第一导辊与第一拉伸浴中的第一导辊以相同转速旋转。接下来，将丝素溶液装入定制纺丝装置的注射器中。在自动化系统中，设定挤出速率为10毫米每秒，以将丝素溶液挤入装有异丙醇的玻璃凝固浴中。待纤维挤出过程稳定均匀后，用细金属钩将纤维从凝固浴中拉出。确认将纤维从浴槽中取出后，在PEEK管尖端与纤维离开浴槽的路径之间形成一个环。引导回收的纤维依次通过一系列导丝辊，使纤维在拉伸浴槽中保持浸没状态，而在拉伸浴槽之间的空气中以及卷绕前进行干燥。本方案通过重组蛛丝蛋白的溶解，可制备多种形态的材料。本文展示了七种材料形态：水凝胶、干凝胶、海绵、粘合剂、涂层、薄膜和纤维。其中纤维需要最为复杂的加工过程，需挤出至凝固浴中形成初生纤维，再通过后续的拉伸浴进行连续拉伸处理。鉴于蛋白质和水溶液被加热至相对较高的温度和压力，我们的经验表明，在蛋白质溶解时溶液已处于无菌状态。因此，只要操作得当，本文所介绍的任何材料形态均可用于细胞培养，以研究细胞对这些材料的响应。该技术无疑已促成了新型材料形态的发现，包括粘合剂和海绵状材料。这些材料形态并非一定以纤维形成为导向，尽管纤维形成也是通过该技术发展而得到改进的领域之一。在密闭小瓶内产生热量和压力具有内在危险性。进行这些操作时，务必佩戴个人防护装备。

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科研

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生物工程

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